MISE AU POINT DU PROTOCOLE DE DOSAGE DU MALEATE DE CHLORPHENAMINE

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Méthodes de dosage du maléate de chlorphéniramine

 La méthode de la Pharmacopée Américaine (34/NF 29 2012, vol 2) se décrit comme suit :
-Peser 20 comprimés, prélever une quantité de poudre équivalente à 25mg de substance active-transférer dans une ampoule à décanter de 125ml
-Ajouter 20ml l’acide chlorhydrique dilué (1 dans 100) -agiter rigoureusement pendant 5 min – ajouter 20ml d’hexane
-Agiter prudemment- recueillir la phase acide dans une deuxième ampoule à décanter de 125ml.
-Agiter la phase contenant l’hexane avec 2 × 10ml d’acide chlorhydrique dilué (1 dans 100)
-Recueillir la phase acide dans une autre ampoule à décanter et éliminer la phase contenant l’hexane.
-Ajouter 10 ml d’hydroxyde de sodium TS et 50 ml d’hexane
-Agiter prudemment et éliminer la phase aqueuse.
-Laver chacune des deux solutions d’éther avec 20 ml d’eau.
-Eliminer l’eau ; extraire les phases d’hexane par 2 × 20ml et 5 ml d’acide sulfurique dilué (1 dans 70).
-Recueillir l’extrait acide dans une fiole de 50 ml.- jusqu’au trait de jauge avec l’acide.
-Diluer 10 ml de la préparation d’analyse avec de l’acide chlorhydrique dilué (1 dans 100) à 25,0 ml pour préparer la solution utilisée pour la détermination de l’absorbance, l’AU, à 264 nanomètre.
-Pour la détermination de l’absorbance spécifique (AS), préparez une solution contenant environ 40mg de Maléate de Chlorphéniramine RS d’USP, exactement pesé, dans 200,0 ml d’acide chlorhydrique dilué (1 dans 100), et traitez 20,0 ml de cette solution de la même façon que la solution de comprimés prise dans l’acide chlorhydrique dilué (1 dans 100). Calculer la quantité, en mg, de maléate de chlorphénamine dans les comprimés pris par la formule :
C x (Au/As), dans laquelle C est la masse, en mg de maléate de chlorphéniramine RS dans les 20,0 ml da la préparation standard.
 La nouvelle méthode mise au point par Djiambeu Chawe [23] se décrit comme suit :
– Peser une quantité de poudre contenant 3mg de substance active,
– Mettre dans 50ml d’H2SO4 0,25M,
– Agiter pendant 5 mn (agitation magnétique),
– Soumettre au bain à ultrason pendant 15 min,
– Filtrer et prélever 10 ml, les introduire dans une fiole de 25 ml et compléter avec de l’H2SO4 0,25 M.

Evaluation de la Qualité

La qualité peut être évaluée en procédant à des vérifications ou contrôles, à des essais etc. Le contrôle de la qualité est un élément des BPF (Bonnes Pratiques de Fabrication) au cours duquel des échantillons de médicament sont testés par rapport à des normes de qualité spécifiques. Le contrôle se faisant aux moyens de tests physico chimiques a pour but d’avoir un produit de qualité.

Importance du contrôle de la qualité des médicaments

Le contrôle permet de savoir si le produit contrôlé est conforme ou non à ses spécifications ou exigences préétablies et incluant ainsi une décision d’acceptation, de rejet ou de retouche. Le contrôle de la qualité des médicaments permet de protéger la santé des populations. En effet, la mauvaise qualité d’un médicament peut entraîner une absence d’effet thérapeutique et provoquer des réactions indésirables ou toxiques, qui à leur tour nuisent à la santé du patient soit en prolongeant la maladie initiale, soit en provoquant une nouvelle maladie (maladie iatrogénique), et constituent un gaspillage de ressources. Le contrôle de la qualité des médicaments permet donc de s’assurer que les patients reçoivent des médicaments sûrs, efficaces et de qualité conforme aux normes des pharmacopées. De nos jours, de nombreuses méthodes analytiques permettent d’assurer le contrôle de la qualité des médicaments. Parmi elle, l’électrophorèse capillaire occupe une place de choix.

ELECTROPHORESE CAPILLAIRE (EC)

Principe et fonctionnement

L’électrophorèse capillaire (EC) est une méthode analytique qui s’est développée grâce aux acquis de la CLHP et des procédés plus anciens d’électrophorèse. L’EC correspond à une adaptation particulière de la méthode générale d’électrophorèse.
Elle permet la séparation, la détection et la quantification de composés organiques et inorganiques.
Elle est basée sur la migration différentielle, sous l’effet d’un champ électrique, des espèces de l’échantillon en solution, neutres ou porteuse d’une charge électrique globale, dans un capillaire étroit rempli d’électrolyte [25, 26].
Le mélange à analyser est injecté par pression dans le tube capillaire à l’anode, puis une tension de plusieurs kilovolts est appliquée entre les deux électrodes. Le champ électrique ainsi créé induit un mouvement des molécules et permet la séparation de celles-ci. On détecte le passage des molécules à travers le capillaire à l’aide d’un détecteur UV placé près de la cathode. Lorsqu’une molécule passe, elle absorbe une certaine quantité de lumière et le détecteur transcrit cette information en un signal, visible sous forme de pic dans un électrophorégramme.

Appareillage

L’appareillage est constitué de deux récipients, remplis d’une solution d’électrolyte tamponnée, dans laquelle trempent les extrémités d’un tube capillaire (diamètre interne entre 25 et 75 μm) ainsi que deux électrodes de platine. Il compte aussi un générateur de tension capable de délivrer une différence de potentiel compris entre 10 et 30 kV, un système d’injection hydrodynamique en général (application d’une différence de pression entre les deux électrodes pendant un temps Δt) et un détecteur UV (figure 4).

Flux électro-osmotique (eof)

Le second facteur qui contrôle la migration des solutés est l’écoulement de l’électrolyte encore appelé flux électro-osmotique caractérisé par sa mobilité électro-osmotique. La vitesse de l’écoulement électro osmotique veof (m.s-1) est reliée à la densité de charge portée par le capillaire ξ (m³.kg².C-³ .s -4), au champ électrique appliqué E (V.m-1), à la viscosité de la solution tampon η (Pa.s-1) et à la constante diélectrique du tampon ε (C².N-1.m-²) : Veof= εξ E /4 πη= µeof E.
Ce flux résulte de la présence de charges négatives portées par la matrice. Ces charges négatives proviennent de l’ionisation des groupements silanol (Si-OH) qui tapissent l’intérieur du capillaire en silanoates (Si-Oˉ) à pH supérieur à 3. Ces sites anioniques fixes attirent des cations présents dans la solution et les ordonnent en double couche dont l’une est collée à la paroi et l’autre quelque peu mobile. Entre ces deux couches nait une différence de potentiel (le potentiel Zeta), dont la valeur dépend de la concentration de l’électrolyte et du pH, les cations migrent vers la cathode. Ces ions étant solvatés par des molécules d’eau, il apparait un flux d’électrolyte qui se dirige dans le même sens [26].
L’écoulement électro-osmotique dépend de la force ionique et du pH de l’électrolyte qui conditionne le degré d’ionisation des groupements silanols et la densité de la double couche.
L’ajout de certains tensioactifs comme le tétra-akylammonium dans l’électrolyte peut inverser la polarité de la paroi, le flux électro osmotique se dirige vers l’anode.

Electrophorèse capillaire électrocinétique micellaire (MEKC)

Dans cette variante au procédé de base décrit précédemment, on ajoute dans la phase mobile un composé cationique ou anionique, tel le dodécylsulfate de sodium (SDS), pour former des micelles dont le caractère ionique les rend porteuse de charges. Ces microgouttelettes, qui ne sont pas miscibles à la solution, emprisonnent les composés neutres, plus ou moins efficacement, par affinité du type hydrophile/hydrophobe. Ce type d’électrophorèse est donc utile pour les composés qui ont tendance à migrer sans séparation. En ajoutant des cyclodextrines modifiées, on peut déterminer la pureté optique des composés. Il se forme alors des complexes d’inclusion de stabilité différente avec les couples d’énantiomères [26].

Electrophorèse capillaire sur gel

C’est la transposition de l’électrophorèse de polyacrylamide (PAGE) ou d’agarose. Le capillaire est rempli avec un électrolyte contenant un gel. Celui-ci produit un effet de filtration qui ralentit les grosses molécules et minimise les phénomènes de convection ou de diffusion. Les oligonucléotides, peu fragiles, peuvent être ainsi séparés. Le flux électro-osmotique reste faible. Dans l’électrophorèse sur plaque, le support sur lequel se produit la migration peut contenir un gel (amidon ou mieux polyacrylamide) imprégné de l’électrolyte. Si ce dernier contient du SDS, on désigne cette forme d’électrophorèse sur gel par son sigle anglais SDS PAGE. La séparation se trouve améliorée par un phénomène de filtration sur gel qui se superpose aux forces électroniques. Ces techniques sont surtout utilisées pour les trois grandes catégories de biomolécules : les polypeptides (protéines) ; les oligonucléotides (fragment d’ADN ou d’ARN) et les mono et polysaccharides (hydrates de carbone).

Electrophorèse à focalisation isoélectrique

Cette technique également connue en électrophorèse sur support, consiste à créer un gradient de pH linéaire dans un capillaire à paroi traité contenant un ampholyte. Le capillaire plonge dans du H3PO4 à l’anode et dans du NaOH à la cathode. Chaque composé migre et se focalise au pH qui a même valeur que son potentiel isoélectrique (au pHi, sa charge nette est nulle).
Ensuite, sous l’effet d’une pression hydrostatique et en maintenant le champ électrique, on déplace les espèces séparées vers le détecteur. Les résolutions élevées obtenues avec ce procédé, permettent notamment de séparer des peptides dont les pHi ne différent que de 0,02 unité pH.

Caractéristiques de la méthode d’analyse par Electrophorèse capillaire

Avantages

Durée de l’analyse : Elle dure de 5 à 20 min. La méthode est plus rapide que les séparations chromatographiques dont la mise en œuvre nécessite un temps non négligeable pour que les équilibres de matière et de température soient atteints ;
Faible volume injecté : Comme en CPG, le volume d’échantillon injecté est faible, entre 1 et 10 μl et même parfois de l’ordre du nano litre, ce qui nécessite l’emploi d’un étalon interne. Le volume injecté ne dépasse pas, en général, 1 % du volume du capillaire ;
Séparation à température ambiante : Le travail à température ambiante est intéressant pour les molécules thermolabiles. Mais le contrôle de la température est plus important en électrophorèse capillaire qu’en CLHP ;
Faible coût d’utilisation : L’utilisation de très faibles quantités de solvants organiques diminue les coûts d’utilisation par rapport aux méthodes chromatographiques.

Les limites

Sensibilité : L’EC est moins sensible que la CLHP, bien que l’usage de solvant aqueux autorise l’utilisation de faibles longueurs d’onde (λ = 190 nm) avec les détecteurs spectrophotométriques. ; Précision : La précision de l’électrophorèse capillaire en matière de déterminations quantitatives est inférieure à celle des méthodes chromatographiques (CLHP et CPG) en raison du faible volume injecté et malgré l’emploi systématique d’un étalon interne. La difficulté d’obtention d’un flux électroosmotique reproductible surtout en mode micellaire contribue au manque de précision.

VALIDATION D’UNE METHODE ANALYTIQUE

La validation d’une méthode consiste à déterminer les caractéristiques essentielles du dosage  d’une substance dans un substrat.
Elle a pour principal objectif de s’assurer qu’une méthode analytique donnée donnera des résultats suffisamment fiables et reproductibles, compte tenu du but de l’analyse. La liste et définition des caractéristiques qui peuvent être spécifiées pour une méthode analytique et données par l’ICH (International Conférence on Harmonisation), sont [24] :
• Exactitude : l’exactitude ou la justesse exprime l’étroitesse de l’accord entre la valeur moyenne obtenue à partir d’une série de résultats et une valeur qui est acceptée comme « référence ». Elles permettent d’évaluer l’erreur systématique associée à la méthode ;
• Fidélité : la fidélité exprime l’étroitesse de l’accord entre une série de mesures provenant de plusieurs prises d’un même échantillon homogène dans des conditions définies. Elle est évaluée à trois niveaux :
• Répétabilité : elle est évaluée dans des conditions ou les résultats d’essai sont obtenus par la même méthode sur des échantillons identiques dans le même laboratoire, par le même opérateur, utilisant le même équipement et pendant un court intervalle de temps (essais réalisés la même journée) ;
• Fidélité intermédiaire : conditions où les résultats d’essais indépendants sont obtenus par la même méthode sur des échantillons d’essais identiques dans le même laboratoire, avec différents opérateurs et utilisant des équipements différents et pendant un intervalle de temps donné (plusieurs jours) ;
• Reproductibilité : conditions où les résultats sont obtenus par la même méthode sur des échantillons d’essais identiques dans différents laboratoires, avec différents opérateurs et utilisant des équipements différents ;
• Sélectivité : La sélectivité ou spécificité d’une méthode est son aptitude à mesurer la concentration de l’analyte sans interférence de la part des autres constituants de l’échantillon. Lorsque tous les autres constituants sont connus et disponibles, la sélectivité peut être déterminée en comparant les résultats obtenus avec l’analyte seul et avec l’analyte additionné des substances soupçonnées d’interférences. Lorsque ces substances n’ont pu être identifiées ou ne sont pas disponibles, on peut souvent évaluer la sélectivité en ajoutant des quantités connues d’analyte pur à des échantillons dans lesquels la concentration des autres constituants est maintenue constante et en déterminant la quantité d’analyte retrouvée ;
• Sensibilité : la sensibilité est l’aptitude de la méthode à détecter de petites variations de concentration. Une procédure est dite sensible si une faible variation de la concentration ou de la quantité d’analyte entraine une variation significative de la réponse ;
• Fonction de réponse : la fonction de réponse correspond à la courbe d’étalonnage, cela traduit la relation entre la réponse correspondant au signal et la concentration en substance analysée ;
• Linéarité : la linéarité d’une procédure d’analyse est sa capacité à produire des résultats proportionnels à la quantité d’analyte dans l’échantillon ;
• Limite de détection (LOD) : c’est la plus petite quantité de l’analyte dans un
échantillon pouvant être détectée, mais non quantifiée comme une valeur exacte dans les conditions expérimentales de la procédure ;
• Limite de quantification (LOQ) : c’est la plus petite quantité de l’analyte dans un
échantillon pouvant être dosée avec exactitude dans les conditions expérimentales de la procédure.

MISE AU POINT DU PROTOCOLE DE DOSAGE DU MALEATE DE CHLORPHENAMINE

Le maléate de chlorphénamine a un pKa de 9,13 ; il s’ionise donc en milieu acide et peut être élué par électrophorèse capillaire de zone. Plusieurs pH ont été expérimentés et on obtient de bons pics à pH 3,6 ; 5,5 et 6,8. Par ailleurs, après essai de plusieurs étalons internes, notre choix s’est porté sur le diclofénac car il s’adapte bien aux conditions de travail et on obtient une bonne séparation entre les 2pics. Le tampon choisi était le tampon phosphate à pH 6,8 qui permettait l’ionisation simultanée du maléate de chlorphénamine et du diclofénac.
L’influence de la tension et du courant a également été étudiée. On obtient une meilleure allure des pics avec :
-Une tension de séparation de 20kV
-Une pression de 50 mbar
-Une fréquence d’acquisition de 9,5Hz

Préparation des solutions de travail

Solution 1 : tampon phosphate pH=6,8 ; 66mM
On prépare une solution de di-hydrogénophosphate de potassium à M/15 (soit 9,08 g de KH2PO4 par litre) et une solution de di-sodium hydrogénophosphate (9,47 g de Na2HPO4 par litre). On mélange ensuite 99 ml de Na2HPO4 et 101 ml de KH2PO4 dans une fiole jaugée de 200 ml. Solution 2 : Tampon phosphate pH=6,8 ; 6,6mM
La solution 2 est obtenue à partir de la solution 1 en pipetant 10ml de celle-ci pour les mettre dans un ballon de 100ml remplie à la jauge avec de l’eau ultra pure.
OUENDO Eddy K.S Mémoire Master 2 APC-MQPSA 24
Validation d’une méthode d’électrophorèse capillaire pour l’analyse de médicaments à base de maléate de chlorphénamine.
Solution 3 : Solution d’étalonnage secondaire de maléate de chlorphénamine
La solution d’étalonnage secondaire est obtenue par dissolution de 1290 mg de poudre de comprimés de maléate de chlorphénamine dosé à 4 mg, de poids moyen 169 mg, d’une pureté de 98,17% dans une fiole jaugé de 20ml avec de l’eau ultra pure. On passe la solution à l’ultra son pendant 20 minutes puis on la filtre. La concentration de la solution est de 1,5 g/l de maléate de chlorphénamine.
Solution 4 : Solution de standard de diclofénac
La solution de standard est obtenue par dissolution de 20 mg de diclofénac dans une fiole jaugé de 20 ml avec de l’eau ultra pure. On passe la solution à l’ultrason pendant 10 minutes puis on la filtre. La concentration de la solution est de 1,2 g/l de diclofénac.
Solution 5 : Solution d’échantillon de maléate de chlorphénamine
Pour la préparation de l’échantillon, il s’agit de peser 3 comprimés dosés à 4 mg puis peser 3 fois l’équivalent en poudre du poids moyen d’un comprimé, soit ~1/3 de la masse totale.
Cette prise d’essai est mise dans une fiole jaugée de 10 ml et complétée à la jauge avec de l’eau ultra pure.
Après passage au bain à ultrason pendant 10 minutes la solution est filtrée à l’aide d’une seringue et d’un filtre cartouche de 0,45μm. La concentration de la prise d’essai est de 1,2 g/l de maléate de chlorphénamine.

Préparation des solutions d’injection

Injection 1 : Solution d’étalonnage de maléate de chlorphénamine 1
Dans un vial de 2 ml,
• 0,3 ml de la solution 3 (étalon secondaire de maléate de chlorphénamine) + 0,2 ml d’eau ultra pure
• 0,2 ml de la solution 4 (Standard de diclofénac)
• 0,3 ml de la solution 2 (Tampon pH=6,8 6,6mM)
Les concentrations dans l’injection 1 sont de 450 mg/l pour le maléate de chlorphénamine et 200 mg/l pour le diclofénac.
Injection 2 : Solution d’étalonnage de maléate de chlorphénamine 2 Dans un vial de 2 ml,
• 0,4 ml de la solution 3 (étalon secondaire de maléate de chlorphénamine) + 0,1 ml d’eau ultra pure
• 0,2 ml de la solution 4 (Standard de diclofénac)
• 0,3 ml de la solution 2 (Tampon pH=6,8 6,6mM)
Les concentrations dans l’injection 2 sont de 600 mg/l pour le maléate de chlorphénamine et 200 mg/l pour le diclofénac.
Injection 3 : Solution d’étalonnage de maléate de chlorphénamine 3 Dans un vial de 2 ml,
• 0,5 ml de la solution 3 (étalon secondaire de maléate de chlorphénamine)
• 0,2 ml de la solution 4 (Standard de diclofénac)
• 0,3 ml de la solution 2 (Tampon pH=6,8 6,6mM)
Les concentrations dans l’injection 3 sont de 750 mg/l pour le maléate de chlorphénamine et 200 mg/l pour le diclofénac.

Table des matières

I. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
3.3. Migration électrophorétique
3.4. Flux électro-osmotique (eof)
3.5. Mobilité apparente
3.6. Les différents modes de séparation en EC
3.7. Caractéristiques de la méthode d’analyse par Electrophorèse capillaire
4. VALIDATION D’UNE METHODE ANALYTIQUE
5. VALIDATION PAR PROFIL D’EXACTITUDE
II. OBJECTIFS
1. OBJECTIF GENERAL
2. OBJECTIFS SPECIFIQUES
III. CADRE D’ETUDE ET METHODOLOGIE
1. CADRE ET DUREE DE L’ETUDE
2. METHODOLOGIE
2.1. Appareil d’électrophorèse capillaire
2.2. Petit matériel
OUENDO Eddy K.S Mémoire Master 2 APC-MQPSA
2.3. Verrerie
2.4. Réactifs utilisés
3. MISE AU POINT DU PROTOCOLE DE DOSAGE DU MALEATE DE CHLORPHENAMINE
3.1. Préparation des solutions de travail
3.2. Préparation des solutions d’injection
3.3. Conditions d’analyse du maléate de chlorphénamine
4. PARAMETRES A EVALUER
4.1. La sélectivité
4.2. La linéarité
4.3. La fidélité
4.5. La limite de détection
4.6. La limite de quantification
4.7. L’exactitude ou justesse
4.8. Analyse et traitement des données
IV. RESULTATS
1. LA SPECIFICITE
2. LA LINEARITE
3. LA FIDELITE
4. LIMITES DE DETECTION ET DE QUANTIFICATION
4.1. Limite de détection
4.2. Limite de quantification
5. JUSTESSE
6. APPLICATION DE LA METHODE VALIDEE AU DOSAGE D’ECHANTILLONS
6.1. Méthode de calcul du pourcentage en chlorphénamine des échantillons
6.2. Expression des résultats de l’analyse des échantillons
V. COMMENTAIRES ET DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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