Mise en correspondance d’objets intracellulaires en vidéo-microscopie

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Le microscope confocal

Un microscope confocal est un microscope optique qui a la particularité de permettre l’acquisition d’images de très faible profondeur de champ. Le principe du microscope confocal a été décrit par Minsky en 1953, mais les premiers modèles commerciaux ne sont apparus qu’à partir de la fin des années 80.
Principe du microscope confocal
Le mot confocal est issu de la combinaison des mots conjugaison et focal. Le principe de ce micro-scope consiste à utiliser deux trous d’aiguille, un pour l’éclairage et un pour la détection de la lumière émise par l’objet. La confocalité revient à positionner les deuxtrous d’aiguille (conjuguer) sur le même plan focal. Cette opération a pour conséquence de bloquer le passage des faisceaux hors plan focal, et de limiter ainsi les effets dus à la diffraction de la lumière. Ceci est illustré sur la figure 1.3. Le trou d’aiguille a une ouverture correspondant à la première tâche d’Airy. Cette détection du plan focal n’est possible que pour l’acquisition d’un point unique. Pour l’acquisition d’une image entière, il faut ef-fectuer un balayage du laser sur l’ensemble du plan. Le balayage du champ observé par le laser se fait à l’aide de deux miroirs orthogonaux galvanométriques très rapides. La microscopie confocale permet d’atteindre une résolution environ égale à 150 nm. Malheureusement, le fait de n’avoir qu’une seule source d’illumination et de devoir balayer toute l’image point par point nécessite un temps d’acquisition important.
Microscope “spinning disk”
Bien avant l’avènement de la microscopie confocale, Paul Nipkow inventa en 1884 un appareil qui transmettait des images, un principe utilisé plus tard dans les premières camérasde télévision. Cet apareil utilisait un disque rotatif sur lequel des trous disposés en spirale transformaient l’information
bidimensionnelle en une série séquentielle de signaux. Ces signaux pouvaient ensuite être traduitsen images en réutilisant un disque présentant la même disposition de trous. Le microscope “spinning disk” est basé sur ce même principe. Letrou d’aiguille placé juste après l’échantillon imagé est remplacé par un disque rotatif sur lequel de nombreux trous d’aiguilles sont disposés, de telle sorte que l’ensemble de l’échantillon est parcouru quand le disque tourne. Lors de l’acquisition, les rayons lumineux passant à travers les trous couvrent l’image entière grâce à la rotation du disqu e. Ce dispositif permet une acquisition d’images plus rapide que celle obtenue avec un microscope confocal classique.

La microscopie de fluorescence

La microscopie de flurescence peut être utilisée pourmarquer par fluorescence une protéine, puis suivre les différents processus biologiques et chimiques associés à cette protéine à l’intérieur de la cel-lule. Une cellule est constituée de protéines, d’acides gras, de glucides et autres molécules dont l’obser-vation nécessite souvent une résolution inférieure à celle proposée par unmicroscope optique classique.
En fusionnant le gène d’une protéine fluorescente à une protéine d’intérêt, il est possible de suivre le comportement, le mouvement et les interactions de cette protéine avec son environnement, même si la résolution du microscope n’est pas suffisante pour l’observer précisément. La protéine fluorescente la plus célèbre et qui a valu le prix nobel de Chimie 2008 à Osamu Shimomura, Martin Chalfie et Roger Tsien est la protéine fluorescente verte appelée GFP (“Green Fluorescent Protein”) (Salamero 2008).

La protéine fluorescente GFP

À son arrivée aux États-Unis, Osamu Shimomura s’intéresse à la bioluminescen ce de Aequora victo-ria, une méduse qui vit aux abords de la côte pacifique d’Amérique du Nord. Cette méduse produit une luminescence verte à partir de petits photo-organes présents dans l’anneau de son ombrelle. C’est lors de la production et de la purification à grande échelle qu’Osamu Shimomura co-pu rifia en 1961 la GFP.
Il découvre que pour effectuer de la bioluminescence,Aequora relargue des ions calcium. Ceux-ci se lient sur une protéine appelée aequorine, laquelle, en retour, va émettreneu lumière bleue. Shimomura découvre ensuite que la future GFP se met à briller dans le vert sous les UV. C’est donc la lumière bleue émise localement et chimiquement par l’aequorine après liaison du calcium quiest absorbée par la GFP, laquelle en retour émet par fluorescence une lumière verte, un mécanisme décrit par Morin & Hastings (1971). Sans aller aussi loin dans la description de ce mécanisme, Shimomura,Johnson & Saiga (1962) montrent que la GFP possède un fluorophore particulier qui absorbe et émet de la lumière. Ainsi, quand la GFP est soumise à une lumière bleue, le fluorophore de la GFP passe dans un état excité du fait de l’absorption de cette énergie lumineuse. Il restitue ensuite cette énergie en émettant un photon afin de revenir à son état fondamental. Cette désexcitation coïncide avec la longueurd’onde du vert. Le principe de l’émission lumineuse d’un fluorophore est illustré sur la figure 1.4. Pour qu’un fluorophore passe de l’état fondamental à un état excité, il faut qu’il reçoive une quantité d’énergie équivalente à la différence entre ces deux niveaux. Pour une molécule complexe comme une protéine, les niveaux S0 et S2 sont multiples, et il y a des pertes lors du retour d’un état excitéS2 à un état excitéS1. En conséquence, l’én-ergie d’émission est toujours plus faible que l’énergie d’excitation, et la longueur d’onde de la lumière d’émission est toujours plus élevée que celle de la lumière d’excitation.
S’il est possible d’associer la GFP à n’importe quel élément protéique de lacellule, alors la GFP devient une sorte de balise pour la molécule étudiée qui devient observable dans l’espace et dans le temps. Même si la molécule étudiée présente une résolution inférieure à celle duroscope,mic son aspect fluorescent va permettre de la suivre à l’intérieur de la cellule. C’est dans ce sens que Douglas Prasher isole le gène codant de la GFP (Prasher, Eckenrode, Ward, Prendergast & Cormier 1992). Il partage ensuite ses découvertes avec Martin Chalfie et Roger Y. Tsien. Pour obtenir des protéines fluorescentes, le principe consiste à attacher le gène codant pour la GFP à celui codant p our la protéine que l’on souhaite voir devenir fluorescente. En 1994, Chalfie et son équipe injec tent le gène de la GFP au nivau des neurones impliqués dans la perception tactile du ver “C. Elegans” (Chalfie , Tu, Euskirchen, Ward & Prasher 1994).
L’étape suivante est la stabilisation de la GFP, ainsi que sa déclinaison en variantes de propriétés physico-chimiques diverses. C’est avec cet objectif que Roger Y. Tsien développe des GFP capables d’émettre plus longtemps, plus intensément, et à des longueurs d’onde différentes. Il devient possible, par exemple, de marquer simultanément plusieurs protéines avec différentes GFP, et de les suivre en même temps à l’intérieur de la cellule. Cette innovation facilite l’étude des interactions entrprotéines. Par des échanges astucieux des différents acides aminés de la GFP, Tsien et son équipe parviennent à créer des variantes de la GFP émettant dans différentes teintes de bleu etedjaune (Tsien 1998). Ils met-tent ensuite au point d’autres protéines de type GFP à partir de l’étude de coraux fluorescents : mPlum, mCherry, mStrawberry, mOrange et mCitrine. De nombreuses équipes de recherche ont considérable-ment augmenté la palette de teintes des protéines fluorescentes. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission pour différents fluorophores sont présentées sur la figure 1.5.

Le photoblanchiment

Lorsqu’un fluorophore est à l’état excité (S2 sur la figure 1.4), il intervient dans des réactions chim-iques avec une probabilité non nulle, en particulier avec l’oxygène sous ormef de radicaux libres. Il perd alors ses propriétés de fluorescence. Ainsi, quand une solution de molécules fluorescentes est excitée, une certaine proportion d’entre elles est annihilée à chaque excitation. Par conséquent, l’intensité totale de la fluorescence dans une séquence d’images décroît au cours du temps. Ce phénomène est appelépho-toblanchiment. Les temps caractéristiques de chaque molécule fluorescente pour passerde l’état excité S2 à un état inactif (photoblanchi) suivent une caractéristique exponentielle.Ces temps dépendent des caractéristiques moléculaires et de la puissance de la source lumineuse (Garcia-Parajo, Segers-Nolten, Veerman, Greve & van Hulst 2000). À cause du photoblanchiment, le nombr e d’images acquises est limité. Il faut donc rechercher le meilleur compromis échantillonnage temporel/horizon temporel de la séquence d’images acquise.
En présence d’une lumière de très forte intensité, les fluorophores sontéteintsde manière irréversible. Cette réaction est utilisée pour des manipulations de retour de fluorescence après photoblanchiment ap-pelées FRAP (“Fluorescence Recovery After Photobleaching”). L’id ée est d’éteindre la fluorescence dans une certaine région de l’image, et d’étudier le retour de fluorescence dans cette même région. Si les protéines marquées par fluorescence dans l’expérimentation coïncident veca une diffusion à l’intérieur de la cellule, cette manipulation permet de calculer la constante de diffusion associée. La microscopie du temps de vie de la fluorescence appelée FLIM (“Fluorescence Lifetime I maging Microscopy”) est une autre modalité qui tire aussi profit du phénomène de photoblanchiment. Cette technique produit une image de la cartographie du temps de vie des fluorophores dans leur état excité. Une variation du temps de vie peut témoigner d’une variation de la concentration en ions, d’une variation du pH ou du passage d’énergie d’un fluorophore vers une autre molécule. Le transfert d’énergie par résonance Förster ap-pelée FRET (“Förster Resonance Energy Transfer”) est le passag e d’une quantité d’énergie entre deux molécules proches. Le couplage FLIM-FRET permet de colocaliser deuxmarqueurs différents, voire de mesurer une interaction en un endroit précis.

Contexte biologique

Avant d’aborder le contexte biologique précis de notre étude, à savoir letrafic intracellulaire, et plus particulièrement celui des protéines de la famille des RabGTPases, nous évoquons quelques éléments fondamentaux et quelques dates historiques en biologie cellulaire.

La cellule

En 1665, Robert Hooke observe des cellules mortes dans du liège, et leurdonne le nom de cellule, par analogie aux cellules d’un monastère. Il observera par la suite des cellules dans des plantes vivantes en utilisant les premiers microscopes. En 1839, Theodor Schwann découvre que les plantes et les animaux sont tous constitués de cellules. C’est le premier axiome de la théorie cellulaire. En1855, Virchow suggère que toute cellule provient d’une autre cellule, ce qui constitute le second axiome de la théorie cellulaire. En démontrant que la théorie de la génération spontanée (une formede vie peut apparaître spontanément) est erronée en 1861, Pasteur démontre ce second axiome.La théorie cellulaire moderne est définie par les cinq points suivants :
• tout être vivant est composé d’une ou de plusieurs cellules,
• toute cellule provient d’une autre cellule (principe de la division cellulaire),
• la cellule est une unité vivante et l’unité de base du vivant,
• il y a individualité cellulaire,
• la cellule contient l’information sous forme d’acide désoxyribonucléique (ADN) nécessaire à son fonctionnement et à sa reproduction.
Plus brièvement, la cellule est l’unité structurale, l’unité fonctionnelle et l’unité productricere.
La cellule est un espace clos délimité par la membrane plasmique, qui est constituée d’une bi-couche lipidique. Loin d’être hermétique, la membrane plasmique est le lieu d’échanges (molécules, lumière, chaleur, informations) entre cellules. L’intérieur de la cellule est hautement organisé et divisé en or-ganelles aux fonctionnalités propres. Il existe deux types de cellules : les cellules eucaryotes (plantes et animaux) et les cellules procaryotes (bactéries). La compartimentation de la cellule en organelles est particulièrement importante dans le cas des eucaryotes. On identifie une vingtain e d’organelles dans la cellule animale, contenant leur lot d’enzymes spécifiques et de molécules spécialisées. Divers mécan-ismes permettent d’acheminer les molécules d’un organelle à l’autre. Pour comprendre l’organisation globale de la cellule eucaryote, il est essentiel de connaître ce qui se passe dans chaque organelle. Dans la cellule eucaryote animale, illustrée sur la figure 1.6, nous dénombrons plus particulièrement les or-ganelles suivants :
• Noyau : il contient la plupart du matériel génétique de la cellule. Il a deux fonctions principales : il contient l’ADN, support de l’information génétique héréditaire, et permet synthèsela des pro-téines par l’intermédiaire de l’ARN (ARN messager). Son diamètre varie de 10à 20 µm, ce qui fait de lui le plus grand des organites.
• Reticulum Endoplasmique : il est constitué d’un ensemble de replis et de tubules membranaires, dont certains sont en continuité avec l’enveloppe nucléaire. Une partie dureticulum endoplas-mique est couverte de ribosomes (reticulum endoplasmique rugueux) qui assemblent les acides aminés en protéines suivant l’information venue du noyau. L’autre partie ste appelée reticulum endoplasmique lisse. Le reticulum endoplasmique assure de multiples fonctions à l’ intérieur de la cellule, et est notamment impliqué dans le transport des protéines.
• Appareil de Golgi : il est constitué d’un empilement de saccules membranaires de forme discoï-dale. L’appareil de Golgi est le point de passage obligé et régulateur dutrafic vésiculaire.
• Mitochondries : elles représentent les centrales énergétiques de la cellule.

Le cytosquelette, support du trafic vésiculaire

Le cytosquelette est le support du trafic vésiculaire. Il est composé de trois types de polymères : les filaments d’actine, les filaments intermédiaires et les microtubules. Ces filaments s ont dynamiques. En effet, les protéines intervenant dans leur constitution existent sous deux formes dans la cellule : monomériques, solubles et dispersées dans le cytosol, ou insolubles et organisées en filaments. Si la concentration en filaments est supérieur à un seuil haut, il y a polymérisation. En revanche, si cette concentration est inférieure à un seuil bas, il y a dépolymérisation. Le filament est polarisé. L’extrémité notée ‘+’ présente un seuil de polymérisation plus faible que l’extrémité notée–’. Comme` l’illustre la figure 1.7 (a), à concentration égale, le côté `+’ croît plus vite (ou se dépolymérise pluslentement) que le côté `–”. Il existe également une plage de concentration pour laquelle le côté `+’ croît tandis que le côté `–’ décroît, ce qui entraîne la migration du filament à l’intérieur de la cellule. Les my osines, kinésines et dynéines sont des moteurs moléculaires capables de se déplacer le long ducytosquelette en consommant de l’ATP (adénosine triphosphate), le “carburant cellulaire”. Ils permette nt notamment de propulser des vésicules à l’intérieur de la cellule.

La protéine Rab6

Les GTPases de la famille Rab (environ 60 protéines chez l’homme (Seabra,Mules & Hume 2002)) sont des régulateurs des voies de transport membranaire entre les compartiments donneurs et accepteurs. La famille des protéines Rab peut directement ou indirectement réguler diverses étapes du transport vésiculaire, comme la sélection des cargos, le bourgeonnement des membranes, la motilité des vésicules, leur capture et leur amarrage, et enfin leur fusion à la membrane (Chavrie r & Goud 1999). La localisation des différentes protéines Rab dans la cellule est illustrée sur la figure1.7 (b) (Zerial & McBride 2001). Les protéines Rab6 appartiennent à cette famille et existent sous trois isoformes (Rab6A, Rab6A’ et Rab6B) chez l’homme. L’isoforme Rab6B n’est présente que dans une ous-population des cellules neuronales et sa fonction précise est inconnue pour l’instant (Opdam, Echard, Croes, van den Hurk, van de Vorstenbosch, Ginsel, Goud & Fransen 2000). Nous nous intéressons plus particulièrement aux deux autres isoformes de Rab6. Elles sont impliquées dans une nouvelle voiede transport entre l’appareil de Golgi et le reticulum endoplasmique ne faisant pas intervenir les mécanisme classiques (White, Johannes, Mallar, Girod, Stephan, Reinsh, Keller, Tzschaschel, Echard, Goud & Stelzer 1999, Girod, Storrie, Simpson, Johannes, Goud, Roberts, Lord, Nilson & Pepperkok 1999).
Les protéines Rab6 sont présentes sous la forme de trois états dans la celleu :
(b) localisation des différentes protéines Rab dans la cellule (figure extraite de (Zerial & McBride 2001)).
• ancrées à l’appareil de Golgi,
• en diffusion dans le cytosol,
• ancrées à la membrane des vésicules et transitant entre l’appareil de Golgi et le reticulum endo-plasmique.
Une hypothèse maintenant partagée par un grand nombre de biologistes repose sur l’idée que cette pro-téine circule en circuit fermé à l’intérieur de la cellule. Les protéines fixées à appareill’ de Golgi sont ancrées à la membrane des vésicules. Sous cette forme, elles participent autrafic vésiculaire depuis l’appareil de Golgi vers des points d’entrée du reticulum endoplasmique localisés à la périphérie de la cellule. Arrivées à leur destination, les protéines se dissocient des vésiculespour se déplacer en diffusion dans le cytosol en direction de l’appareil de Golgi. À cet endroit, elles s’an crent à nouveau et le cycle recommence. Ce cycle est illustré sur la figure 1.8. L’étape clé dans ce cycle est le trafic entre l’appareil de Golgi et le reticulum endoplasmique, qui correspond très vraisemblablement à une communication intracellulaire. Lors de cette étape, les protéines Rab6 sont embarquées dans des vésicules qui se dé-placent le long du réseau de microtubules sous l’action de moteurs moléculaires(Hirokawa 1998). Ce déplacement est illustré sur la figure1.10.
Une cellule pour laquelle les protéines Rab6 sont marquées par fluorescence et acquises avec un microscope “spinning disk” est illustrée sur la figure 1.9. Dans cette image, une région de forte intensité et entourée en vert est présente au centre de la cellule . Cette région correspond à l’appareil de Golgi. Elle est fortement lumineuse car un grand nombre de protéines Rab6 y sont ancrées. On observe également un certain nombre de spots (entourés en rouge). Ces derniers correspondent aux protéines Rab6 ancrées à la membrane des vésicules qui sont en phase de trafic. Le reste de l’image présente une intensité moindre et correspond en partie à la phase de diffusion de la protéine Rab6 dans le cytosol.

Approche locale : suivi individuel

En analyse d’images, l’étude du trafic au cours du temps est généralementeffectuée en suivant indi-viduellement chaque objet. Dans une seconde étape, le trafic global est établi à partir des trajectoires de chacun des objets. Pour suivre individuellement chaque objet, deux types de méthodes sont préconisés : la mise en correspondance et le filtrage temporel stochastique.

Mise en correspondance d’objets intracellulaires en vidéo-microscopie

Les méthodes de mise en correspondance nécessitent une détection préalable des objets d’intérêt dans la séquence d’images considérée. Ces objets sont caractérisésr paun certain nombre d’attributs, qui diffèrent suivant l’application envisagée. Le but de la mise en correspondance est d’associer un objet à une séquence de mesures, permettant d’établir ainsi sa trajectoire au cours du temps.

Soit qit = (qti(1) q ti(Nq))T ∈ RNq le vecteur des Nq attributs caractérisant l’objeti détecté à l’instant t. Par la suite, ce vecteur est appelé “mesure”. Les attributs sont généralement de différentes nature. Dans (Racine 2006), pour un objet détecté et défini par une égionr connexe, les auteurs le carac-térisent par son centre de gravité, par la somme des intensités à l’intérieur dela région correspondante et enfin par l’aire (en nombre de pixels) de la région. Ces caractéristiquessont choisies parce qu’elles ne varient que très peu au cours du temps. D’autres attributs peuvent également être considérés, comme le contour des objets (Fontaine, Barr & Burdick 2007). La méthode de mise en correspondance la plus simple est alors l’algorithme du plus proche voisin. Algorithme du plus proche voisin

L’algorithme du plus proche voisin suppose que les mesures les plus proches au sens d’une certaine distance correspondent au même objet. Cet algorithme est séduisant car simple conceptuellement et rapide lors de la mise en oeuvre (Deriche & Faugeras 1990, Pinho, Tavares & Correia 2007).

Soit Nq objets détectés aux instants −1 et t. En principe, chaque objet peut être associé à n’importe quel autre objet, soit donc (Nq)2 combinaisons possibles d’associations. La distance entre deux mesures quantifie la vraisemblance pour ces deux mesures de représenter le même objet. Plus la distance est faible, plus la vraisemblance est grande. Si la différence entre vecteurs d’attributs suit une loi gaussienne multidimensionnelle, la mesure de distance appropriée est la distance de Mahalanobis (Duda & Hart 973). La fonction de vraisemblance est alors donnée par : P (qti q∗j) = 1 1 exp − 1 (qti − q∗j)T Σq−1(qti − q∗j) (2.1) où Σqreprésente la matrice de variance/covariance de la différence(qit − qj∗). Dans ce cas, qj∗ désigne soit le vecteur d’attributs prédit à l’instant t pour l’objet i détecté à l’instant(t − 1) (en utilisant un filtre de Kalman par exemple (Fontaine et al. 2007)), soit la mesure correspondant à l’objet i détecté à l’instant (t − 1) (Racine 2006). En pratique, il est plus simple d’utiliser directement la distance de Mahalanobis : dM (qti q∗j) = (qti − q∗j)T Σq−1(qti − q∗j) (2.2)

L’objet j à l’instant (t − 1) associé à l’objet i à l’instant t est celui qui minimise dM (qit qj∗). Il arrive souvent que les distances de Mahalanobis entre un objet détecté à l’instan t et plusieurs objets détec-tés à l’instant (t − 1) soient proches, ce qui complique le problème d’association. Toutefois, d’autres informations sont disponibles dans les images suivantes. Une meilleure mise en correspondance peut être obtenue en retardant le processus de décision, avec l’espoir queles mesures suivantes permettent de lever certaines ambiguïtés. Cette idée est exploitée par l’algorithme de divisionesd trajectoires (Smith & Buechler 1975).

Algorithme de division des trajectoires

La figure 2.1 (a-b) illustre le principe de l’algorithme de division des trajectoires. Dans cet exemple, une seule caractéristique est prise en compte. À l’instant t = 4, deux objets détectés présentent une dis-tance similaire avec l’objet suivi jusqu’alors. Plutôt que d’assigner arb itrairement l’objet le plus proche, l’arbre de suivi présenté sur la figure 2.1 (b) est construit. Les deux branches indiquent la possibilité de choisir un des deux objets détectés à l’instantt = 4. La décision n’est pas prise immédiatement, mais est différée pour prendre en compte les objets détectés aux instants ivantssu. Les arbres de suivi peuvent rapidement devenir très vastes. Il est par conséquent primordial de définir une nouvelle mesure de vraisemblance pour l’association de deux objets, afin d’écarter les hypothèses peu vraisemblables. Cette mesure de vraisemblance sert ensuite à élaguer l’arbre, étape indispensable pour la mise en oeuvre pratique de cette approche.

Une trajectoire est définie comme la séquence d’un ensemble de mesures supposées correspondre à l’évolution d’un objet dans le temps. Le problème de mise en correspondance revient à assigner les mesures aux trajectoires correspondantes. Soit Qlt = ql1 qlt le vecteur de mesures associé à la trajectoire l, de l’instant 1 à l’instant t. On note qlk le vecteur d’attributs détecté à l’instantk, associé à la trajectoire l. Soit Etl l’évènement Q“lt correspond à un seul et même objet”. La vraisemblance de Etl est de la forme : t P (Etl) =P qkl|Q0:k E tl (2.3).

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Table des matières

Introduction générale
Contributions
Organisation du document
1 Instrumentation, contexte biologique et pré-traitements
1.1 Le microscope optique
1.1.1 Le microscope à champ large
1.1.2 Le microscope confocal
1.2 La microscopie de fluorescence
1.2.1 La protéine fluorescente GFP
1.2.2 Le photoblanchiment
1.3 Contexte biologique
1.3.1 La cellule
1.3.2 Le trafic intracellulaire
1.3.3 Le cytosquelette, support du trafic vésiculaire
1.3.4 La protéine Rab6
1.4 Acquisition et pré-traitements
1.4.1 Instrumentation
1.4.2 Micro-patrons
1.4.3 Restauration d’images
1.4.4 Approximation d’une séquence d’images 3D+T par une séquence 2D+T
1.4.5 Correction du courant d’obscurité et compensation du photoblanchiment
1.5 Conclusion
2 Analyse du trafic intracellulaire
2.1 Approche locale : suivi individuel
2.1.1 Mise en correspondance d’objets intracellulaires en vidéo-microscopie
2.1.2 Méthodes séquentielles de Monte Carlo et filtrage stochastique pour le suivid’objets en microscopie de fluorescence
2.2 Estimation du trafic par approche globale
2.2.1 Modélisation et estimation du trafic sur des réseaux de télécommunications
2.3 Conclusion
3 Simulation du trafic intracellulaire par tomographie de réseaux
3.1 Simulation du trafic vésiculaire de la protéine Rab6
3.1.1 Approches existantes pour la simulation du trafic vésiculaire
3.1.2 Modèle dynamique
3.1.3 Modèle photométrique
3.1.4 Caractéristiques dynamiques
3.1.5 Simulation du trafic vésiculaire
3.2 Cycle de la protéine Rab6
3.2.1 Diffusion dans le cytosol
3.2.2 Représentation de l’appareil de Golgi
3.2.3 Cohérence entre les différentes phases du cycle de la protéine Rab6
3.3 Simulation de la protéine Rab6
3.4 Bilan
3.5 Conclusion
4 Séparation des composantes “objet” et “fond” en vidéo-microscopie
4.1 État de l’art
4.1.1 Détection d’objets d’intérêt en vidéo-microscopie
4.1.2 Méthodes de séparation des composantes “objet” et “fond” en vidéo-microscopie
4.2 Une nouvelle approche : champs aléatoires conditionnels pour la séparation des composantes “objet” et “fond”
4.2.1 Modélisation markovienne et analyse d’images
4.2.2 Champs aléatoires conditionnels pour la détection en vidéo-microscopie
4.2.3 Estimation conjointe des composantes “fond” et “objet”
4.2.4 Évaluation en vidéo-microscopie de différentes approches de détection
4.3 Comparaison des méthodes de séparation des composantes “objet” et “fond”
4.3.1 Évaluation quantitative des différentes méthodes de séparation
4.3.2 Évaluation qualitative des différentes méthodes de séparation
4.3.3 Synthèse
4.4 Conclusion
5 Analyse du trafic intracellulaire par tomographie de réseaux
5.1 Présentation générale de l’estimation du trafic par tomographie de réseaux
5.2 Détection des zones origine-destination
5.2.1 Détection des zones de stockage
5.2.2 Évaluation des méthodes de détection des zones de stockage
5.3 Partitionnement de l’image
5.3.1 Partition de Voronoï
5.3.2 Partitions d’images et cellules contraintes par micro-patrons
5.4 Estimation du nombre de vésicules se déplaçant d’une région à une autre
5.5 Estimation de la matrice de routage
5.5.1 Définition du coût des arêtes
5.5.2 Définition de la matrice de routage
5.6 Estimation du trafic sur les paires origine-destination
5.6.1 Stratégies d’estimation du trafic sur les paires origine-destination
5.6.2 Approche hiérarchique pour l’estimation des paires origine-destination
5.7 Bilan
5.7.1 Détection de zones origine-destination
5.7.2 Analyse du trafic intracellulaire par tomographie de réseaux
5.8 Conclusion
Conclusion générale et perspectives
Synthèse des travaux effectués
Perspectives
A Modélisation du transport routier
A.1 Estimation d’une matrice origine-destination
A.2 Approches de type “trafic”
A.3 Approches statistiques
B Algorithme de coupe minimale-flot maximal
B.1 Graphe
B.2 Coupe
B.3 Flot
B.4 Coupe minimale et flot maximal
B.5 Extraction du flot maximal
C Estimation des échanges de fluorescence entre régions voisines
C.1 Définition des échanges de fluorescence entre régions voisines
C.2 Stratégies de résolution
C.3 Évaluation des stratégies de résolution
C.4 Modélisation des échanges de fluorescence avec une motivation biologique
C.5 Évaluation de l’estimation des échanges de fluorescence