Mise en évidence de la déplétion de la spectrine αII par différentes techniques

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L’interaction directe de la spectrine à la membrane : le domaine PH

La spectrine interagit avec la membrane plasmique de façon indirecte grâce à des protéines adaptatrices mais elle peut aussi interagir directement avec les phospholipides de la membrane (Lombardo, C.R.,Weed, S.A. et al. 1994).
L’interaction directe de la spectrine à la membrane est caractérisée par deux domaines MAD1/région1 et MAD2/région3 (Membrane Association Domain) qui sont situés sur la chaîneβ (figure 6 en page 274).
Le domaine MAD1/région1 est placé à l’extrémité NH terminale de la chaîne β intégrant la première unité répétitive β(1) et le domaine MAD2/région3 se trouve dans le domaine PH (Pleckstrin Homology domain) situé à l’extrémité COOH terminale de la chaîneβ (figure 8 en page 279). Ce domaine PH constitué d’environ 100 résidus n’est présent que dans certaines isoformes de chaînesβ : βIΣ2 ; βIIΣ1 ; βIIIΣ1 ; βV.(Macias, M.J.,Musacchio, A. et al. 1994). La spectrine βI présente dans le globule rouge ne contient pas de domaine PH. Ces deux domaines sont capables aussi de lier la protéine kinase C (résultats obtenus dans les plaquettes) et d’autres protéines (protéines G, Synapsine I …) qui jouent un rôle dans la signalisation et l’attachement à la membrane (figure 7 en page 27) (Rebecchi, M.J. et Scarlata, S. 1998).
Chez la Drosophile, une surexpression du domaine PH de la spectrine β ou de l’isoforme entière de la spectrine β avec le domaine PH (β-heavy), provoque une augmentation de la surface de la membrane des cellules de glandes salivaires (Williams, J.A.,MacIver, B. et al. 2004). Chez le poisson Danio rerio, des mutations dans le domaine PH de la spectrine β érythroïde provoquent des défauts d’interaction à la membrane, associés à une sphérocytose (Liao, E.C.,Paw, B.H. et al. 2000). Cette interaction directe de la spectrine β avec la membrane serait impliquée dans la forme de la cellule.

Les domaines EF-hand et la fixation du calcium

L’extrémité COOHterminale de la chaîneα possède deux domaines EF hand (EF-1 et EF-2). Ces domaines sont constitués d’une longue boucle séparant deux hélices α, elles sont associées par paire et fixe le calcium intracellulaire (Wallis, C.J.,Wenegieme, E.F. et al. 1992). La fixation du calcium provoque une modification structurale (Trave, G.,Lacombe, P.J. et al. 1995; Trave, G.,Pastore, A. et al. 1995) (figure 9 en page 30).
Le rôle physiologique des « EF hand domain » de la spectrine n’est pas connu mais les changements de conformation des domaines EF hand engendrés par la fixation du calcium pourrait réguler les interactions se situant à proximité de cette zone, en particulier, la liaison avec l’actine ainsi que l’interaction avec la protéine 4.1 (Fowler, V. et Taylor, D.L. 1980). Cependant cette hypothèse est controversé (Ohanian, V.,Wolfe, L.C. et al. 1984), il s’avère tout de même que ces EF hand ont un rôle essentiel puisque la délétion de l’extrémit de la chaine α éliminant le second domaine EF provoque une létalité chez la drosophile (Lee, J.K.,Coyne, R.S. et al. 1993).

Le domaine SH3

Les chaînes α possèdent dans la boucle BC de l’unité répétitive α9 un domaine SH3 (Src- Homology domain 3) (Wasenius, V.M.,Saraste, M. et al. 1989) (figure 10 en page 31). La chaîne β-H des invertébrés possède également un domaine SH3, les autres chaînesβ en sont dépourvues.
Le domaine SH3 des chaînesαII est extrêmement conservé, avec 100% d’identité entre l’humain, le rat, le poulet, le Xénope. Il existe 74 % d’identité entre le domaine SH3 de la chaîneαI et la chaîneαII, chez l’homme, ce qui fait que sa structure tridimensionnelle est bien conservée entre les deux chaînesα.
Les études cristallographiques et en RMN montrent un domaine avec deux feuillets β qui possèdent trois brins β reliés l’un à l’autre de façon antiparallèle (Musacchio, A.,Noble, M. et al. 1992; Sadqi, M.,Casares, S. et al. 1999). Cette structure forme un sillon hydrophobe bordé de deux boucles RT-Src et N-Src. Le sillon correspond au site d’interaction avec des ligands possédant :
– des séquences riches en proline PXXPXR ou RXPXXP (avec X correspondant à n’importe quels acides aminés).
– une structure PPII (poly proline helix II) qui est une hélice α avec un enroulement à gauche constituée de 3 résidus par tour.
La spécificité des interactions se fait grâce aux deux boucles variables RT-Src et N-Src, car les acides aminés qui constituent la poche hydrophobe sont conservés. Le Kd de cette liaison peut varier de 5 à 100 µM suivant la composition des boucles(Cowburn, D.,Zheng, J. et al. 1995).
Cependant des protéines ne possédant pas de motifs riches en proline interagissent avec ce domaine, elles possèdent plutôt un motif tyrosine (Gorina, S. et Pavletich, N.P. 1996; Romero, F.,Dargemont, C. et al. 1996)
Quelques protéines interagissant avec ce domaine :
– Pour la chaine αI : Abi-I (Ziemnicka-Kotula, D.,Xu, J. et al. 1998).
– Pour la chaîneαII : l’échangeur Na+/H+, NHE2 (Chow, C.W. 1999), Synapsin-I (Onofri, F.,Giovedi, S. et al. 2000), la Tyrosine phosphatase LMW-PTP (Nicolas, G.,Fournier, C.M. et al. 2002) la tyrosine kinase Src (Nedrelow, J.H.,Cianci, C.D. et al. 2003), EVL (Bournier, O.,Kroviarski, Y. et al. 2006), N-WASP (Nicolas, G , thèse de doctorat. 1999) , GAP-43 (Riederer, B.M. et Routtenberg, A. 1999), VASP (Benz, P.M.,Blume, C. et al. 2008).
Figure 10: Représentation du domaine SH3 (image tirée de la revue de Van Bennett et Anthony Baines (2001)).

Le domaine de fixation à la calmoduline

La calmoduline (CaM) est une protéine présente dans toutes les cellules, elle change de conformation lorsqu’elle est liée à un ion calcium.
La spectrine possède deux sites de liaison à la calmoduline, le 1er site, de faible affinité est présent dans toutes les isoformes de chaînesα dans la région 3 (figure 7 en page 27), le deuxième n’est présent que sur la chaîneαII, dans l’insertion de 36 acides aminés, au milieu de l’hélice C de l’unité épétitiver α10. Ce deuxième site est situé dans une boucle appelée boucle CCC (Caspase-Calmoduline-Calpain domain), à proximité des deux sites de coupure de protéases : calpaïnes m et µ et caspases 2 et 3. La calmoduline agit comme une protéine régulatrice sur l’action de ces protéases (négativement pour les caspases, positivement pour les calpaïnes) (Rotter, B.,Kroviarski, Y. et al. 2004).

La boucle de la chaîne αIIΣ1

L’isoforme αIIΣ1 présente une insertion de 20 acides aminés au milieu de l’hélice C de l’unité répétitive 9 α(9) à proximité du domaine SH3. Cette boucle est absente dans l’isoforme αIIΣ2 (figure 11 en page 33). Les taux d’expression de ces deux isoformes varient selon les tissus. Par exemple, dans le cœur ou dans l’aorte, l’isoforme αIIΣ2 est majoritaire (70%) par rapport à αIIΣ1, au contraire, dans le cerveau, les plaquettes ou les lymphocytes, l’isoforme αIIΣ1 est prédominante (plus de 80%), mais pour les tissus épithéliaux, ce ratio est plus proche de 50/50 (Thèse de Gaël Nicolas).
Il a été récemment montré que cette insertion stabil serait les « jonctions gap » via une interaction avec la connexine 43 et pourrait ainsi moduler l’interconnexion entre les cellules (Ursitti, J.A.,Petrich, B.G. et al. 2007).

La boucle CCC (Caspase Calmoduline Calpaïne)

Cette boucle, spécifique de la chaîneα II spectrine, correspond à une insertion de 36 acides aminés dans l’hélice C de l’unité répétitive 10 (α10) (figure 12 en page 34). Cette insertion possède un site de liaison à la calmoduline ainsi que deux sites sensibles à des protéases (Leto, T.L.,Pleasic, S. et al. 1989; Stabach, P.R.,Cianci, C.D. et al. 1997; Wang, K.K.,Posmantur, R. et al. 1998) : l’un pour les calpaïnes m et µ, activées par le calcium et le second pour les caspases 2 et 3, enzymes impliquées dans l’apoptose (figure 13 en page 35).
Le clivage de la spectrine par les calpaïnes et lescaspases dans cette boucle pourrait avoir un rôle important dans le remodelage de la membrane plasmique. Cependant un modèle murin, dépourvu de cette boucle CCC sur la chaîneαII ne présentait pas de phénotypes (Meary, F.,Metral, S. et al. 2007).

Le clivage de la spectrine par des protéases

Le clivage par des calpaïnes

La spectrine est le substrat des calpaïnes µ et m qui sont des protéases ubiquitaires dont l’activité est dépendante du calcium à des concentrations respectives de µM et de mM de calcium (Hu, R.J. et Bennett, V. 1991; Lofvenberg, L. et Backman, L. 1999; Goll, D.E.,Thompson, V.F. et al. 2003).
L’activité des calpaïnes est observée dans beaucoupde processus cellulaires, elles sont impliquées dans les voie de transduction, le remodelage des structures d’adhérence, la migration et la mort cellulaire (Harwood, S.M.,Yaqoob, M.M. et al. 2005).
Les spectrines présentent plusieurs sites reconnus par les calpaïnes:
Dans la chaîneαII, le site majeur de coupure se trouve dans la boucle CCC entre les résidus Tyrosine 1176 et Glycine 1177, la fixation de la calmoduline dépendante du calcium augmente considérablement la coupure de la spectrine αII (figue 13 en page 35). Cette coupure produit deux fragments stables appelés « αII spectrin break-down product ou SBDP» de 145 et 150 kDa (Huh, G.Y.,Glantz, S.B. et al. 2001; Glantz, S.B.,Cianci, C.D. et al. 2007). Ce clivage est aussi régulé par la phosphorylation de la spectrine αII : lorsque la spectrine αII est phosphorylée sur le résidu Tyrosine 1176, la spectrine est moins sensible à l’action des calpaïnes (Nicolas, G.,Fournier, C.M. et al. 2002).
Sur la chaîneβII, un site majeur est présent au niveau de l’extrémité COOH d’autres sites existent dans d’autres isoformes de β (Lofvenberg, L. et Backman, L. 1999) (Backman, L.,Pekrun, A. et al. 1991).
Les clivages produisent une déstabilisation du dimère, des interactions inter-chaînes de spectrine et des interactions entre la spectrine et l’actine, ce qui conduirait à une déstabilisation du squelette membranaire (Harris, A.S. et Morrow, J.S. 1990).
Un clivage de la spectrine sous contrôle (signalisation qui régule l’activité des protéases) (Glantz, S.B.,Cianci, C.D. et al. 2007) a lieu dans des processus cellulaires ayant besoin d’une modification de la membrane de la cellule (forme), comme la division cellulaire, la différenciation, l’endocytose ou l’exocytose ; ou dans des modifications de micro domaines spécialisés comme le processus de la dépolarisation des cellules épithéliales ou celui de la plasticité synaptique. Beaucoup d’arguments sont en faveur d’un rôle physiologique important de ce site de clivage. Cependant un modèle murin, obtenu récemment, possédant une chaîne αII dépourvue de la boucle CCC donc ne pouvant être cli vée par les calpaïnes dans ce site majeur, remet en question le rôle critique de ce site de clivage de la spectrine. Les souris sont viables et fertiles et ne présentent pas de phénotypes détectables dans des conditions d’élevage standard (Meary, F.,Metral, S. et al. 2007).
On peut toutefois penser que le clivage de la spectrine non contrôlé (présentant un défaut dans son système de régulation) pourrait être responsable ou impliqué dans des pathologies graves comme l’ischémie, l’hypoxie, l’épilepsie, les accidents cérébraux, la maladie d’Alzheimer (Veeranna,Kaji, T. et al. 2004), la schizophrénie mais cela reste que des hypothèses. Un modèle murin (klotho) qui possède une activité calpaïne augmentée dans lequel on a observé un clivage de la spectrine important, présente un vieillissement prématuré. Cemodèle peut être un lien entre le taux de spectrine clivée et le vieillissement physiologique anormal (Manya, H.,Inomata, M. et al. 2002) mais il faut savoir que la spectrine n’est pas la seule protéine qui soit clivée par des calpaïnes, d’autres protéines comme des protéines de structure, de signalisation, de membrane, des enzymes, des protéines des points focaux (paxilline, taline, vinculine) sont elles aussi la cible des calpaïnes.

Le clivage par la caspase3

Il a été montré que lors de stimuli déclenchant l’apoptose (Martin, S.J.,O’Brien, G.A. et al. 1995; Vanags, D.M.,Porn-Ares, M.I. et al. 1996; Janicke, R.U.,Ng, P. et al. 1998), la spectrine était clivée par la caspase 3 ou CPP32. Il existe deux sites de coupures sur la chaîneαII et trois sur la chaîneβ.
Le site principal sur la chaîneαII se trouve dans la boucle CCC entre les résidus Acide Aspartique 1185 et Serine 1186, c’est à dire à neuf résidus du site de coupure par les calpaïnes (Y1176) et à proximité du site defixation de la calmoduline. Ce site est aussi utilisé par la caspase 2 (Rotter, B.,Kroviarski, Y. et al. 2004). Cette coupure à ce site génère des fragments de 150 kDa, c’est à dire un fragment de même taille que celui produit par la calpaïne (SBDPs). Un second site de coupure sur la chaîne αII est localisé entre l’acide aspartique 1478 et la sérine 1479 dans l’unité répétitive α13, il est spécifique de la caspase 3 et génère un fragment de 120 KDa (figue 13 page 26).
La chaîneβII présente un site principal localisé entre l’acide aspartique 1457 et la sérine 1458 à proximité du site de clivage de la calpaïne, les autres sites sont localisés entre l’Acide Aspartique 1254 – Acide Aspartique 1255 et Acide Aspartique 2146 – Thréonine 2147.
La spectrine clivée n’est plus capable d’interagir avec l’actine, cette perte d’interaction pourrait provoquer une déstabilisation du cytosquelette (comme pour le clivage par les calpaïnes) et modifierait la membrane plasmique avec l’apparition de bourgeonnements.
Cette protéolyse intervient très précocement lors de l’apoptose sur les deux chaînes de spectrine mais de façon séquentielle, tout d’abord la chaîneα puis la chaîneβ (Greidinger, E.L.,Miller, D.K. et al. 1996). Il a été montré qu’elle intervenait bien avant les protéolyses d’autres substrats spécifiques à l’apoptose tel que la polymérase poly-ADP-ribose (PARP), la ribonucléoproteine U1 ou la sous-unité catalytique de la protéine kinase dépendante de l’ADN.

Le clivage pathologique de la spectrine

Une augmentation de la protéolyse de la spectrine par les protéases est observée dans certaines pathologies:
-La toxine Pet sécrétée par une entérobactérie clive la chaîneαII spectrine (au niveau de la boucle CCC entre les résidus Méthionine 1198 et Valine 1199) des cellules intestinales et provoque un remodelage de l‘actine. L’infection par cette entérobactérie provoque une exfoliation cellulaire de l’épithélium intestinal associée à de sévères diarrhées (Villaseca, J.M.,Navarro-Garcia, F. et al. 2000 ; Canizalez-Roman, A. et Navarro-Garcia, F. 2003; Sui, B.Q.,Dutta, P.R. et al. 2003; Navarro-Garcia, F.,Canizalez-Roman, A. et al. 2004).
-La présence de fragments protéolytiques pourrait être impliquée dans des maladies auto-immunes : le Syndrome Sjogren’s ou le lupus érythémateux systémique. Les patients atteints de ces maladies développent des auto-anticorps dirigés contre différents fragments résultant de laprotéolyse de la spectrine αII et de façon plus rare contre les différents fragments de la spectrine βIΣ1. Ces patients atteints de ces pathologies présentent une baisse de sécrétion des glandes lacrymales et salivaires.

La phosphorylation

La chaîneβ du globule rouge est phosphorylée in situ et in vitro par des kinases dépendentes ou indépendantes de l’AMP cyclique, localisées à la membrane ou dans le cytoplasme (Hosey, M.M. et Tao, M. 1976; Fairbanks, G.,Avruch, J. et al. 1978; Fowler, V.M. et Adam, E.J. 1992). Six phosphates peuvent être intégrés sur les serines/ thréonines au niveau du COOH terminal de la chaîne βI (Pedroni, S.,Lecomte, M.C. et al. 1993). Le rôle exact de cette phosphorylation n’est pas clairement défini. La phosphorylation de la spectrine par une caséine kinase de type I diminue la stabilité de la membrane mais cette phosphorylation n’affecte pas la formation du tétramère de spectrine ni la liaison à actine ou à l’ankyrine (Manno, S.,Takakuwa, Y. et al. 1995).
Les chaînesαII et βII sont phosphorylées in vivo (Goodman, S.R. et Zagon, I.S. 1984; Nixon, R.A. 1986). Un site de phosphorylation, a été identifié sur la tyrosine 1176 : il est le substrat de la kinase Src (Nedrelow, J.H.,Cianci, C.D. et al. 2003) et de la phosphatase LMW-PTP (Nicolas, G.,Fournier, C.M. et al. 2002). Ce site correspond au site de clivage de la calpaïne.La phosphorylation de ce résidu Tyr module négativement le clivage de la spectrine par les calpaïnes (Nicolas, G.,Fournier, C.M. et al. 2002).
Au cours de la division cellulaire, la spectrine non érythroïde est redistribuée dans le cytoplasme et cette redistribution est accompagnée d’une phosphorylation de la spectrine βII (Fowler, V.M. et Adam, E.J. 1992). La phosphorylation à l’extrémité COOH de la chaîneβII régulerait la formation du dimère de spectrine (Bignone, P.A.,King, M.D. et al. 2007). Pour la chaîneβIII, sa phosphorylation modulerait sa stabilité à la membrane de l’appareil de Golgi (Siddhanta, A.,Radulescu, A. et al. 2003).

Les fonctions de la spectrine

Les fonctions du squelette membranaire

Le squelette membranaire dépendant de la spectrine est présent dans tous les compartiments cellulaires, il interagit avec beaucoup de protéines cytosoliques et membranaires. Il pourrait être impliqué dans de nom breuses fonctions physiologiques potentielles.
-Dans le globule rouge, sa fonction principale est de stabiliser et de maintenir la membrane érythrocytaire. Ce squelette membranaire lui confère sa forme et une certaine rigidité afin qu’il résiste aux forces de cisaillement mais tout en lui laissant la possibilité de se déformer pour passer dans la microcirculation.
-Dans les autres types cellulaires, les fonctions du squelette membranaire qui présente une plus grande complexité dans sa composition, sont encore peu connues.
L’obtention de modèles animaux dépourvus de spectrine ainsi que les outils de biologie cellulaire ont permis de proposer quelques fonctions quant aux rôles des spectrines : renforcement et organisation de la membrane, partitionnement de domaines cellulaires en micro-domaines, maintien des liaisons des jonctions cellule-cellule ou cellule-matrice extracellulaire, établissement de la polarité cellulaire, migration cellulaire, régulation de l’exocytose, trafic intracellulaire…

Les modèles animaux déplétés en spectrine: effet sur la viabilité et le développement

Le nématode C.elegans ou la drosophile D.melanogaster constituent des modèles simples et complets pour l’étude des fonctions de la spectrine dans un contexte animal.

La drosophile : D. melanogaster

Chez la drosophile, la spectrine est présente sous forme d’une chaîneα et de deux chaines β (β/β-G et β-H).(Adams, M.D.,Celniker, S.E. et al. 2000). Dans les cellules épithéliales, la chaine β-G a une localisation basolatérale tandis que la chaine β-H est apicale (Thomas, G.H. et Kiehart, D.P. 1994).
-Pour la chaîneβ-H :
L’absence de spectrine β-H conduit à une létalité importante des larves, les quelques survivants montrent les phénotypes suivants : des yeux rugueux caractéristiques de l’absence d’un photorécepteur (R7) dans la rétine, des défauts au niveau des ailes ou de la trachée. Ces phénotypes sont dus pour la plupart à une réduction des interactions entre les cellules (Thomas, G.H.,Zarnescu, D.C. et al. 1998). Dans les ovocytes, l’absence de la spectrine β-H provoque une rupture des liaisons entre les cellules, ce qui entraîne des défauts de polarisation et une déstabilisation du pôle apical (Zarnescu, D.C. et Thomas, G.H. 1999).
-Pour les chaînesβ-G et α:
L’absence de chaînesβ (β-G) ou de chaîne α provoque des phénotypes létaux importants : Seulement 50% des embryons n’exprimant pas la spectrine α atteignent l’étape de larve et meurent dans les premières étapes du développement de la larve. L’absence de la spectrine α modifie la forme des cellules, altère les interactions entre les cellules et l’organisation tissulaire (défaut de polarisation des follicules ovariens, interruptions de l’axes antéro-postérieur de l’oocyte). D’après ces données, deux hypothèses ont été émises par Lee et ses collaborateurs (Lee, J.K.,Brandin, E. et al. 1997) sur le rôle de la spectrine α: la première serait un rôle structural stabilisant la forme de la cellule et/ou l’interaction des cellules entre elles, tandis que la seconde serait un rôle d’échafaudage stable afin de positionner des mécanismes de signalisation (Lee, J.K.,Coyne, R.S. et al. 1993; Lee, J.K.,Brandin, E. et al. 1997). En ce qui concerne la chaîneβ, le taux de survivants est encore plus réduit, moins de 10 % des animaux mutants sont capables d’atteindre le stade de larve. Donc ces deux gènes possèdent des fonctions essentielles.
Chez les animaux présentant des déficits en chaîneβ -G, la morphologie de l’intestin moyen est modifiée, il présente un défaut des sécrétions acides. Dans les cellules épithéliales, l’accumulation de la pompe Na+/K+/ATPase à la membrane basolatérale est perturbée. Cette anomalie n’est pas observée chez les drosophiles ayant un défaut de la chaîneα , (Lee, J.K.,Coyne, R.S. et al. 1993; Zarnescu, D.C. et Thomas, G.H. 1999; Dubreuil, R.R.,Wang, P. et al. 2000), cela suggère que la spectrine β peut avoir des fonctions indépendantes de la spectrine α.
De plus, deux mutations, l’une identifiée sur la chaîneα « klotzchen » et l’autre sur β « karussell », montrent que ces chaînes jouent un rôle important durant le développement neuronal et dans l’organisation et la stabilité de la synapse (Featherstone, D.E.,Davis, W.S. et al. 2001; Pielage, J.,Fetter, R.D. et al. 2005; Garbe, D.S.,Das, A. et al. 2007; Hulsmeier, J.,Pielage, J. et al. 2007).

Le nématode : C. elegans

L’organisation de la spectrine chez le nématode est semblable à celle de la drosophile (Bennett, V. et Baines, A.J. 2001).
-Pour la chaîneβ-H :
Des mutations de son gène sma-1 diminuant son expression, ont été identifiées chez des animaux viables et fertiles mais présentant une taille beaucoup plus petite que la normale (Morck, C. et Pilon, M. 2006). Cette élongation anormale de l’embryon sont les conséquences de problèmes structuraux (forme des cellules) dans les tissus épithéliaux comme les cellules de l’épiderme, du pharynx ainsi que des cellules excréteuses (McKeown, C.,Praitis, V. et al. 1998). La chaîneβ-H est indispensable à la morphogénèse correcte de l’embryon.
-Pour la chaîneβ-G :
La chaîne β (β-G) est présente au stade deux cellules de l’embryogénèse et localisée aux sites de contact cellule-cellule. Chez l’adulte, elle est exprimée dans les tissus épithéliaux au pôle basolatéral mais aussi de façon importante dans les neurones (dans l’axone et le corps cellulaire) et dans les cellules du muscle strié (aux sites de contactsavec la matrice extracellulaire).
Certaines mutations sur le gène unc-70 sont létales mais quelques individus survivent et peuvent proliférer malgré la perte d’expression de la spectrine β-G sauvage. Ces individus mutants, possédant une spectrine β-G tronquée voir complètement absente ont un ralentissement de leur développement larvaire et une paralysie chez l’adulte; l’absence de la chaîne β entière provoque durant leur développement des cassures des axones avec une perte de motilité et un manque de coordination. Ces observations montrent que la spectrine β joue un rôle important dans la structure physique du neurone ainsi que dans les processus neuronaux (Hammarlund, M.,Davis, W.S. et al. 2000; Hammarlund, M.,Jorgensen, E.M. et al. 2007). Des anomalies ont été observées aussi dans el muscle ; le défaut de la chaîneβ provoque une désorganisation des myofilaments et une réduction ou la perte du réticulum sarcoplasmique.
Les mêmes résultats ont été observés avec des SiARN dirigés contre cette chaîneβ. La baisse de l’expression de la protéine est couplée à des défauts dans la musculature et au niveau du système nerveux du nématode (Moorthy, S.,Chen, L. et al. 2000).
Mais curieusement, la spectrine β ne joue pas de rôle dans l’établissement de la polarité et de la structure des cellules de l’épiderme et de l’intestin, de plus aucun défaut de sécrétion n’est relevé dans l’intestin chez le nématode par rapport aux données observées chez la drosophile.
-Pour la chaîneα :
Durant l’embryogénèse la spectrine α est déjà présente au stade d’une cellule, sa localisation à la membrane cellulaire semble être d épendante seulement de la spectrine β (pas de la spectrine β-H).
Des analyses sur des mutants du gène spc-1 codant pour la chaîneα de C.elegans indiquent que la chaîneβ a besoin de la spectrine α pour être recrutée de façon stable à la membrane.
Quand la chaîne α n’est pas exprimée, les animaux présentent les phénotypes spécifiques aux défauts d’expression de la chaîneβ et de la chaîneβ-H (Moorthy, S.,Chen, L. et al. 2000; Norman, K.R. et Moerman, D.G. 2002). Les phénotypes observés sur ces mutants de la chaîneα sont un défaut d’élongation de l’embryon avec une désorganisation du cytosquelette d’actine apical, nécessaire a une bonne élongation (phénotypes observés pour des organismesprésentant des défauts de la spectrine β-H), une mort après l’étape de segmentation de l’embryon, des défauts dans l’organisation du pôle apical, des défauts de différentiation des cellules du muscle (phénotypes retrouvés dans des organismes présentant des défauts de la chaîneβ).

Chez les mammifères : l’homme, la souris…

Plusieurs rôles ont été potentiellement donnés à laspectrine :
– Maintien de la forme et de l’intégrité membranaire des érythrocytes (Lux, S.E. et John, K.M. 1977).
– Recrutement et stabilité des protéines dans des domaines spécialisés des membranes cellulaires (De Matteis, M.A. et Morrow, J.S. 2000).
– Etablissement et maintien de la polarisation cellulaire (Pinder, J.C. et Baines, A.J. 2000).
– Transport intracellulaire (Holleran, E.A.,Ligon, L.A. et al. 2001).

La spectrine et la stabilité membranaire

Dans le globule rouge, le squelette membranaire dépendant de la spectrine constitué exclusivement de chaînes αI et βI donne à l’érythrocyte sa forme biconcave. Son rôle structural dans la membrane est très important et confère au globule rouge :
– une résistance aux forces de cisaillement de la circulation sanguine.
– une flexibilité membranaire lui permettant de se déformer et de passer les petits vaisseaux sanguins.
Les mutations sur les chaînes de spectrine érythroïde sont associées à des anomalies de forme des globules rouges et une fragilité de leur membrane, conduisant à des anémies hémolytiques héréditaires,comme la sphérocytose et l’elliptocytose héréditaires.

La Spectrine et l’organisation de la membrane

Le squelette membranaire dépendant de la spectrine participe à l’organisation de la membrane cellulaire en réduisant le mouvement latéral et la diffusion de protéines membranaires. Une étude sur des souris sph/sph, déficientes en spectrine α érythroïde, montre que le marquage des glycoprotéines de la membrane du globule rouge se fait très rapidement, et il est plus concentré par rapport à des cellules érythroleucémiques, ce qui pourrait faire penser que la spectrine α joue un rôle important dans l’organisation structurale de al membrane en limitant la diffusion latérale des protéines de la membrane dans des cellules autres que l’érythrocyte mature (Dahl, S.C.,Geib, R.W. et al. 1994). Les concepts présentés par M.A De Matteis et J.S Morrow dans leur revue de 2000 sont dans sont dans la lignée des observations faites en 1994 par S.C Dahl.
Ce concept d’organisation des protéines membranaires par le squelette membranaire stabilise cette membrane (abaisse l’énergie du système) (figure 14 ci-dessus).
Les protéines peuvent spontanément déformer la bicouche lipidique vers un état de plus faible énergie et former des vésicules en absence de squelette membranaire ou constituer des micro-domaines grâce à des squelette s membranaires différents. On peut observer dans ce concept, que la forme de la membrane obtenue par l’organisation des protéines membranaire (protéine rouge dans la figure 14 ci-dessus) sans la présence de squelette peut être tot alement inverse à celle des mêmes protéines interagissent avec un squelette mem branaire.
L‘état du système en énergie peut être abaissé lorsque le squelette membranaire est homogène. Ce concept expliquerait le rôle du squelette membranaire dans la forme de la cellule ainsi que dans la déformabilité de la membrane via la distribution des protéines membranaires.
D’autres concepts expliquent le rôle que pourrait ouerj la spectrine dans la diffusion de protéines de membrane qui interagissent ou n’interagissent pas avec le squelette membranaire dépendant de la spectrine membranaire dans la diffusion des protéines de membrane. A : le modèle de lien « tether » avec la spectrine. B: le modèle de clôture sous membranaire (image tirée de l’article de Sako et Kusumi de 1995 (Sako, Y. et Kusumi, A. 1995)).
Sako et Kusumi en 1995 proposent un modèle de squelette membranaire jouant le rôle de clôture sous membranaire, ceci limitant la diffusion latérale de protéines non associées à la spectrine (figure 15 b ci-dessus) et le modèle de lien « tether » pour les protéines liées a la spectrine (figure 15 a en page 147). En suivant le chemin de diffusion des protéines de membrane, ils ont observé que la diffusion de la bande 3 (non associée à la spectrine) dans le globule rouge est limitée à une aire de 110 nm, cela corrèle avec le maillage créé par le réseau despectrine. Occasionnellement la protéine part de cette aire pour aller dans l’aire adjacente comme le montre la figure 15 b, ceci est observé en moyenne toute les 350 ms. D’autres protéines bandes 3 ont des mouvements oscillatoires similaires à ceux de la spectrine, cela suggère qu’elles sont accrochées au réseau de spectrine. L’effet « clôture » du squelette membranaire dépendant de la spectrine est aussi impliqué dans la sélection de protéines membranaires durant la formation de vésicules de recyclage, un important mécanisme pour l’homéostasie sanguine. Des effets similaires ont été observés dans des cellules non érythroïdes (Sako, Y.,Nagafuchi, A. et al. 1998) avec l’étude du mouvement de l’E-cadhérine (protéine qui interagit avec le squelette membranaire dépendant de la spectrine). Les protéines mutantes E-cadhérines délétées d’une partie du domaine cytoplasmique et ne pouvant plus interagir avec le squelette membranaire, possèdent une grande moyenne de diffusion comparée à celle observée aux E-cadhérine normales. Ces concepts peuvent expliquer les mouvements des protéines membranaires mais il faut tenir compte également que le réseau de spectrine est lui aussi déformable (figure 16 ci-dessous).
Figure 16 : Le modèle de mosaïque montre l’aspect dynamique de la spectrine sur les protéines membranaires. Le rôle du squelette de spectrine est d’organiser la bicouche lipidique et de contrôler la diffusion des protéines membranaires. Ce modèle souligne la flexibilité du réseau de spectrine. (Image tirée de l’article de M.A De Matteis, Jon .S Morrow (2000)).
De Matteis et Morrow décrivent le squelette membranaire dépendant de la spectrine comme un réseau dynamique contrôlant les mouvements des protéines membranaires, cytosoliques, ainsi que certains phospholipides liés à la spectrine. Il limite la déformabilité de la membrane et la diffusion latéral des protéines membranaires, et contrôle leur espacement dans des variations de longueur du tétramère de spectrine (figure 16 ci-dessus).
La spectrine lie un certain nombre de protéines de façon directe ou indirectement: le monomère β de la spectrine interagit avec des types de protéines très variés et différents du monomère α. Ces protéines liées à la spectrine ont des rôlesdans les processus cellulaires comme la polarisation, l’adhérence, la migration, la prolifération, la signalisation ….
Les interactions avec ces protéines peuvent donc conférer des rôles potentielles multiples à la spectrine sachant que si les interactions entre ces protéines sont bien connues et établies, les fonctions multiples de la spectrine, elles, restent encore a être déterminées dans la plupart de ces processus cellulaires.

La spectrine et le remodelage de la membrane

Le remodelage du squelette membranaire dépendant de la spectrine par clivage dans la boucle CCC de la spectrine par des protéases constitue un point supplémentaire dans la dynamique de ce squelette membranaire. Des processus comme l’exocytose, l’endocytose, la migration font appel à des modifications de la membrane et des structures sous-jacentes donc au remodelage du réseau de spectrine.
Il apparaît que le clivage de la spectrine non érythroïde par des calpaïnes (chaineα et β) affecte la tétramérisation des dimères de spectrine et entraîne une dissociation des complexes d’actine (Harris, A.S. et Morrow, J.S. 1990). De plus l’association entre la spectrine et la membrane est diminuée après clivage de la spectrine β (Hu, R.J. et Bennett, V. 1991). Le clivage de la chaîneα se produit lors de la stimulation du récepteur NMDA mais ne conduit pas à la mort cellulaire (Di Stasi, A.M.,Gallo, V. et al. 1991), il serait plutôt un processus physiologique associé à la plasticité du squelette membranaire.
Le clivage anormal de la spectrine non érythroïde ourraitp s’avérer pathologique (Di Stasi, A.M.,Gallo, V. et al. 1991; Seubert, P.,Peterson, C. et al. 1990). Dans des maladies auto-immunes, comme le lupus érythémeux ou le syndrome de Gougerot Sjogren (Watanabe, T.,Tsuchida, T. et al. 1999; Hayashi, Y.,Yayagi, K. et al. 2000), les patients développent des anticorps dirigés contre les parties clivées de la spectrine. Ces patients présentent un tarissement des secrétions exocrines spécialement lacrymale et salivaire, avec des rhumatismes inflammatoires chroniques.
D’autres études montrent une possible implication de la dégradation de la spectrine dans le développement de la maladie d’Alzheimer (Fernandez-Shaw, C.,Marina, A. et al. 1997). La dégradation de la spectrine non érythroïde pourrait être également impliquée dans l’ischémie (Doctor, R.B.,Bennett, V. et al. 1993). La protéolyse de la spectrine pourrait contribuer au changement morphologique des cellules accompagnant l’hypoxie des cellules neuronales et épithéliales et la dégénérescence des neurones (Seubert, P.,Peterson, C. et al. 1990).
Cependant, malgré les nombreux travaux suggérant un rôle important du clivage de la spectrine dans des processus impliqués dans de nombreux phénomènes cellulaires, notre étude très récente sur des souri transgéniques exprimant une chaîne de spectrine α délétée de son site hypersensible aux protéases cette( délétion de la boucle CCC de la spectrine αII) montre que ces souris sont viables, en excellente santé ; elles ne possèdent aucuns phénotypes dans des conditions standards d‘élevage (Meary, F.,Metral, S .et al. 2007).

La spectrine et l’adhérence cellulaire

La spectrine pourrait être impliquée dans différentes structures d’adhérence de type cellule-cellule comme les jonctions serrées, les jonctions adhérentes et les ‘jonctions gap ’ ou dans les contacts cellule-matrice extracellulaire.

Les interactions cellule-cellule

Les jonctions adhérentes : Les cadhérines sont les protéines majoritaires dans les jonctions adhérentes, elles sont les premières recrutées dans ces structures avant le recrutement d’autres protéines comme la β-caténine, l’α-caténine, la spectrine, l’adducine, l’actine et la protéine 4.1. La spectrine βII via son extrémité N terminale interagit avec l’α-caténine (Tepass, U. 2002) et facilite l’assemblage de la spectrine à la membrane (Pradhan, D.,Lombardo, C.R. et al. 2001). Par ailleurs, il a été montré que la spectrine βII joue un rôle dans la biogénèse de la membrane latérale (Kizhatil, K.,Yoon, W. et al. 2007).
Les jonctions serrées : elles définissent une barrière entre la membrane apicale et la membrane basale. Elles sont présentes dans certains épithéliums (épithéliums étanches) et dans l’endothélium cérébral. Ces structures sont des complexes multiprotéiques qui contiennent entre autres, la protéine ZO1 qui lie la spectrine, (Bennett, V. 1990) (Beck, K.A. et Nelson, W.J. 1996; Tsukamoto, T. et Nigam, S.K. 1997), la protéine ZO2 qui est en interaction avec la protéine 4.1R (Mattagajasingh, S.N.,Huang, S.C. et al. 2000). Les interactions entre les protéines des jonctions serrées et les protéines du cytosquelette comme la spectrine ou la protéine 4.1R constituent des processus dynamiques (lien avec le cytosquelette d’actine) impliquées aussi dans la morphologie des cellules épithéliales (Bennett, V. 1990; Beck, K.A. et Nelson, W.J. 1996).
Les jonctions gap : la protéine constitutive des ‘jonctions gap ’ est al connexine. Dans le muscle cardiaque, cette protéine interagit avec la spectrine αII par l’insertion de 20 résidus localisé dans l’unité répétitive α9 à proximité du domaine SH3 (isoforme de αII Σ1). La spectrine stabilise la connexine 43 dans les jonctions gap et pourrait intervenir dans la signalisation cellulaire en modulant les interconnexions entre les cellules (Ursitti, J.A.,Petrich, B.G. et al. 2007).
La spectrine interagit (directement ou indirectement via l’ankyrine) avec des molécules d’adhérence et pourrait jouer un rôle dans l’adhérence. La spectrine βI, par les unités répétitivesβ2 et β3, lie les isoformes 140 et 180 de N-CAM (neural cell adhesion molecule). Ces protéines sont impliquées dans les contacts cellule-cellule. L’interaction de la spectrine avec ces protéines est importante pour l’élongation des neurites (Pollerberg, G.E.,Burridge, K. et al. 1987; Leshchyns’ka, I.,Sytnyk, V. et al. 2003).
D’autres protéines s’associent indirectement à la spectrine via l’ankyrine, comme les protéines de la famille des L1CAM : L1CAM, Neurofascine, NgCAM, NrCAM et Neurogliane (Davis, J.Q. et Bennett, V. 1994 ; Davis, J.Q.,Lambert, S. et al. 1996). Ces protéines exprimées dans le système nerveux, et, comme les N-CAM, sont impliquées dans les contacts cellule-cellule. Elles jouent des rôles importants dans le développement du système nerveux, et des mutations dans ces protéines sont responsables de pathologies comme le syndrome L1 causé par des mutations dans le gène de L1CAM avec comme manifestations cliniques l’hydrocéphalie, le retard mental, une tonicité augmentée des muscles des jambes (spasticité).

Les interactions cellule matrice extra-cellulaire

Le squelette membranaire dépendant de la spectrine interagit directement avec des protéines dont la fonction est d’adhérée à la matrice extracellulaire, par exemple la protéine B-CAM Luthéran. Cette interaction directe a été décrite dans le globule rouge (Kroviarski, Y.,El Nemer, W. et al. 2004). Il a été montré que cette interaction avec la spectrine érythroïde, module l’adhérence del’érythrocyte sur la laminine α5 (substrat de la protéine B-CAM) : quand l’interaction entre la spectrine αI (unité répétitive α4) et B-CAM est annihilée, le globule rouge adhère beaucoup plus à la laminine (An, X.,Gauthier, E. et al. 2008).
Des études en immunofluorescence montre une co-localisation entre le domaine SH3 de la spectrine αII et une molécule d’adhérence à la matrice extracellulaire, l‘intégrineβ3. Il a été montré la présence du domaine SH3 de laspectrine αII lors de la formation des clusters d’intégrines β3. Sachant que ces regroupements d’intégrines sont connus comme initiant l’adhérence des cellules et leur étalement (Bialkowska, K.,Saido, T.C. et al. 2005), la spectrine αII pourrait jouer un rôle dans l‘adhérence de la cellule non érythroïde à la matrice extracellulaire en contrôlant la formation de certaines structures d’adhérence.
L’interaction entre les structures d’adhérence comme les points focaux et la spectrine αII pourrait se faire directement mais aussi indirectement grâce à une protéine intracellulaire : la plectine. Cette protéine joue le rôle de liaison entre les microtubules, les filaments intermédiaires et le cytosquelette d’actine et est présente surtout dans des structures d’adhérence mais aussi dans les desmosomes et les hemidesmosomes des cellules épithéliales (Leung, C.L.,Green, K.J. et al. 2002). Une étude in vitro montre une interaction de la plectine avec la spectrine α (Herrmann, H. et Wiche, G. 1987).On peut imaginer que la plectine peut faire le lien entre la spectrine α et des molécules présentes dans les structures d’adhérence comme les intégrines et ainsi elle pourrait contrôler la dynamique de ces structures (Geerts, D.,Fontao, L. et al. 1999).

La spectrine et la polarisation

La polarité est une fonction essentielle pour la cellule, elle se définit par la répartition asymétrique et le maintien de certains organites, de certaines protéines membranaires. L’établissement de la polarité cellulaire peut être un processus transitoire lors de certains évènements cellulaires comme la migration, la division cellulaire, mais elle est aussi définitive comme dans les neurones ou les cellules épithéliales. Le squelette membranaire dépendant de la spectrine pourrait être impliqué dans l’établissement ou le maintien de cete polarité cellulaire.
-Etablissement de la polarité
Il a été montré récemment le rôle de la spectrineβII dans la biogénèse de la membrane latérale de cellules de bronche humaine. La perte de l’expression de la spectrine βII provoque un défaut de la membrane latérale (Kizhatil, K.,Yoon, W. et al. 2007). D’autres observations indiquent que les distributions spécifiques de la spectrine, au pôle basolatéral ou en apical suivant le type cellulaire, induisent des localisations membranaires différentes de la Na/K/ATPase. Dans la cellule rénale polarisée, la spectrine est localisée dans la partie basolatérale de la cellule et est liée à la NA/K/ATPase via l’ankyrine (Nelson, W.J. et Veshnock, P.J. 1986 ; Nelson, W.J. et Veshnock, P.J. 1987 ; Kashgarian, M.,Morrow, J.S. et al. 1988; Davis, L.,Lux, S.E.
et al. 1989 ; Morrow, J.S.,Cianci, C.D. et al. 1989; Nelson, W.J. et Hammerton, R.W. 1989; Gundersen, D.,Orlowski, J. et al. 1991; Devarajan, P.,Scaramuzzino, D.A. et al. 1994; Piepenhagen, P.A.,Peters, L.L. et al. 1995). Par contre dans l’épithélium rétinal pigmentaire ou le squelette membranaire dépendant de la spectrine est principalement localisé en apical, cette pompe se localise au pôle apical (Alper, S.L.,Stuart-Tilley, A. et al. 1994 ; Rizzolo, L.J. et Zhou, S. 1995).
Le squelette membranaire dépendant de la spectrine peut intervenir dans l’établissement de la polarité par action directe sur le transport et l’adressage des protéines à la membrane ou bien dans ses multiples interactions avec des protéines membranaires selon la diversité de sa composition. Par exemple dans les cellules neuronales, la spectrine βIIΣ2 (isoforme avec à l’extrémité C- terminal un domaine PH plus court) est localisé dans le corps du neurone et interagit avec la schwannomine (protéine impliquée dans l’organisation du réseau d’actine) (Chen, Y.,Yu, P. et al. 2001) tandis que la spectrine βIIΣ1 est présente dans les terminaisons synaptiques de l’axone et interagit avec le récepteur NMDA (la stabilité de ce récepteur via la spectrine à des conséquences sur le morphologie membranaire synaptique). Un autre exemple montre une différence de localisation entre la spectrine βV (latérale) et la spectrine βII (plateau cuticulaire) dans des cellules ciliées externes (Legendre, K.,Safieddine, S. et al. 2008). La localisation des différentes spectrines pourrait être importante pou r la polarisation de la cellule puisque chaque spectrine va interagir avec des protéines membranaires qui lui sont propres et ainsi, et pourrait former des micro-domaines spécialisés au sein de la membrane.
-Maintien de la polarité des cellules
Dans les cellules épithéliales polarisées le pôle pical est délimité du pôle basolatéral par les jonctions serrées qui assurent la fonction de barrière imperméable entre les deux compartiments. Des études montrent que lorsque l’ATP intracellulaire est diminuée mimant ainsi l’ischémie, la proportion de spectrine interagissant avec les jonctions serrées, et plus précisément avec ZO-1, augmente. Le lien direct ou indirect entre la spectrine et ZO-1 pourrait être r égulée par le calcium ou la phosphorylation des protéines (Tsukamoto, T. et Nigam, S.K. 1997).
Beaucoup d’observations montrent une délocalisation de protéines membranaires lorsque l’interaction de ces protéines et le squelette membranaire dépendant de la spectrine est abolie. Cette modification de localisation de ces protéines membranaire entraine une perte de fonction pouvant être associé e avec une pathologie.
Dans les cellules épithéliales de colon CaCo-2, la surexpression du domaine de liaison de l’actine ou du domaine de liaison à l’ankyrine de la spectrine non érythroïde entraine progressivement au bout de 10 –14 jours de culture une perte d’expression de la spectrine endogène. Ces cellules perdent leur morphologie épithéliale et deviennent multinucléées. La localisation de la pompe Na/K/ATPase est modifiée (Hu, R.J.,Moorthy, S. et al. 1995). Comme pour la pompe Na/K/ATPase localisée à la membrane basolatérale grâce à la spectrine, le squelette membranaire dépendant de la spectrine est responsable de l’adressage de l’échangeur Na+/H+ échanger (NHE2) mais en apical. Lorsque la spectrine est délétée de la partie qui lie NHE2, cet échangeur est délocalisé à la membrane basolatérale (Chow, C.W. 1999). Chez des souris présentant un déficit en spectrine βIV, il a été montré une délocalisation du canal potassium dépendant du voltage, KCNA dans le nerf myélinisé ce qui engendre chez ces souris, des tremblements avec des troubles auditifs et moteurs (Parkinson, N.J.,Olsson, C.L. et al. 2001).
Ces différents exemples montrent que la spectrine est impliquée dans la localisation spécifique de protéines à la membrane. La spectrine joue un rôle dans la polarisation de la cellule mais aussi dans le maintien de cette polarisation par accumulation de protéines de membrane et le maintien de ces protéines dans des structures (complexes de protéines).

La spectrine : une machine accumulatrice

Le squelette membranaire dépendant de la spectrine participe à la localisation de nombreuses protéines membranaires comme par exemple la pompe Na/K/ATPase liée la spectrine βII via l’ankyrine ou le canal KCNA lié à la spectrine βIV. Pinder et Baines (2000) proposent pour la spectrine un rôle de machine accumulatrice de protéines (Pinder, J.C. et Baines, A.J. 2000). Dans les cellules épithéliales, les protéines de l’adhérence, comme les cadhérines, établiraient des contacts cellule-cellule. Une fois ces contacts établis, ces protéines recruteraient dans un premier temps l’ankyrine, qui permettrait ensuite le recrutement de la spectrine à la membrane basolatérale. Par la suite, des protéines comme la Na/K/ATPase seraient stabilisées à la membrane basolatérale (figure 17 en page 56).
Des observations faites par Williams chez la drosophile en 2004, montrent une augmentation de la demi-vie des protéines membranaires liées à la spectrine (Williams, J.A.,MacIver, B. et al. 2004). Ces données montrent que les protéines liées à la spectrine restent plus longtemps à la membrane plasmique en comparaison avec les protéines non liées qui sont internalisées beaucoup plus rapidement par endocytose, mais un article publié récemment de A.Das de 2008 montre que la formation du squelette membranaire peut être différ ente suivant le type cellulaire (Das, A.,Base, C. et al. 2008).
Le rôle de la spectrine et plus spécifiquement ses domaines pourraient avoir des implications dissemblables pour l’assemblage du squelette membranaire dépendant de la spectrine, dans des cellules de glande salivaire, des cellules de l’intestin moyen de l’embryon, ou des cellules du cerveau de larve.
Figure 17 : Représentation du rôle de la spectrine comme accumulateur de protéines. Le premier contact entre les cellules est établi par des molécules d’adhérence (b), les complexes vont recruter l’ankyrine qui ensuite liera les tétramères de spectrine (c) ; Ce complexe stabilisera la membrane latérale, permettant le recrutement et la stabilisation à la membrane de la Na/K/ATPase (d). (Image tirée de l’article de l’article de Jennifer C. Pinder et Anthony J. Baines dans Nature (Pinder, J.C. et Baines, A.J. 2000)).

La spectrine et le transport intracellulaire

Il a été montré que le squelette membranaire dépendant de la spectrine pourrait être impliqué dans la polarisation cellulaire du fait des interactions spécifiques observées entre les différents squelettes membranaires de spectrine et les protéines de membrane, mais aussi du fait que, la spectrine pourrait jouer un rôle dans l’adressage des protéines membranaires dans différents compartiments de la membrane plasmique. Ce squelette membranaire dépendant de la spectrine est présent dans un grand nombre de membranes intracellulaires, l’appareil de Golgi (présence de spectrine βI) (Beck, K.A.,Buchanan, J.A. et al. 1994) le réticulum endoplasmique (ER) mais aussi dans les granules de cellules chromaffines, dans les vésicules synaptiques, dans la membrane nucléaire, et dans une partie du maillage cytoplasmique liant des vésicules.
Un modèle (figure 18 ci-dessous) propose pour la spectrine des fonctions d’organisatrice et de stabilisation de la membrane golgienne, conférant à celle-ci sa forme et son intégrité structurale. Cet échafaudage pourrait jouer aussi un rôle dynamique dans l’assemblage ou le désassemblage de ce compartiment permettant le trafic de vésicules intracellulaires. Le squelette membranaire dépendant de la spectrine pourrait être impliqué dans le bourgeonne ment des extrémités des sacs golgiens afin de former les vésicules golgiennes, dans le processus d’arrimage des vésicules, ou dans la recapture et le remodelage des sous compartiments golgiens.

Table des matières

INTRODUCTION
I La membrane et le squelette membranaire dépendant de la spectrine
II.1 Le squelette membranaire dépendant de la spectrine dans le globule rouge
II.2 Le squelette membranaire dépendant de spectrine dans les cellules nucléées
III La spectrine : un élément essentiel du squelette membranaire
III.1 La famille multigénique de la spectrine : les gènes et les isoformes
III.1.1 Chez les mammifères
III.1.2 Chez d’autres organismes
III.1.2.1 Chez les oiseaux et les amphibiens
III.1.2.2 Chez le poisson Danio rerio
III.1.2.3 Chez la Drosophile Drosophilia melanogaster
III.1.2.4 Chez le nématode Caenorhabditis elegans
III.2 L’architecture des sous-unités de la spectrine
III.2.1 L’aspect structural de la spectrine : structure et domaines
III.2.1.1 Structure de la spectrine: l’unité répétitive ou « spectrin repeat »
III.2.2 Les sites et domaines de la spectrine
III.2.2.1 L’interaction des différentes chaînes de spectrine
III.2.2.1.1 Le site de nucléation: formation du dimère αβ
III.2.2.1.2 Le site de tétramérisation
III.2.2.2 L’interaction de la spectrine avec d’autres protéines
III.2.2.2.1 Le complexe Spectrine-Actine
III.2.2.2.2 Les sites d’ancrages de la spectrine à la membrane plasmique
III.2.2.2.2.1 Le domaine de liaison à la protéine 4.1
III.2.2.2.2.2 Le domaine de liaison à l’ankyrine
III.2.2.2.2.3 L’interaction directe de la spectrine à la membrane : le domaine PH
III.2.2.2.3 Les domaines EF-hand et la fixation du calcium
III.2.2.2.4 Le domaine SH3
III.2.2.2.5 Le domaine de fixation à la calmoduline
III.2.2.2.6 La boucle de la chaîne αIIΣ1
III.2.2.2.7 La boucle CCC (Caspase Calmoduline Calpaïne)
III.2.3 Les modifications post traductionnelles de la spectrine
III.2.3.1 Le clivage de la spectrine par des protéases
III.2.3.1.1 Le clivage par des calpaïnes
III.2.3.1.2 Le clivage par la caspase3
III.2.3.1.3 Le clivage pathologique de la spectrine
III.2.3.2 La phosphorylation
IV Les fonctions de la spectrine
IV.1 Les fonctions du squelette membranaire
IV.2 Les modèles animaux déplétés en spectrine: effet sur la viabilité et le développement
IV.2.1 La drosophile : D. melanogaster
IV.2.2 Le nématode : C. elegans
IV.2.3 Le poisson : Danio rerio
IV.2.4 Chez les mammifères : l’homme, la souris…
IV.2.4.1 La spectrine et la stabilité membranaire
IV.2.4.2 La Spectrine et l’organisation de la membrane
IV.2.4.3 La spectrine et le remodelage de la membrane
IV.2.4.4 La spectrine et l’adhérence cellulaire
IV.2.4.4.1 Les interactions cellule-cellule
IV.2.4.4.2 Les interactions cellule matrice extra-cellulaire
IV.2.4.5 La spectrine et la polarisation
IV.2.4.6 La spectrine : une machine accumulatrice
IV.2.4.7 La spectrine et le transport intracellulaire
IV.2.4.7.1 La spectrine dans le trafic intracellulaire du Réticulum Endoplasmique vers le Golgi
IV.2.4.7.2 La spectrine dans l’adressage de vésicules du Golgi vers la membrane plasmique
IV.2.4.8 La spectrine et l’endocytose / exocytose
IV.2.4.9 La spectrine et le noyau
OBJECTIFS
MATERIELS ET METHODES
I Matériels
I.1 Les anticorps
I.1.1Les anticorps primaires
I.1.2 Les anticorps secondaires
I.2 Les agents de transfection
I.3 Les SiARN
II Méthodes générales de culture cellulaire
II.1 La lignée WM-266
II.2 Le passage des cellules
II.3 La congélation et décongélation des cellules
III Méthodes générales de biochimie
III.1 La lyse des cellules
III.2 Le dosage protéique
III.3 Electrophorèse et Western blot
IV La transfection des cellules WM266 par les SiARN
IV.1 La préparation du mélange de transfection
IV.2 La préparation des cellules à transfecter
V Immunomarquage pour une analyse en Cytometrie en Flux
VI Immunomarquage pour une analyse en microscopie
VI.1 Traitement des cellules avant marquage
VI.2 Le marquage des cellules
VII L’étude du cycle cellulaire
VII.1 La préparation des cellules pour l’analyse du cycle cellulaire en cytometrie en flux
VII.2 Le marquage de l’ADN par l’iodure de propidium et l’analyse en cytométrie en flux
VIII L’étude de l’apoptose
VIII.1 L’analyse du SubG1 du cycle cellulaire
VIII.2 Analyse de la fragmentation de l’ADN : L’effet TUNEL
VIII.3 Le DioC6 : l’analyse du Dy de la membrane mitochondriale
IX L’adhérence statique des cellules
IX.1 Préparation des cellules
IX.1.1 Le marquage des cellules témoin avec le Hoechst 33342
IX.1.2 Le marquage des cellules transfectées avec la calcéïne AM
IX.2 Tests d’adhérence
IX.3 L’expérience d’adhérence en présence d‘anticorps bloquants des intégrines
X La migration des cellules
X.1 Tests de migration
X.2 La récupération des cellules migrantes pour comptage par la cytométrie en flux
XI Le fractionnement cellulaire : Extraction nucléaire cytoplasme des cellules transfectées
XII L’étude de l’expression de protéines membranaires à la surface des cellules
RESULTATS
I La présentation du modèle utilisé pour l’étude des fonctions de la spectrine αII
I.2 La présentation des mises au point concernant la technique des SiARN
I.2.1 Les mises au point des transfections
I.2.2 Choix des SiARN ciblant la spectrine
II Mise en évidence de la déplétion de la spectrine αII par différentes techniques
II.1 Etude cinétique de l’efficacité de SiARN dirigés contre la spectrine αII par western blot
II.2 La diminution du taux de spectrine αII observée par cytométrie en flux
II.3 La diminution du taux de spectrine αII observée par immuno fluorescence
III Les premiers résultats obtenus lors des mises au point du modéle
IV L’étude de la prolifération des cellules : l’apoptose et le cycle cellulaire
IV.1 La prolifération cellulaire : Comptage des cellules par cytométrie en flux
IV.2 L’étude de l’apoptose par deux analyses différentes: l’effet TUNEL (fragmentation de l’ADN) ou la mesure du potentiel de membrane mitochondriale
IV.2.1 L’effet TUNEL : mesure de la fragmentation de l’ADN
IV.2.2 La mesure du potentiel de membrane mitochondriale DY grâce à un marqueur le DioC6
IV.3 L’étude du cycle cellulaire par deux techniques différentes
IV.3.1 L’analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux
IV.3.2 L’analyse du cycle cellulaire par western blot et détection de la phosphorylation de la protéine rétinoblastome et ainsi que des protéines comme p21 et p15 16
IV.4 Les expériences de la présence de la spectrine αII dans le noyau des cellules WM-
V L’étude de l’adhérence, de l’étalement ainsi que de la migration des cellules
V.1 L’adhérence statique des cellules
V.2 L’étalement des cellules
V.3 La migration des cellules
VI L’étude de l’expression des integrines présentes dans les cellules WM-266
VI.1 L’expression de différentes intégrines à la surface des cellules en cytométrie en flux et par western blot
VI.2 L’implication des intégrines dans l’adhérence des cellules WM-266
VI.2 La localisation des intégrines par immunofluorescence
DISCUSSION
I Discussion sur les techniques utilisées pour obtenir et vérifier les résultats
I.1 Choix de la forme des SiARN et des conditions de transfection utilisés pour dépléter la spectrine αII
I.2 La détection de la déplétion en spectrine αII
-par dosage des ARN messagers de la protéine cible
-par western blot
-par cytométrie en flux
-par immunofluorescence en microscopie
I.3 Les premières observations en microscopie
II La spectrine αII et son implication dans la forme des cellules
III La spectrine αII et le réseau d’actine
IV L’adhérence des cellules et la spectrine αII
IV.1 La spectrine et l’adhérence dans un aspect quantitatif
IV.2 La spectrine et l’adhérence dans un aspect qualitatif
IV.3 L’organisation des points focaux et le regroupement des protéines
V La prolifération et spectrine αII: Apoptose et Cycle cellulaire
V.1 La mort cellulaire et la spectrine αII
V.2 Le cycle cellulaire et la spectrine αII
V.3 La présence de la spectrine αII dans le noyau
VI Effet direct ou secondaire de la spectrine αII sur la polymérisation de l’actine la prolifération et l’adhérence
IV.1 La spectrine αII a un rôle direct sur les différents processus cellulaires
VI.2 Un lien étroit entre les processus cellulaires observés
VI.2.1 La prolifération et le réseau d’actine
VI.2.2 L’adhérence et le réseau d’actine
VI.2.3 L’adhérence et la prolifération
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES
I Travaux sur la spectrine αII et son environnement direct afin d’expliquer les phénotypes
I.1 Etude de l’expression et de la localisation des partenaires directs de la spectrine
I.2 Etude des domaines de la spectrine αII
II Etudes des processus cellulaires pour expliquer l’implication de la spectrine αII
II.1 Etude de la polymérisation de l’actine
II.2 Etude de l’adhérence
II.3 Etude de la prolifération cellulaire
II.4 Etude d’autres processus cellulaires
BIBLIOGRAPHIE

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