Milieux pour l’isolement, l’enrichissement et la conservation des souches

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Caractères bactériologiques

Caractères morphologiques

Ce sont des cocci à Gram positif de 0,8 à 1 μm de diamètre, de forme sphéroïde isolés ou groupés en diplocoques, en courtes chaînettes ou en amas, ayant la forme de grappe de raisin. Ils sont immobiles, non sporulés mais parfois encapsulés [13, 14].

Caractères culturaux

La culture des staphylocoques se fait dans une atmosphère aérobie et humide [15]. Staphylococcus aureus est un germe aéro-anaérobie facultatif. Il croit abondamment sur milieu gélosé ; sur milieux ordinaires, la culture est obtenue en 18 à 24h. S. aureus pousse en présence de fortes concentrations salines (milieu sélectif Chapman).
En bouillon ordinaire, les staphylocoques se multiplient en quelques heures, formant un trouble homogène ou un dépôt [10].
Sur gélose les colonies sont lisses, bombées, brillantes et régulières avec un diamètre de 1-3 mm [15].
La plupart des souches de S. aureus élaborent un pigment qui donne une couleur jaune-orangée aux colonies, les colonies de staphylococcus epidermidis donnent un pigment « blanc porcelaine » [16].
La température de croissance est entre 30°C et 45°C avec un optimum à 37°C et le pH varie entre 4,8 à 9,4 avec un optimum à 7,5.

Caractères biochimiques

La détermination de l’espèce peut être réalisée à l’aide de galeries biochimiques d’identification. Ces systèmes utilisent des tests d’acidification ou d’assimilation des sucres et des tests enzymatiques [16].

Métabolisme glucidique

Le catabolisme glucidique correspond à la dégradation des molécules de glucose permettant la formation de molécules riches en énergie ou dans un but de synthèse de constituants cellulaires [17].
 Utilisation des hydrates de carbone
Les glucides sont utilisés de trois manières différentes par les staphylocoques : soit après conversion par l’action d’isomérases, soit après hydrolyse en sucre simple, soit encore, directement s’ils sont fournis sous forme simple (glucose, fructose, etc.) (fig. 1).
L’assimilation étudiée par voie fermentaire, mais également par voie oxydative se traduit presque toujours par l’accumulation de dérivés acides quelle que soit la voie de dégradation. Ces acides sont responsables d’une variation de pH détectée par le virage de la coloration du milieu grâce à un indicateur coloré qui peut être le bromocrésol poupre (BCP), le rouge de phénol (RP)[18].
Ils existent différentes voies de dégradation du glucide :
• La glycolyse (ou voie d’Embden-Meyerhof) : c’est la première chaîne du catabolisme des glucides, elle s’effectue en anaérobie et aboutit à la formation du pyruvate et de molécules riches en énergie [17]. La glycolyse est la principale voie de dégradation du glucide (fig. 2).

Métabolisme respiratoire : production de la nitrate réductase

Les bactéries, lorsqu’elles possèdent une nitrate réductase, sont capables de transformer les nitrates (NO3-) en nitrites (NO2-) et éventuellement en azote (N2) [24], donnant une coloration rouge en présence d’acide sulfanilique et d’ naphtylamine (Réaction de Griess) [25].
La nitrate réductase est produite par certaines souches de staphylocoques et constitue un des caractères biochimiques et taxonomiques utilisés pour leur identification.
Staphylococcus aureus a un système respiratoire associé à la nitrate réductase, celle-ci utilise le L-lactate comme donneur d’hydrogène. L’essentiel de l’activité nitrate réductase utilisant le L-lactate a été localisée au niveau de la membrane plasmique où elle est souvent couplée à des déshydrogénases. Cependant, elle peut être rencontrée au niveau du cytoplasme [4] (fig. 9).

La résistance à la novobiocine

Les staphylocoques à coagulase négative sont habituellement classés selon le critère de sensibilité ou de résistance à la novobiocine.
La novobiocine est un antibiotique bactériostatique peu utilisé en thérapie, pouvant s’avérer très actif sur les bactéries à Gram positif, en particulier les staphylocoques. Ce sont généralement les souches de Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus cohnii cohnii, Staphylococcus cohnii urealyticum et Staphylococcus xylosus qui sont résistantes à la novobiocine [26].

Habitat et pouvoir pathogène

Le réservoir naturel des staphylocoques est l’homme et les animaux à sang chaud.
Cependant, éliminées dans le milieu extérieur, ces bactéries très résistantes sont fréquemment retrouvées dans l’environnement [16].
La plupart des staphylocoques sont inoffensifs et résident normalement sur la peau et les muqueuses de l’homme et d’autres organismes [27].
Les espèces de staphylocoques peuvent causer une grande variété de maladies chez les humains et chez d’autres animaux. S. aureus est un des pathogènes majeurs dans les infections humaines. Plusieurs autres espèces de staphylocoques sont également impliquées dans les infections humaines, notablement S. saprophyticus, S. epidermidis, S. lugdunensis and S. schleiferi.
L’un des principaux défis du travail de diagnostic quotidien est donc d’identifier les espèces de staphylocoques [27].
Les SCoN peuvent contaminer les prélèvements [28] ; ils sont en règle générale des bactéries opportunistes essentiellement responsables d’infections nosocomiales [29]. Il est important de distinguer S. aureus des CoNS. S. aureus a un potentiel de pathogénicité très important et est responsable aussi bien d’infections nosocomiales que communautaires [30]. S. aureus est responsable d’infections suppuratives superficielles et profondes ainsi que de syndromes liés
à l’action de toxines [16]. Il est devenu un problème majeur de santé publique en raison de l’augmentation de la résistance aux antibiotiques [31].

Généralités sur les streptocoques

Phylogénie, taxonomie et classification

Les streptocoques appartiennent au phylum Clostridia et apparentés. Ce sont des bactéries de faible % en guanine et cytosine [15,32].
Les streptocoques ont été les premières espèces provoquant des maladies contagieuses à être étudiées [33].
En 1877, BILROTH et EHRLICH ont donné le nom de Streptococcus à des cocci formant des chaînettes, observées dans les blessures infectées [3]. D’autres savants tels que ANDREWES et HORDER, CLARKE, ABERCOMBRE, SCOTT, GUTHOF, se sont intéressés à d’autres espèces de streptocoques [26, 34].
Lancefield, en 1933 décrit les groupes sérologiques de A à F [35].
Schleifer réalisa la séparation des deux genres Streptococcus et Enterococcus en 1984.
Les infections à streptocoques qui autrefois étaient considérées comme propres aux pays froids et humides sont maintenant fréquentes en zone tropicale particulièrement en Afrique de l’Ouest [36]. La famille des Streptococcaceae comprend 15genres, parmi eux les Streptococcus et les Enterococcus, responsables d’infections graves [3].
Historiquement, la classification des streptocoques est basée sur leurs propriétés sérologiques de paroi décrit par Rebecca Lancefield. Il existe actuellement plus de 100 espèces de streptocoques connues et les classifications continuent d’évoluer [33].
Les streptocoques ne sont pas classés sur des critères cliniques ou de pathogénicité, car la plupart des espèces (commensales ou pathogènes) peuvent être responsables d’infections occasionnant des tableaux cliniques très différents [37].
Ils peuvent être classés et identifiés d’après les 5 types de caractères suivants [38] :
 la morphologie et le groupement des cocci, la présence d’une capsule et l’aspect des colonies ;
 le type d’hémolyse produite sur gélose au sang : ß-hémolyse, α-hémolyse ou absence d’hémolyse ;
 la présence ou non d’un antigène lié à un polysaccharide de paroi et spécifique de groupe ;
L’identification des espèces de streptocoques est traditionnellement fondée sur le groupement sérologique de Lancefield et sur les réactions hémolytiques [39].
Parmi les groupes antigéniques désignés par Rebecca Lancefield par des lettres (de A à H, et de K à V), les groupes A, B, C ou G caractérisent les espèces de streptocoques ß-hémolytiques les plus pathogènes. Les streptocoques α-hémolytiques ou non hémolytiques appartiennent à d’autres groupes ou sont non-groupables, et sont habituellement commensaux.
 Un ensemble de caractères biochimiques ;
Quelques tests suffisent à compléter l’identification des espèces ß-hémolytiques des groupes A, B, C ou G, et celle des pneumocoques. Une galerie complète de tests est nécessaire pour identifier les autres espèces.
 La sensibilité aux antibiotiques
La pénicilline G est active sur les streptocoques, mais à des degrés divers selon les espèces. Certaines souches de pneumocoques ont acquis une résistance relative aux pénicillines [38].

Caractères bactériologiques

Les streptocoques, cocci en chainettes, sont immobiles, dépourvus de catalase et d’oxydase. Ils sont positivement colorés au Gram [4]. La plupart des souches de streptocoques sont anaérobies aéro tolérants [32, 40], cependant, certaines sont anaérobies strictes [40]. Cependant certaines souches requièrent un milieu enrichi en CO2 pour croître, alors que d’autres sont anaérobies strictes [4].

Caractères morphologiques

Les streptocoques se présentent sous forme de cocci à Gram positif ovoïdes, sphériques ou lancéolés de 0,5 à 1 mm de diamètre non mobiles et non sporulés.
Ils forment des paires (diplocoques : Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis) ou le plus souvent des chaînettes de longueur variable se présentant comme une suite de diplocoques liés par du matériel de la paroi cellulaire. Les streptocoques ne possèdent pas de capsule externe autour de la paroi, sauf chez les formes S (smooth) des pneumocoques, irrégulièrement et transitoirement (cultures jeunes) chez certaines souches des groupes A et C [26, 41, 42].

Caractères culturaux

La culture de nombreuses espèces de streptocoques exige des milieux nutritifs enrichis de sang ou de sérum. Les milieux gélosés nutritifs (gélose nutritive ordinaire, gélose trypticase soja, milieu de Müeller Hinton, gélose Columbia additionnés de 5 % de sang de cheval ou de mouton) conviennent très bien.
La température optimale de croissance est de 35 à 37°C [26]. La croissance est optimale en anaérobiose ou en présence de 10 % de CO2.
Les entérocoques ont la particularité de se multiplier dans des milieux usuels à base de peptone ou en l’absence de facteurs de supplémentation et de croitre aussi sur milieu hyper salé contenant 6,5 g/l de NaCl [34].

Caractères biochimique

Utilisation des hydrates de carbones

L’acide pyruvique issu de la glycolyse sert d’accepteur d’électrons. Sous l’action de la lactate déshydrogénase, il est réduit en acide lactique par le NADH, H+ dans l’étape glycéraldhyde-3-P/ 1, 3-bisphosphoglycerate. Les espèces des genres Streptococcus et Enterococcus réalisent cette voie homofermentaire [42] (fig. 11).

Hydrolyse de l’esculine

L’esculine est un glucoside dérivé de la coumarine (dioxycoumarine et glucose). Les streptocoques du groupe D hydrolysent l’esculine en aglycone qui, en présence de sels de fer, donne une coloration noire [4].
Les entérocoques se différencient des autres streptocoques par leur capacité d’hydrolyser l’esculine [43] (fig. 12).

groupage antigénique

Il se fait à l’aide d’un antisérum monovalent dirigé contre l’antigène polyosidique spécifique du groupe de la paroi. Plusieurs techniques existent :
 la technique de LANCEFIELD, (cf. classification),
 la précipitation en milieu gélosé par contre immunoélectrophorèse,
 l’immunofluorescence directe [4].

sensibilité à l’optochine

L’optochine est un dérivé proche de la quinine. Les autres streptocoques sont résistants à l’optochine et se multiplient jusqu’au contact du disque.
Cependant, 0,5 à 5% des pneumocoques sont résistants à l’optochine et quelques streptocoques viridans sont sensibles à l’optochine [37].

Habitat et pouvoir pathogène

Les streptocoques sont commensaux de la cavité buccale, de l’intestin, de la peau et des voies génitales [26].
Les principales espèces pathogènes sont :
 S. pyogenes ou streptocoques ß-hémolytiques du groupe A,
 S. agalactiae ou streptocoques ß-hémolytiques du groupe B,
 S. pneumoniae ou pneumocoques,
 Streptocoque C : S. equi, S. dysgalactiae,
 Commensaux opportunistes : S. oralis, S. sanguis, S. salivarius,
 Entérocoques : E. faecalis, E. faecium [38].
Lorsque ces bactéries pathogènes sont présentes transitoirement et en faible quantité sur les muqueuses ou les téguments, on parle de « portage » et de porteurs sains. Parmi les streptocoques, les espèces commensales appartiennent à la flore normale des muqueuses de l’homme. Ce sont les streptocoques oraux (commensaux de l’oropharynx) et les streptocoques du groupe D (commensaux de l’intestin). Dans certaines circonstances ces bactéries commensales deviennent pathogènes opportunistes et peuvent être responsables d’infections, notamment de septicémies ou d’endocardites [38, 3].
 Le streptocoque β-hémolytique du groupe A a une grande importance en bactériologie médicale car ce germe est responsable de la majorité des infections humaines à streptocoque [40].Les angines à streptocoques sont fréquentes chez les enfants avec une prédilection entre 5 – 10 ans. Les infections de la sphère rhinopharyngée non traitées peuvent provoquer de graves complications telles que :
• Rhumatisme articulaire aigu (RAA) avec atteinte cutanée et surtout cardiaque (endocardite, myocardite, péricardite et risque de séquelles valvulaires),
• Glomérulonéphrite aiguë post-streptococcique, pouvant provoquer une insuffisance rénale chronique [44].
Les infections à streptocoques hémolytiques du groupe A occupent la 2e place des statistiques cardiaques dans les villes africains [3].
 S. agalactiae est un hôte normal du tube digestif, des voies respiratoires supérieures et des voies génitales féminines [45]. S. agalactiae peut causer la méningite, la septicémie néonatale et la pneumoniae chez les nouveau-nés, les adultes peuvent éprouver la vaginite, la fièvre puerpérale, infection des voies urinaires, infection de la peau et l’endocardite [40].Le streptocoque B est responsable, chez les sujets immunodéprimés ou atteints d’affections fragilisantes d’infections opportunistes (pneumopathies, arthrites, méningites, cellulites, endocardites) [45].
 S. pneumoniae est une des premières causes bactériennes dans le monde de sepsis, de pneumonies, de méningites, d’otites moyennes aigues (OMA), et de sinusites [27]. Elle est responsable d’une morbi-mortalité importante en particulier dans les infections pulmonaires et les méningites [46,47, 48].
 E. faecalis peut être isolé seul ou en association avec d’autres bactéries dans les infections suivantes : otites, sinusites, péritonites, suppurations de plaies chirurgicales d’origine abdominale, septicémies ayant comme points de départ des infections urinaires ou génitales ; les infections urinaires représentent aussi la porte d’entrée d’endocardites surtout chez les personnes âgées [4, 3].

Table des matières

IntroductioN
I. Généralités sur les staphylocoques
I.1. Phylogénie, taxonomie et classification
I.2. Caractères bactériologiques
I.2.1. Caractères morphologiques
I.2.2.Caractères culturaux
I.2.3. Caractères biochimiques
I.3. Habitat et pouvoir pathogène
II. Généralités sur les streptocoques
II.1. Phylogénie, taxonomie et classification
II.2. Caractères bactériologiques
II.2.1. Caractères morphologiques
II.2.2. Caractères culturaux
II.2.3. Caractères biochimiques
II.2.3.1.Utilisation des hydrates de carbones
II.3. Habitat et pouvoir pathogène
I. Cadre d’étude
II. Souches bactériennes
III. Matériel et réactifs
III.1.Matériel pour l’identification
III.2. Matériel pour la préparation de l’inoculum
III.3. Matériel pour la conservation des souches
III.4. Milieux pour l’isolement, l’enrichissement et la conservation des souches
III.5. Milieux pour l’identification
III.6. Réactifs pour l’identification des souches
IV. Méthodologie
IV.1. Réisolement et réidentification des souches bactériennes
IV.2. Préparation milieux de culture liquides
IV.2.1. Contrôle de qualité des milieux liquides
IV.2.2. Préparation et conditionnement des plaques déshydratées
IV.2.3. Contrôle de qualité des microplaques d’identification déshydratées
IV.3. Mode opératoire de l’étude sur les microplaques Micro-CSB
IV.3.1. Préparation inoculum bactérien
IV.3.2. Ensemencement et incubation des microplaques
IV.4. Calcul des probabilités et élaboration des algorithmes des staphylocoques et des streptocoques
IV.5. Validation de la méthode
IV.5.1. La répétabilité
IV.5.2. la reproductibilité
V. RESULTATS
V.1. Identification de S. aureus
V.2. Identification de S. saprophyticus
V.3. Identification de S. pneumoniae
V.4. Identification d’Enterococcus faecalis
V.5. Identification de S. pyogenes
V.6. Identification de Streptococcus agalactiae
V.7. Les résultats de la réduction du délai de lecture des tests de VP et des décarboxylases
VI.DISCUSSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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