Microscopie non lineaire : chiralite et generation de second harmonique

A toute époque, les progrès de l’Optique ont contribué aux avancées dans la connaissance du vivant. En biologie cellulaire, le microscope reste l’outil central et de nombreuses découvertes, y compris durant les vingt dernières années, sont la conséquence directe du développement de cette technique, en particulier dans le domaine de l’imagerie fonctionnelle tri-dimensionnelle. L’origine du premier microscope est difficile à dater avec précision. Aux environs de 1595, Zacharias Janssen met au point un ensemble de trois lentilles montées dans un tube qui permet d’imager non pas directement l’objet comme dans le cas d’une loupe, mais l’image agrandie par une optique annexe appelée objectif. Ce microscope grossit entre 3 et 10 fois, il possède de nombreuses aberrations, la lumière traversant des lentilles de courtes focales sous des angles importants. En 1660, Antoine Von Leeuwenhoek développe un microscope utilisant un globule de verre de 6 mm de diamètre (il fabrique des lentilles biconvexes dont il garde le secret). L’objet est placé à l’extrémité d’une tige que l’on déplace grâce à une vis à crémaillère, le tout est placé dans une monture en bois et grossit entre 50 et 300 fois. Il s’agit du microscope simple. Von Leeuwenhoek était drapier à Delft, il avait créé son premier microscope pour contrôler la qualité des toiles tissées, mais s’intéresse plus aux sciences du vivant. Il a donné naissance à l’histologie et à la protistologie (étude de la formation des tissus vivants). Il découvre en 1677 les spermatozoïdes, les globules rouges, les protozoaires (eucaryotes unicellulaires d’origine animale) malgré les distorsions importantes des images. A la fin du XVIIe siècle, Hooke améliore encore le dispositif et introduit un oculaire : c’est le microscope composé. Le microscope devient alors un produit commercial.

A. Effets non linéaires 

Lorsque le champ électrique d’une onde incidente possède une intensité comparable à celle du champ responsable de la cohésion de la matière, il est possible de générer des effets non linéaires. Le champ électrique liant un électron au noyau d’hydrogène vaut typiquement 5.10¹¹ V/m, le champ électrique associé à l’onde émise par un laser pulsé où la durée des impulsions vaut 100 fs et l’énergie 1 mJ pour un faisceau d’1 mm vaut 2.10⁹ V/m. Dans ces conditions la matière répondra de façon non linéaire au champ incident, le champ électromagnétique rayonné pourra se décomposer comme une série d’harmoniques du champ incident. Cette comparaison d’ordres de grandeur permet de comprendre la liaison extrêmement forte existante entre les lasers pulsés et l’électromagnétisme non linéaire. En effet, anciennement, les lampes à arc les plus puissantes (500W) en utilisant un condenseur placé à 10 cm des électrodes et de 10 cm de diamètre focalisant le faisceau dans un disque d’1mm de diamètre, ne permettaient pas d’obtenir des intensités de champ supérieur à 10⁵ V/m, valeur de quatre ordres de grandeur inférieur aux 2.10⁹ V/m cités précédemment.

C’est donc l’avènement des lasers pulsés qui permit de travailler sur des signaux harmoniques d’intensité suffisamment confortable et de réaliser de nombreuses études des interactions non linéaires entre la lumière et la matière.

Polarisation

Dipôle individuel 

En se plaçant à l’échelle atomique, un champ électrique extérieur déforme le nuage électronique des molécules (pour des effets non résonnants). Les barycentres des charges de signe opposé sont déplacés, un moment dipolaire est donc induit par le champ extérieur. Le déplacement des deux barycentres est proportionnel aux puissances multiples du champ électrique.

Une polarisation macroscopique permanente peut être présente dans le milieu en l’absence de tout champ extérieur comme pour les ferroélectriques, (distribution non isotrope des dipôles permanents). Un dipôle n’est pas uniquement soumis au champ extérieur, il subit le champ créé par les autres dipôles qui l’entourent. La résultante de ces deux contributions est notée sous la forme d’un champ local : El. La quantité permettant de relier le champ électrique extérieur (E(ω)) à la polarisation est appelée susceptibilité linéaire (χ). Elle dépend de la densité volumique N de dipôles.

Lorsque le champ extérieur devient non négligeable vis-à-vis du champ reliant les électrons aux noyaux, il faut tenir compte des non linéarités induites à l’ordre 2 et plus.

On obtient la susceptibilité du second ordre en sommant les hyperpolarisabilités individuelles. Il en résulte un moyennage oientationnel des hyperpolarisabilités définies dans le repère moléculaire. Des composantes peuvent être non nulles pour une molécule individuelle et se moyenner à zéro suivant l’arrangement spatial de l’assemblée de molécules.

Fluorescence excitée à deux photons 

Définition 

L’émission d’un signal de fluorescence à partir d’un niveau excité d’un chromophore est précédée d’une excitation qui porte le système dans cet état excité. Cette excitation se fait dans notre étude par l’absorption de deux photons de caractéristiques identiques [GöppertMayer, 1931], nous parlerons de fluorescence excitée à deux photons (TPEF).

Fluorescence

Considérons un fluorophore non plus comme un simple dipôle, mais comme ayant une certaine structure et donc des degrés de libertés supplémentaires. Alors, les états |e> et |f> sont remplacés par de nombreux états rotationnels et vibrationnels (Figure I)A.3). La différence d’énergie entre la somme des deux photons d’excitation et celui de désexcitation ou de fluorescence est appelé le décalage de Stokes (Stokes shift). Il vaut ∆E avec ∆E = ∆E1 + ∆E2, cette énergie se retrouvant sous forme de transfert thermique dans le milieu. (Il vaut 30 nm pour la fluorescéine à pH 13 et une excitation à 500 nm à un photon).

Génération de second harmonique 

Définition

A la différence de la fluorescence la génération de second harmonique (SHG) est un phénomène cohérent, c’est-à-dire que le signal généré possède une phase non aléatoire, corrélée avec l’excitation. Les champs harmoniques rayonnés par différents centres émetteurs pourront alors interférer entre eux. Cette cohérence en SHG n’est possible que s’il n’y a pas d’absorption du rayonnement incident puis réémission, comme dans le cas de la fluorescence.

La puissance rayonnée par une assemblée d’harmonophores à partir de I.A-18 est obtenue suite à un moyennage spatial des composantes tensorielles des hyperpolarisabilités. Un milieu homogène peut être invariant par une symétrie centrale, il est dit : « centrosymétrique », c’est le cas par exemple d’un liquide ou d’un gaz composés de molécules achirales. Dans un milieu centrosymétrique, les susceptibilités d’ordre pair sont nulles, il ne peut pas y avoir d’effets non linéaires d’ordre 2 dans un tel milieu, donc pas de génération de second harmonique.

Par contre, dans le cas d’une surface cette invariance est brisée. Il est alors possible de produire un signal de second harmonique. Ce signal est même extrêmement sensible à l’organisation de la surface à l’échelle moléculaire [Heinz, 1991], [Shen, 1989].

SHG de surface :
L’utilisation de l’optique non linéaire pour sonder des surfaces est une méthode d’investigation très riche. Sa sensibilité est spécifique de la surface sondée. La mesure du signal de SHG réfléchi par la surface et résolu en polarisation fournira des informations sur les propriétés optiques non linéaires des molécules sondées et leur organisation à la surface.

Calcul de l’intensité du signal de SHG réfléchi :
Considérons une couche d’épaisseur a, écrivons l’intensité du signal de second harmonique généré par la surface.

Table des matières

Introduction
I) Cadre théorique
Introduction
A. Effets non linéaires
i. Polarisation
ii. Fluorescence excitée à deux photons
iii. Génération de second harmonique
iv. Utilisation de la SHG et TPEF en microscopie non linéaire
B. Activité optique
i. Activité optique dans le domaine linéaire
ii. Effets non linéaires du second ordre
iii. Génération de second harmonique par un film de molécules chirales
iv. Modélisations microscopiques de la chiralité
C. Conception de colorants membranaires
i. Chiralité des colorants membranaires
ii. Caractéristiques
Conclusion
II) Techniques expérimentales
Introduction
A. Spectrofluorimètre à deux photons
i. Principe de fonctionnement
ii. Construction et caractéristiques
iii. Procédures de réglages
B. Expérience de génération de second harmonique en surface
i. Montage optique
ii. Détections
C. Microscope à balayage
i. Principe de fonctionnement
ii. Reconstruction des images
iii. Objectifs
iv. Résolution
D. Vésicules unilamellaires géantes
i. Membranes phospholipidiques
ii. Electroformation
iii. Observation
III) Etude d’un colorant chiral : l’ASTB
Introduction
A. Obtention et caractérisation de l’ASTB
i. Obtention de l’ASTB
ii. Fabrication d’un film d’ASTB
iii. Spectres d’absorption de l’ASTB
iv. Spectre de fluorescence excitée à deux photons de l’ASTB
B. Génération de second harmonique en surface de l’ASTB
i. Expériences d’ORD
ii. Expériences de CD
iii. Expériences de LD
iv. Activité optique
C. Utilisation de l’ASTB en microscopie
i. Insertion membranaire
ii. Imagerie de SHG et de TPEF
iii. Toxicité
iv. Exemple
D. Perspectives
i. Efficacité en SHG
ii. Insertion membranaire
Conclusion
IV) Microscopie non linéaire basée sur des contrastes endogènes : étude et applications
Introduction
A. Contraste endogène en microscopie multiphotonique
i. Sources de contraste
ii. Exemples
iii. Comparaison avec l’histologie classique
B. Propriétés de fluorescence de l’élastine et de SHG du collagène
i. Elastine
ii. Collagène
C. Application de la microscopie non linéaire à l’étude du tissu vivant
i. Matériel biologique
ii. Effets du lindane sur le système vasculaire du Rat
D. Effets de la saxitoxine sur les cellules cardiaques
i. Motivations
ii. Expériences réalisées
iii. Résultats
Conclusion

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