MISE EN PLACE DE LA SPRI OPTIMISEE EN RESOLUTION POUR L’UTILISATION EN MICROBIOLOGIE

Afin de positionner les biocapteurs SPR parmi les différentes méthodes que nous avons vues dans le chapitre précédent, et de comprendre son intérêt à la vue des critères d’évaluation que nous avons mis en évidence, il est maintenant nécessaire de discuter de la technique sur laquelle s’établit le travail effectué.

Dans cette partie, nous allons donc étudier les bases de la théorie de la SPR afin de comprendre les nuances entre les différents dispositifs reposant sur le phénomène de résonance de plasmons de surface. Cela va nous permettre de justifier les choix effectués dans le montage utilisé qui sera ensuite présenté en seconde moitié du chapitre.

Une explication très détaillée de la théorie de la SPR, qui repose sur les lois de l’électromagnétisme appliquées à une interface entre un métal et un diélectrique, peut être facilement trouvée dans la littérature [118], [119]. Ce paragraphe se propose plutôt de fournir des bases de compréhension du phénomène de résonance des plasmons de surface afin d’introduire les grandeurs qui seront utilisées dans la suite, et d’expliquer les notions qui seront importantes dans les prochains paragraphes pour comprendre les différents choix effectués au cours du projet. La résonnance des plasmons de surface est un phénomène qui se produit à l’interface entre un métal et un milieu diélectrique, tel que l’eau. Il s’agit d’un couplage entre une onde incidente polarisée linéairement avec un champ magnétique orthogonal à la surface (on parle de polarisation transverse-magnétique, TM) et les électrons de conduction du métal.

On considère donc (Figure 2.1, page suivante) une interface infinie entre un métal et un diélectrique selon le plan (0, +, ,). On définit également une onde incidente qui se propage selon +. Les propriétés de l’interface étant invariantes selon + et ,, l’amplitude de l’onde qui se propage à l’interface ne dépend pas de et , et celle-ci peut donc s’exprimer :   (  ,   ,   ,   ) =   (  )exp (      + −    )

où +est le vecteur d’onde incident et   = =>@ ? est la pulsation de l’onde.

Le phénomène de résonance est observé lorsque le vecteur d’onde + du faisceau incident, est égal au vecteur d’onde ABC caractéristique des plasmons de surface. Ce vecteur dépend directement des permittivités EéGHI et JKéIL?GMKNOLdes deux milieux en présence selon l’équation suivante : = ∙   é      ∙      é                  (éq. 2.1)

Dans ces conditions, l’énergie incidente est transmise aux électrons libres du métal au lieu d’être réfléchie, ces électrons oscillent alors de manière collective, et cette excitation se développe le long de l’interface selon la direction de propagation +. Cela induit la création d’une onde évanescente à l’interface des deux milieux : on parle de plasmon propagatif. Cette onde évanescente se crée à l’interface entre le métal et le diélectrique, et son amplitude décroit exponentiellement en s’enfonçant dans le diélectrique sur une longueur caractéristique aébéGMHGKcb (direction d sur la Figure 2.1).

La biodétection plasmonique repose sur l’extrême sensibilité de cette onde évanescente à toute fixation de matériel biologique à la surface de l’or. En effet, les conditions de couplages sur le vecteur d’onde sont fortement dépendantes des permittivités diélectriques du milieu diélectrique (voir éq. 2.1) et donc de l’indice de réfraction. L’adsorption de molécules cibles au niveau de l’interface entraine une modification des propriétés optiques de la solution (c’est-à-dire du milieu diélectrique) au voisinage de la surface, suffisante pour pouvoir perturber le couplage plasmon de façon détectable. On parle ainsi de capteur SPR, car il y a transduction d’un signal chimique (accroche de molécule en surface) en un signal optique mesurable.

Plusieurs grandeurs d’intérêts peuvent être définies pour caractériser le phénomène de résonance de plasmon de surface. L’aspect propagatif du phénomène est quantifié par la distance de propagation du plasmon ( aMcaHeHGKcb), tandis que la pénétration de l’onde évanescente dans le diélectrique est définie par la profondeur de pénétration dans le diélectrique ( aébéGMHGKcb), aussi appelée épaisseur de peau dans la solution. Une profondeur de pénétration de l’onde évanescente dans le métal peut également être définie, mais cette grandeur n’est pas utile dans notre projet. Dans la suite, la notation aébéGMHGKcb fera donc référence à la profondeur de pénétration dans le diélectrique, et toute référence à une épaisseur de peau fera implicitement référence à l’épaisseur de peau de l’onde évanescente dans la solution.
Les deux paramètres d’intérêt, aMcaHeHGKcb et aébéGMHGKcb sont définis en fonction des différentes caractéristiques du métal et du diélectrique selon les deux expressions ci-dessous :   é  é              m  (éq. 2.2)m  (éq. 2.3)

Cesdeux formules montrent que les deux grandeurs sont directement fonction de =_=_ la longueur d’onde d’illumination. Cependant, étant donné que les permittivités des deux milieux dépendent également de la longueur d’onde d’illumination, la relation entre ou aMcaHeHGKcb et la longueur d’onde n’est pas exactement linéaire.

Les Figure 2.2 a et Figure 2.2 b représentent respectivement la variation de la profondeur de pénétration et de la distance de propagation en fonction de la longueur d’illumination, en prenant pour diélectrique l’eau. Les valeurs de permittivité utilisées sont issues de [120] pour l’eau et de [121] pour les données concernant l’or.

Sur la Figure 2.2 b, deux distances de propagations sont représentées, correspondant au cas théorique d’épaisseur de métal semi-infini ( p) et au cas épaisseur finie de 50 nm ( qrbE) qui correspond au cas expérimental. Cette seconde courbe a été tracée en utilisant une modélisation proposée par L. Laplatine [9].

La profondeur de pénétration a des valeurs de l’ordre de quelques centaines de nanomètres, et est multipliée par deux entre une illumination à 625 nm (~100 nm) et une illumination à 825 nm (~200 nm). Cette grandeur a son intérêt, car elle permet d’évaluer jusqu’à quelle distance de l’interface le phénomène plasmon est sensible. Ainsi, s’il y a une modification des propriétés optiques du diélectrique à une distance supérieure à l’épaisseur de peau, le plasmon ne sera pas impacté et la modification ne sera pas détectée ; à l’opposé, si ces variations ont lieu dans une zone située dans cette épaisseur de peau, le plasmon sera modifié et ce changement pourra être détecté.

La distance de propagation est une caractéristique importante également, car elle permet d’évaluer quelle est la taille théorique minimale d’une zone où la résonance plasmon est observable, dans la direction de propagation. En effet, quelle que soit la technique qui sera utilisée pour observer le phénomène de SPR, si le transducteur utilisé est composé d’une surface d’or plane d’une épaisseur d’environ 50 nm, il est d’ores et déjà possible d’affirmer que la résolution dans le sens de propagation sera supérieure ou égale à la distance de propagation. La distance de propagation est toujours plus faible pour une couche mince de métal que pour un milieu semi-infini, et ce d’un facteur proche de 2. Pour le cas réel, avec une source lumineuse qui émet dans le visible et donc en dessous de 800 nm, on pourra donc s’attendre à avoir une résolution de l’ordre de quelques micromètres (entre 5 μm et 10 μm selon la longueur d’onde).

La profondeur de pénétration et la distance de propagation permettent donc de caractériser les plasmons. Ceux-ci n’existent que si l’on parvient à exciter les électrons du métal avec la lumière incidente. Plusieurs manières d’effectuer ce couplage existent.

Comme nous l’avons vu dans le paragraphe précédent, la résonance a lieu si l’on parvient à vérifier les conditions de couplage, c’est-à-dire si l’on parvient à avoir + = =>@ = ABC.

Sur la Figure 2.3.a, page suivante, est représentée en rouge la relation de dispersion ( =   (  )) qui doit être vérifiée pour avoir résonance plasmonique. Ce graphique montre qu’une illumination directe (ligne noire sur la Figure 2.3, définie par l’équation + = t?) ne peut pas donner lieu à un couplage plasmon, car il n’y a jamais intersection entre la courbe de dispersion en illumination directe et la courbe de résonance. Par conséquent des stratégies ont été développées pour réaliser un tel couplage.

Plus précisément, deux solutions sont utilisées : l’excitation à travers le métal via un milieu d’indice élevé (courbe verte), et l’excitation par un réseau de diffraction (courbe bleue).

Le couplage à travers le métal via un milieu d’indice élevé revient à utiliser un milieu d’indice de réfraction plus important que celui du diélectrique sondé comme milieu incident (Figure 2.3.b). Analytiquement, l’utilisation d’un milieu d’indice élevé se traduit par une modification du vecteur d’onde incident qui dépend de l’angle d’incidence ( ) et de l’indice de réfraction du milieu utilisé ( a) selon la relation : + = t? asin (  ). Graphiquement, cela se traduit donc par un abaissement de la courbe =   (  +) qui permet à la courbe d’avoir une intersection avec la courbe de résonance (point entouré en noir sur la Figure 2.3). Cette méthode de couplage est communément appelée configuration de Kretschmann et a été découverte indépendamment par Otto[122] et par Ktretschmann et Raether [123].

L’utilisation d’un réseau de diffraction (Figure 2.3.c) pour le couplage se traduit, si les cavités du réseau sont orientées perpendiculairement à la surface, par une modification du vecteur d’onde selon l’équation : +Ez = + + =>H , où a est le pas du réseau et m est un entier. Ce vecteur incident modifié a les mêmes propriétés dispersives que le vecteur d’onde initial. Graphiquement, cela se traduit donc par une translation de la courbe de dispersion vers des k supérieurs.

Ces deux solutions, couplage par utilisation de milieu d’indice élevé ou par réseau de diffraction, sont utilisées pour réaliser des détecteurs basés sur la SPR, mais la configuration de Kretschmann est de loin la plus utilisée. En effet, si le couplage par réseau de diffraction est parfois choisi pour la facilité de production et le bas cout de la biopuce [124], le couplage par utilisation de milieu d’indice élevé offre une bien meilleure sensibilité [125], est plus flexible dans son utilisation et donc plus propice aux optimisations [126].

Enfin, et surtout, l’utilisation d’un réseau de diffraction est peu adaptée aux techniques d’imagerie. Dans la littérature, seul un exemple de biodétection utilisant explicitement l’imagerie SPR basée sur réseau de diffraction a été trouvé [124]. Dans les autres cas, la SPR sur réseau de diffraction est utilisée pour effectuer des mesures en parallèle sur différents points de mesures discrets sur la surface de la biopuce [11] – [13], on ne peut donc pas véritablement parler d’imagerie.

Dans notre projet, l’objectif est de réaliser un outil d’imagerie adapté à la détection et à l’étude, nous allons donc à partir de maintenant nous focaliser sur le couplage à travers le métal grâce un milieu d’indice élevé. Cependant, il peut être intéressant de noter que les stratégies de détection que nous allons voir pour ce cas particulier sont également utilisées pour les systèmes SPR à réseau.

Nous avons vu précédemment que la lumière incidente doit traverser un milieu d’indice élevé avant d’arriver à l’interface or/diélectrique, et que la mesure effectuée consiste à collecter la lumière réfléchie à l’interface. De manière générale, l’imagerie SPR consiste à faire l’image du plan de l’interface sur le capteur d’une caméra. Cependant, selon les optimisations visées, différentes stratégies ont été mises en place pour répondre au besoin d’utiliser un milieu d’indice élevé pour remplir les conditions de couplage. Nous présentons sur la page suivant en Figure 2.4 les différentes stratégies sous forme de schéma de fonctionnement.

Il existe principalement deux types d’imagerie SPR à milieu incident d’indice élevé : l’imagerie SPR à prisme et l’imagerie SPR à objectif de microscope, que l’on va dès à présent appeler microscopie SPR par souci de simplicité. Dans les imageurs SPR basés sur l’utilisation d’un prisme, nous allons distinguer deux cas particuliers de prismes : les prismes optimisés en champs (OC) et les prismes optimisés en résolution (OR).

Pour les imageries à prisme, les optimisations sont réalisées en prenant comme hypothèse que les solutions sondées ont des caractéristiques proches de celle de l’eau. Les conditions de résonance plasmon sont donc celles de la résonance dans l’eau.

L’imagerie SPR à prisme OC est optimisée pour obtenir une image de l’échantillon la plus homogène possible, en termes de résolution. C’est pour cette raison que le prisme est conçu de sorte que le faisceau en sortie du prisme soit orthogonal au plan image (plan en rouge pointillé sur la Figure 2.4.a), et que la caméra soit elle-même orthogonale à cet axe optique. C’est ce type d’optimisation qui est utilisé dans certains appareils commerciaux tels que l’appareil OpenPlex commercialisé par Horiba Jobin Yvon.

L’imagerie à prisme OR (Figure 2.4.b.) est réalisée pour minimiser les aberrations géométriques. Le prisme est donc conçu pour que le faisceau en sortie soit orthogonal à la face de sortie du prisme. Les faisceaux d’entrée et de sortie du prisme sont ainsi en incidence normale. Cette optimisation implique que la caméra, fixée orthogonale à l’axe optique, n’est pas orthogonale au plan image. Il faut donc déplacer la caméra longitudinalement le long de l’axe optique pour prendre plusieurs images partielles du plan image, puis reconstruire l’image.

La microscopie SPR (Figure 2.4.c) consiste à focaliser le faisceau incident dans le plan focal arrière d’un objectif de microscope à immersion de forte ouverture numérique. Le substrat est ainsi illuminé par un faisceau collimaté d’angle déterminé par la distance à l’axe optique du faisceau incident. On limite ainsi les aberrations optiques et on obtient directement une image du plan sondé avec la caméra.

Les caractéristiques des différentes techniques d’imagerie SPR sont à étudier selon trois critères principaux : la taille du champ d’observation, la présence d’aberrations, et le besoin de post-traitement de reconstruction. Un système SPR idéal combinerait à la fois un grand champ, une haute résolution et de l’imagerie en temps réel.

Le grand champ est possible si le système d’imagerie a un grossissement modéré. Cette information est intuitive : si le grossissement est important, la taille du champ collecté par les pixels est faible. Avec des grossissements inférieurs à 20X, les systèmes d’imagerie à prisme sont considérés comme des systèmes « grand champ ». En revanche, l’utilisation d’objectifs de microscope à grande ouverture numérique (NA> 1,4) oblige à travailler à grand grossissement donc la microscopie SPR a un champ d’une centaine de micromètres seulement.

La haute résolution est possible si le grossissement utilisé est suffisant pour que la résolution ne soit pas limitée par la taille des pixels, et si les aberrations optiques sont limitées, ce qui signifie que l’axe optique du système doit être perpendiculaire aux dioptres. C’est le cas en microscopie SPR grâce à l’utilisation de l’objectif de microscope de fort grossissement pour vérifier les conditions de couplage. C’est également le cas de l’imagerie à prisme OR, car le prisme OR est construit pour avoir un axe optique orthogonal aux dioptres d’entrée et de sortie du faisceau de lumière [9] (Figure 2.5.b), et le grossissement utilisé est au minimum de 10X. En revanche, l’imagerie SPR à prisme OC est optimisée pour obtenir un axe optique de sortie orthogonal au plan image, les rayons de sortie ne sont donc pas orthogonaux à la face du prisme (Figure 2.5.a), et des aberrations optiques sont présentes [9]. De plus, ce type de système est utilisé pour des analyses globales, donc le grossissement ne dépasse pas les 5X.

Enfin, le temps réel est possible si l’image obtenue directement ne nécessite pas de reconstruction. C’est le cas de l’imagerie SPR à prisme OC, car le prisme est optimisé pour avoir un axe optique de sortie orthogonal au plan objet, et ainsi la caméra capture directement le plan image. En revanche, comme le prisme OR est optimisé par rapport aux aberrations, l’axe optique n’est pas orthogonal au plan objet ni au plan image, et donc la caméra ne se situe pas dans le plan image. Elle doit donc balayer ce plan. Les images prises pendant le balayage vont ensuite permettre la reconstruction du plan image. Ce mécanisme est automatisable, et il est possible de remplacer le déplacement mécanique de l’ensemble par un objectif réglable en focalisation. Cependant à l’heure actuelle, la reconstruction se réalise après les expériences.

Ces éclaircissements nous permettent donc de justifier à postériori l’utilisation de « microscopie » SPR en opposition à « imagerie » SPR pour qualifier respectivement l’imagerie SPR à objectif de microscope et l’imagerie SPR à prisme OR qui a un champ plus large. Cette distinction d’appellation sera conservée dans la suite.

Dans le paragraphe 2.1.1 a, nous avons vu que le principe de la détection SPR consiste à mesurer l’effet de l’accroche de cibles à la surface sur la résonance plasmonique. Pour reprendre les termes des biocapteurs évoqués dans la seconde partie du premier chapitre (1.2.3 a), la transduction par SPR consiste à traduire une accroche de molécules en surface par une variation de signal optique. Cette variation de signal optique peut être quantifiée par plusieurs grandeurs que nous allons voir dans ce paragraphe.
Pour un système donné, la résonance plasmonique peut être caractérisée par les conditions en angle et en longueur d’onde ( , ) pour lesquels le couplage plasmon est maximal. En champ lointain, lorsque le couplage est maximal, la quantité de lumière réfléchie est minimale et on mesure ainsi un minimum d’intensité réfléchie. On peut ainsi quantifier la modification de la résonance de trois manières. La première consiste à quantifier le décalage en longueur d’onde de la résonance à angle constant, on parle alors d’interrogation spectrale. La seconde revient à mesurer le décalage angulaire de la résonance à longueur constante, on parle alors d’interrogation angulaire. On peut enfin évaluer la variation de la quantité de lumière réfléchie pour un angle et une longueur d’onde donnés, on parle alors d’interrogation en réflectivité.
L’interrogation spectrale (Figure 2.6.a page suivante) consiste à utiliser une source de longueur d’onde variable pour effectuer un balayage spectral de l’échantillon afin de mesurer le décalage du minimum de réflectivité en réponse à l’accroche en surface d’espèce biologique. Cette méthode de détection offre la meilleure sensibilité à la fois théoriquement [10] et expérimentalement [136]. Cependant, le cout inhérent à l’utilisation d’une source à longueur d’onde variable de type monochromateur (plusieurs dizaines de milliers de dollars à l’achat) limite fortement les applications industrielles de ce type de détection. Il est intéressant de noter cependant que certaines alternatives existent, comme l’utilisation de plusieurs sources monochromatiques peu coûteuses pour effectuer un balayage spectral discret [137].
L’interrogation angulaire (Figure 2.6.b) est plus économique, car elle repose sur le balayage angulaire à longueur d’onde fixe et nécessite simplement l’utilisation de moteurs mécaniques (moins de 500 € pour un actuateur motorisé de laboratoire). Cette technique offre une sensibilité moins élevée que l’interrogation spectrale, mais est tout de même très utilisée pour de la détection à faible concentration [15], [16].
Ces deux techniques sont souvent mises en place pour des mesures où une grande sensibilité aux variations du milieu est nécessaire, mais elles nécessitent un balayage angulaire ou en longueur d’onde pour chaque mesure effectuée, ce qui peut être fastidieux ou peut limiter la fréquence d’acquisition du système.
Une troisième technique est donc aussi très utilisée : l’interrogation en réflectivité (Figure 2.6.c). Travaillant à longueur d’onde et à angle constant, cette technique repose sur la mesure de la variation en réflectivité en réponse à une modification du voisinage de la surface. En se positionnant au point de pente maximale de la courbe de résonance plasmonique (appelé point de fonctionnement), il est possible de maximiser la réponse du système (∆ %) à une modification du milieu. Cette technique est donc la plus pratique à mettre en place, car elle ne nécessite aucun balayage une fois le réglage initial de positionnement effectué. Elle est cependant limitée en sensibilité et est donc plutôt utilisée pour la détection ou l’étude de particules de taille conséquente telles que des cellules ou des bactéries, contrairement aux deux premières techniques qui vont être utilisées pour de la détection de molécules (protéines, ADN, etc.).
Les performances comparées des trois types de détections sont résumées dans le tableau ci-dessous à titre de conclusion de paragraphe.
Cette section nous a donc permis de poser les bases de l’imagerie SPR et de mettre en évidence les nuances entre les différents types de couplage (à réseau ou à indice élevé), les différents types d’interrogation (spectrale, angulaire ou en réflectivité) et d’imagerie (à prisme optimisé en champs, à prisme optimisé en résolution, à objectif de microscope).
Ce cadre théorique général va nous permettre dans la suite de réaliser un état de l’art des différentes utilisations de la SPR(I) dans le domaine de la microbiologie.
L’état de l’art de l’utilisation de la SPR pour des applications en microbiologie peut être divisé en deux catégories, selon que les développements présentés par les auteurs portent plutôt sur des avancées en microbiologie ou plutôt sur une avancée technique. En effet, un système SPR commercial peut être utilisé en routine dans des laboratoires de recherche en microbiologie, ou bien le système SPR peut être ce sur quoi porte la recherche. Le projet développé dans ce manuscrit se situe dans la deuxième catégorie, mais il est intéressant de noter que la très grande majorité des publications qui traitent à la fois de SPR et de microbiologie appartiennent à la première catégorie, précisément car il s’agit d’un test de routine. Par conséquent, même si les travaux qui vont être présentés dans la suite sont plutôt à positionner par rapport aux autres développements techniques concernant la SPR, il semble essentiel d’avoir une vision des utilisations réelles de la SPR en routine en laboratoire de microbiologie afin d’avoir une certaine cohérence quant aux attentes des potentiels utilisateurs futurs. Cette section va donc à la fois porter sur les utilisations de la SPR pour faire des analyses en microbiologie et pour faire de la détection de bactéries.

Historiquement, les systèmes de SPR ont d’abord été développés pour l’étude d’interactions moléculaires. Aujourd’hui encore, les utilisations en laboratoires de systèmes SPR commerciaux tels que BIAcore™ de GE, OpenPlex™ d’HORIBA Scientific, ou bien Spreeta® sont encore très majoritairement utilisés dans cette application. Il est d’ailleurs intéressant de noter que les lettres BIA du premier appareil cité signifient « Biomolecular Interaction Analysis ». La SPR est considérée dans le domaine pharmaceutique comme une référence (« gold standard » [140]) pour les mesures de constantes d’affinité dans le développement de médicaments. Une première partie des applications de la SPR à la microbiologie a donc porté sur l’analyse d’interactions moléculaires entre des molécules issues de bactéries et des espèces chimiques d’intérêt [141]–[143].
Le principe de l’étude d’interaction moléculaire en SPR consiste à immobiliser sur la biopuce d’or une molécule A (Figure 2.7, page suivante) et d’évaluer la variation du signal suite à l’injection d’une molécule B dont on souhaite étudier les affinités avec A.
Ainsi, une des plus vieilles études sur l’utilisation de la SPR pour des recherches en microbiologie publiée en 1994 consiste à analyser l’interaction entre des adhésines issues de bactéries pathogènes et des composants de la matrice extracellulaire des cellules, le collagène et la fibronectine [141] dans le but de comprendre le phénomène d’adhésion de bactéries pathogènes aux cellules hôtes. Ce type d’expérience est la transposition directe des évaluations d’interactions moléculaires dans le domaine spécifique de la microbiologie. Il est donc également basé sur la mesure des constantes d’interaction par l’analyse d’intensité du signal pour évaluer la spécificité. Ce type d’analyse est toujours très utilisé dans le domaine de la microbiologie [142], [143].
Un autre type d’analyse moléculaire tire profit de la sensibilité en surface du phénomène de SPR pour estimer l’effet de composants bactériens sur la cohésion d’un tapis de molécules cibles. On peut citer par exemple les travaux de Tun [144], qui évaluent la conséquence de l’injection de toxines issues de bactéries pathogènes sur certains composants de membranes des cellules cibles. Dans ce cas, la surface du biocapteur est recouverte d’une bicouche lipidique, composant principal des membranes cellulaires, et cette surface est mise en contact avec différentes toxines. La SPR permet dans ce cas de différencier deux phénomènes distincts d’atteinte à la cohésion de la membrane lipidique : la création de pores dans la membrane lipidique correspond à une insertion de molécules dans la membrane, donc à une augmentation de la masse et ainsi à une augmentation du signal SPR, tandis que l’hydrolyse des lipides correspond à une perte de masse et à une baisse du signal SPR.
Ce type d’utilisation de la SPR pour l’étude de bactéries porte principalement sur les molécules membranaires, et une première étape consiste à obtenir les molécules d’intérêt par purification, puis à les immobiliser en surface de la puce pour évaluer leur interaction. L’étape d’obtention des molécules d’intérêt et de leur immobilisation peut être complexe, mais ce type d’étude permet d’avoir des réponses spécialisées sur l’effet des solutions testées sur les réactifs fixés et peut permettre d’identifier les acteurs des phénomènes analysés.

Pour répondre à certaines problématiques, une étude aussi spécialisée que les analyses moléculaires n’est pas nécessaire. Dans ces situations, c’est la réponse de la bactérie dans sa globalité qui est intéressante.
Assez rapidement dans le développement des capteurs SPR, l’intérêt d’analyser des bactéries entières a été mis en évidence. Qu’il s’agisse d’estimer l’accroche de microorganismes à des surfaces spécifiques [145] ou, plus rare, d’évaluer l’effet d’actifs sur des bactéries immobilisées en surface [146], la littérature référence déjà des expériences en 1997.
Dans le cas plus courant d’expériences d’accroche de pathogènes à différentes surfaces spécifiques, la technique de SPR est utilisée pour quantifier une affinité actifs – bactéries et permet ainsi d’estimer la capacité d’adhésion des microorganismes analysés.
Il est ainsi possible à la fois de comparer la capacité d’adhésion de plusieurs souches bactériennes à un même substrat [147], [148], de déterminer quelles mutations d’une même souche vont présenter un comportement différent par rapport à la surface étudiée [145], ou encore de comparer l’adhésion d’une même souche sur différentes surfaces traitées chimiquement [149], [150].
Ces expériences peuvent avoir plusieurs applications. L’objectif peut être d’étudier la formation des biofilms [117] afin de mettre en place des méthodes d’inhibition des biofilms potentiellement néfastes. Dans ce cas, ce n’est plus seulement l’interaction entre bactérie et surface qui est considérée, mais c’est l’influence d’un paramètre d’inhibition sur cette capacité d’interaction qui est traitée.
Les exemples sont ici très applicatifs et variés : évaluation de l’inhibition par différents composés de l’adhésion d’E. coli O157 : H7 à des composants alimentaires1 [151], recherche d’anticorps permettant d’empêcher l’adhésion de Streptococcus mutans et ainsi d’empêcher la formation des caries [152], inhibition de l’adhésion bactérienne par un peptide de synthèse bio-inspiré [153], etc.
Ce type d’analyse s’inscrit dans les méthodes d’études indirectes que nous avons pu voir dans le premier chapitre : il est possible de quantifier l’adhésion bactérienne aux surfaces analysées, mais il n’est pas possible d’observer le comportement individuel des pathogènes et donc l’effet mécanique, par exemple, des modifications effectuées, sur ce comportement.
Un autre objectif dans l’étude d’interactions entre bactéries et molécules peut être de mettre en évidence des interactions spécifiques entre les surfaces sur lesquelles sont déposées des molécules, et le pathogène en question pour un futur dépistage [150]. C’est ce qui peut être fait pour trouver les anticorps qui vont offrir une spécificité optimale avec le type de bactéries considéré. Les anticorps qui sont alors retenus vont pouvoir être utilisés pour effectuer du criblage de bactéries, afin de procéder à la détection des pathogènes pour lesquels leur spécificité a été démontrée.

De la même manière que la SPR permet d’étudier la bactérie entière ou bien ses composants, cette technique permet également de détecter la présence de bactéries en décelant des bactéries intègres ou bien certains de ses composants.
Plus proche de l’utilisation traditionnelle de la SPR, nous allons d’abord nous intéresser à la détection de bactéries par analyse moléculaire.
Le premier type de détection revient à déceler la présence de matériel génétique (de type ADN ou ARN) dans une solution purifiée de bactéries lysées en fonctionnalisant la biopuce avec la séquence complémentaire de l’ADN recherché. On peut par exemple citer la détection d’ARN issu de Legionella pneumophila à des concentrations picomolaires en moins de 3 h [154], ou encore la détection simultanée de Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, et Salmonella typhimurium grâce à leur ARN et l’immobilisation de leur séquence complémentaire [155], ou encore la discrimination des ADN de Staphylococcus aureus et Listeria monocytogenes dans un environnement 10 fois plus concentré en ARN étranger [156].
Dans le cas des bactéries qui doivent leur pathogénicité à la production de toxines, il est pertinent de déceler la présence de la toxine plutôt que la présence de la bactérie elle-même. C’est ce qui peut être effectué pour le dépistage de l’enterotoxine B du staphylocoque [157].
Un dernier type de détection de type « moléculaire » consiste non pas à détecter des composants de la bactérie ou ses sécrétions, mais à détecter la modification d’une solution d’anticorps suite à son contact avec les pathogènes. On parle alors d’inhibition soustractive, et la concentration en anticorps dans la solution qui a été en contact avec les bactéries est inversement proportionnelle à la concentration en microorganismes de la solution initiale [158]–[161].
La détection de bactéries par la mesure d’interaction molécule-molécule peut donc se faire en analysant le matériel génétique, les sécrétions, ou la modification d’une solution par le pathogène en question. Une bactérie ayant sa membrane naturellement tapissée de sites antigéniques, il est tentant d’effectuer la détection des pathogènes directement.

L’utilisation de la SPR pour la détection de cellules entières est donc la suite logique de l’étude de l’interaction entre molécule bactérienne et substrat déterminé : celle-ci a pu permettre la mise en lumière de couples bactéries-substrats spécifiques, et ce substrat va pouvoir être réutilisé pour une reconnaissance ciblée des pathogènes.
Le principe de la détection de bactéries entières par SPRI est donc le même que celui de l’étude de l’interaction bactéries-molécules à la différence près qu’on ne cherche pas ici à quantifier l’interaction, mais juste à déceler ou non un signal d’accroche.
Une expérience standard de test de détection consiste à fixer en surface de la biopuce des anticorps spécifiques du pathogène ciblé, et d’injecter une solution saline non nutritive, telle que du PBS, contenant une concentration connue de la bactérie à tester, et à tester la capacité du système SPR à fournir un signal de détection. L’utilisation d’une solution non nutritive permet de bloquer la croissance bactérienne et donc de déterminer objectivement la limite détectable. Les performances du capteur sont évaluées en injectant différentes concentrations de microorganismes et en mesurant la quantité minimale mesurable en un temps donné, ou le temps nécessaire pour détecter une certaine concentration. Ce type d’expérience a été validé pour de nombreuses souches bactériennes pathogènes, avec plus ou moins de succès en termes de limite détectable : Salmonella enteritidis et Listeria monocytogenes à 106 UFC.mL-1 [162], Legionella pneumophila à une concentration de 105 UCF.mL-1 [163], Vibrio Cholerae à une concentration de 109 UFC.mL-1 [164], E. coli K12 à 103 UFC.mL-1 [165], etc.
Ces expériences de détection modèle ont l’avantage d’être assez reproductibles et faciles à réaliser, car elles sont de surcroit régulièrement effectuées avec des bactéries mortes, ce qui permet de s’astreindre de la plupart des règlementations sanitaires. Mais de nombreuses recherches s’éloignent de ce modèle pour tenter d’améliorer les limites de détection tout en se rapprochant des cas réels de contamination par des pathogènes [166]– [168].
Les travaux d’amélioration de la limite de détection peuvent être regroupés de la même manière que nous l’avons fait dans le premier chapitre, lorsque nous avons discuté des méthodes d’optimisation des biocapteurs (1.2.3 c).
Ainsi, certains travaux portent sur l’amélioration de la sensibilité du transducteur SPR par utilisation de plasmons de surface à longue portée (LRSP pour Long Range Surface Plasmon en anglais) qui permet de sonder plus en profondeur la solution étudiée. Dans la mesure où une bactérie est de l’ordre du micromètre alors que le champ plasmon évanescent classique a une épaisseur de peau de l’ordre de la centaine de nanomètres, l’idée de sonder plus en profondeur la solution semble donc très pertinente pour sonder une portion plus grande des bactéries immobilisées et donc obtenir une variation de signal plus importante. Une étude montre une sensibilité plus importante pour la détection de bactéries avec un montage à LRSP comparé à un montage de SPR classique [169]. Un inconvénient majeur de l’utilisation de LRSP est la perte de résolution, car l’augmentation de l’épaisseur de peau s’accompagne également d’une augmentation de la distance de propagation. L’utilisation de LRSP va donc limiter fortement toute tentative d’amélioration en résolution du système SPR. Par conséquent, lorsque la résolution est à privilégier devant la sensibilité, les LRSP ne sont pas adaptés.
D’autres travaux d’amélioration de la détection portent sur l’optimisation des sondes. Nous ne reviendrons pas sur la littérature très fournie qui porte sur l’optimisation de l’immobilisation des anticorps sur le biocapteur [86], [85], [170], [171] que nous avons évoquée dans l’introduction aux biocapteurs. En revanche, il est important de noter qu’il existe des alternatives aux anticorps, avec des spécificités et des performances comparables. On peut citer en particulier l’utilisation de phages [172]–[174] ou des aptamères [175], [176].
Afin d’agir sur la limitation induite par la diffusion de la détection, différentes stratégies de concentration ont été proposées. Par exemple, la mise en place d’un gradient magnétique peut être utilisée [89], [177]–[179]. Dans ces situations, des nanoparticules magnétiques sont fonctionnalisées avec des anticorps spécifiques et mises en contact avec la solution de bactéries à tester. Les nanoparticules vont se fixer aux microorganismes et être entrainées en surface lors de l’application du champ magnétique. Les bactéries sont ainsi concentrées en surface et décelables directement.
L’utilisation des nanoparticules fonctionnalisées a également un deuxième avantage, celui « d’alourdir » les bactéries cibles et donc d’amplifier le signal détecté. Cette amplification du signal par greffage de molécules supplémentaire sur le pathogène est assez utilisée. L’ajout d’anticorps pour amplifier le signal suite à l’accroche de bactérie, aussi appelée détection « sandwich » (sandwich assay en anglais, car la bactérie est entourée de part et d’autre d’anticorps) a montré son efficacité a de nombreuses reprises pour la détection SPR [180]–[182]. Par contre, du point de vue de la complexité de la méthode, cette stratégie implique l’ajout d’une étape dans le protocole de détection, ce qui complexifie la tâche. L’utilisation de ces lests moléculaires n’est donc pas toujours un choix astucieux.
Enfin, toute application pratique d’un système de détection SPR nécessite la possibilité d’effectuer des mesures en parallèles de la présence de différentes espèces pathologiques, et d’avoir des contrôles négatifs. La technique consiste alors à fonctionnaliser des zones disjointes par différentes molécules sondes (généralement des anticorps), que l’on appelle des plots. Tous ces plots sont en contact avec la solution à tester et l’imagerie SPR permet d’observer simultanément les différentes zones comme cela est représenté Figure 2.8, page suivante, et ainsi de détecter simultanément différentes espèces [183], [184].