MICROMETHODES D’ETUDE IN VITRO DE LA SENSIBILITE DES GERMES AUX ANTIBIOTIQUES

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LES ANTIBIOTIQUES

DEFINITION DES ANTIBIOTIQUES

Les antibiotiques sont, au sens strict, des agents antibactériens naturels d’origine biologique et inhibant la croissance d’autres micro-organismes. Ils sont élaborés par des micro-organismes (champignons et diverses bactéries).
Cependant, avec le développement des méthodes de synthèse et d’hémisynthèse, cette définition trop réduite a été modifiée. On appelle antibiotique « toute substance qui, à faible concentration, inhibe la croissance bactérienne ».
Un antibiotique est donc une substance naturelle (ex : Pénicilline G), semi-synthétique (ex : Ampicilline) ou synthétique (ex : chloramphénicol) douée d’une activité antibactérienne à l’échelon moléculaire s’exerçant au niveau d’une ou de plusieurs étapes métaboliques ou d’un équilibre physico-chimique.
Les réactions inhibées par les antibiotiques sont surtout des réactions de synthèse : – synthèse protéique ;
– synthèse du peptidoglycane ;
– synthèse des acides nucléiques ;
– synthèse des folates.
Pour être efficace, l’antibiotique doit satisfaire les trois conditions suivantes :
– pénétration à l’intérieur de la bactérie ;
– intervention au niveau d’une cible à l’intérieur de cette bactérie ;
– l’antibiotique ne doit pas être inactivé par des enzymes pouvant être synthétisées par cette bactérie.
L’action de l’antibiotique se traduit alors soit :
– par des modifications de la croissance : dans ce cas, l’antibiotique est bactériostatique ;
– par des modifications de la capacité de survie : dans ce cas, l’antibiotique
est bactéricide.

CLASSIFICATION

Bêta-lactamines

Cette famille, dont le représentant le plus ancien est la Pénicilline G, comprend plus de cinquante produits utilisés en thérapeutique ; la plupart étant obtenue par hémi-synthèse. La structure du noyau de base, comportant toujours le cycle β-lactame permet de répartir ces produits en trois groupes :

Premier groupe

μ Pénams
Leur noyau de base associe un cycle β-lactame à un cycle thiazolidine, correspondant aux pénicillines. Elles se distinguent par la nature du radical fixé sur le carbone 6 et se répartissent en cinq sous-groupes :
◘ le groupe de la pénicilline G (benzylpénicilline) qui a pour spectre d’action les bactéries à Gram positif et les cocci à Gram négatif, à l’exception des souches productrices de pénicillinases. Il comprend la pénicilline G, ses formes retard et quelques pénicillines orales (pénicilline V, phénéticilline, propicilline, clométhicilline).
◘ les pénicillines anti-staphylococciques, résistantes à la pénicillinase du staphylocoque : méthicilline et isoxazolyl – pénicillines (oxacilline, cloxacilline, dicloxacilline) ;
◘ les pénicillines à large spectre, actives aussi sur certains bacilles à Gram négatif mais sensibles à l’action de la pénicillinase du staphylocoque ou des β-lactamases des Gram négatif ;
◘ les aminopénicillines (ampicilline, amoxycilline, épicilline) ne sont jamais actives sur Pseudomonas aeruginosa.
Par contre, les carboxypénicillines (carbénicilline et ticarcilline) et l’apalcilline peuvent être actives sur ce germe.
◘ les amidinopénicillines (amidinocilline ou mecillinam et pivmécillinam) ne sont actives que sur les bacilles à Gram négatif ;
◘ les inhibiteurs de β-lactamases, produits dont le radical R6 est un halogène (I ou Br) ou pénicillines-sulfones notamment le sulbactam.
μ Pénems
Ils se distinguent des pénams par l’existence d’une double liaison.
μ Carbapénems
La N-formidoyl-thiénamycine ou imipénème est le seul produit de ce groupe actuellement utilisé. Doté d’un large spectre d’action, il est remarquable par sa grande stabilité vis-à-vis de diverses β-lactamases.
μ Oxapénams ou clavams
Le représentant de ce groupe est l’acide clavulanique, d’activité antibactérienne très faible mais utilisé comme inhibiteur de β-lactamases en association avec l’amoxycilline ou la ticarcilline.

Cyclines

Les principaux produits sont : la tétracycline, l’oxytétracycline, la déméthylchlortétracycline, la rolitétracycline, la métacycline, la doxycycline et la minocycline.
Les tétracyclines sont des antibiotiques à large spectre, seulement bactériostatiques. Leur activité s’étend aux Rickettsies, Chlamydiae et Mycoplasmes.

Phénicolés

Ce sont des antibiotiques bactériostatiques à large spectre dérivés de l’acide dichlor-acétique, nous distinguons : le Chloramphénicole et le Thiemphénicole

Quinolones

On peut les diviser en deux groupes :
1 les produits les plus anciens ne sont pratiquement actifs que sur les bacilles à Gram négatif, principalement les entérobactéries, et ne sont indiqués que dans le traitement des infections urinaires. Ils comprennent l’acide nalidixique, produit le plus ancien, l’acide piromidique et la cinoxacine d’activité comparable, l’acide oxolinique, l’acide pipémidique et la fluméquine plus actifs in vitro.
1 les produits les plus récents sont particulièrement intéressants par leur activité plus grande, par leur spectre plus large et par leur pharmacocinétique.
A côté des produits en cours d’étude, ceux actuellement utilisés sont la péfloxacine, l’énoxacine, l’ofloxacine, la ciprofloxacine, la norfloxacine.

Les 5-nitro-imidazolés

Leur spectre particulier est limité aux bactéries anaérobies. Quatre produits, d’activité comparable, sont utilisés : le métronidazole, l’ornidazole, le secnidazole et le tinidazole.

Nitrofuranes

Leur spectre est large et en raison de leur pharmacocinétique, ils ne sont utilisés que pour traiter des infections urinaires ou intestinales.

Sulfamides

Ce sont les plus anciens des agents antibactériens d’usage thérapeutique [DOMAGK, 1935]. Les produits disponibles sont en nombre limité. Citons : la sulfadiazine, le sulfamoxole, le sulfaméthoxazole, la sulfaguanidine, la salazosulfapyridine, le sulfadoxine.
Le spectre des sulfamides est théoriquement large, mais certaines espèces présentent une résistance naturelle. De plus, nombreuses sont les souches, de toutes espèces, qui ont acquis une résistance. L’action des sulfamides est seulement bactériostatique.

Les 2-4 diaminopyrimidines

Le plus utilisé est le triméthoprime. Leur activité est habituellement bactériostatique, parfois bactéricide. Leur spectre d’action est large, mais de nombreux groupes bactériens possèdent une résistance naturelle.

Associations sulfamides-diaminopyrimidines

Les sulfamides et les 2-4 diaminopyrimidines sont fréquemment prescrits en association. Cette association est souvent synergique et bactéricide si la souche est sensible aux deux composés. La première association utilisée fut l’association triméthoprime-sulfaméthoxazole. D’autres diaminopyrimidines sont susceptibles d’être utilisées, tel le tétroxoprime.

Antifoliques

Les sulfones sont comme les sulfamides, des analogues structuraux de l’acide para-aminobenzoïque (PAB) et sont utilisés dans le traitement de la lèpre.
L’acide para-amino-salicylique (PAS), antituberculeux mineur, est un autre analogue structural du PA.

Polypeptides

Ce sont des antibiotiques bactéricides à spectre étroit : les polymyxines. Elles sont produites par diverses espèces de Bacillus. Deux d’entre elles sont utilisées en thérapeutique, la polymyxine B et la Polymyxine E ou colistine.

DIFFERENTES METHODES D’ETUDE DE LA SENSIBILITE

Effectuer un test de sensibilité d’une bactérie suppose disposer d’une souche pure, donc un isolement et une identification de la bactérie incriminée à partir du produit pathologique

Macrométhode d’étude in vitro de la sensibilité des antibiotiques

La détermination de l’effet bactériostatique et de l’effet bactéricide d’un antibiotique repose sur des faits expérimentaux.
Lorsque l’on met en contact des bactéries avec un antibiotique et que l’on suit la survie bactérienne en fonction du temps, on observe les phénomènes qui diffèrent selon la concentration d’antibiotique.
• Pour les plus basses concentrations (0,5 à 2µg/ml), on observe un ralentissement de la croissance bactérienne, mais à tout moment le nombre de bactéries est supérieur ou égal au nombre initial des bactéries : l’antibiotique exerce alors un effet bactériostatique. Cet effet résulte soit :
– d’un ralentissement du temps de division bactérienne ;
– d’un équilibre entre la croissance normale et la destruction des bactéries.
• Pour des concentrations plus élevées (4,8 à 16µg/ml), on constate une réduction du nombre de microorganismes au cours du temps ; l’antibiotique exerce un effet bactéricide.
Parfois l’action antimicrobienne est partielle et après une détermination précoce du nombre de bactéries, on observe une reprise de la croissance bactérienne.
Ce phénomène dit de “rebond” peut être dû à :
– une instabilité de l’antibiotique in vitro ;
– une hétérogénéité de la population bactérienne qui peut comporter un nombre de bactéries génotypiquement plus résistantes que l’ensemble de la population ;
– une induction d’enzymes conférant une résistance des bactéries à l’antibiotique, par exemple les bêta-lactamases.
L’action d’un antibiotique sur une souche bactérienne peut ainsi être caractérisée par sa concentration minimale inhibitrice.
• Définition de la CMI d’un antibiotique [1, 24, 28]
La CMI est la plus faible concentration d’antibiotique inhibant en 18 à 24 heures la multiplication des bactéries (bactériostase). Cette valeur permet de classer une souche bactérienne dans les catégories « sensible », « résistante » ou « intermédiaire » à l’action d’un agent antibactérien.
Une souche est dite « résistante » à un antibiotique, lorsque la CMI de l’antibiotique est trop élevée pour être atteinte in vivo sans utiliser des doses toxiques.
A l’opposé, une souche est dite « sensible » à un antibiotique lorsque sa CMI est nettement inférieure à la concentration sanguine après administration d’une dose utilisable en thérapeutique. Si la CMI se situe entre ces deux extrêmes, la sensibilité de la souche bactérienne est dite « intermédiaire » : les microorganismes ne pourront pas être atteints avec un antibiotique « standard ».
La détermination de la CMI d’un antibiotique sur une souche bactérienne est réalisée en recourant à une méthode par dilution, par diffusion ou par élution.
Quelle que soit la méthode utilisée, elle doit être effectuée dans des conditions standardisées :
– milieu de culture adéquat choisi en fonction du germe à tester par exemple le milieu de Mueller-Hinton supplémenté en ions (Ca2+ et Mg2+) ;
– inoculum bactérien entre 105 à 106 bactéries/ml.

Méthode par dilution en milieu liquide

On distribue dans un premier temps, dans une série de tubes à hémolyse stériles, sous un même volume des concentrations décroissantes d’antibiotique. Puis on ajoute dans chacun des tubes, sous un même volume, une culture de bactéries en phase exponentielle de croissance, diluée de façon à obtenir une concentration finale d’environ 106 bactéries /ml. La CMI de l’antibiotique sur la souche est définie comme la faible concentration inhibant après 18 à 24h de contact à 37oC toute croissance bactérienne visible à l’œil.

Méthode par dilution en milieu solide

Le principe de la technique en milieu solide est le même que celui de la méthode par dilution en milieu liquide.
Des concentrations croissantes de l’antibiotique sont réalisées et chaque concentration est incorporée à un milieu gélosé.
Des boîtes de Pétri peuvent être ensemencées avec plusieurs souches bactériennes à l’aide d’un ensemenceur «multipointe ».
La CMI correspond à la plus faible concentration d’antibiotique inhibant la formation de colonies visibles.
C’est la méthode de référence. Elle permet en outre de tester un grand nombre de souches vis-à-vis d’un même antibiotique [7].
En pratique, on utilise la gélose MH. Son épaisseur doit être de 4 mm. Pour les micro-organismes exigeants, on utilise des milieux plus riches (gélose au sang).
L’inoculum bactérien est obtenu à partir d’une souche pure et jeune (culture de 18h).
La concentration finale de l’inoculum varie de 105 à 106 bactéries/ml pour les Anaérobies.
L’ensemencement se fait par inondation ou par écouvillonnage. Cependant, ces deux techniques sont très laborieuses et ne sont pas habituellement appliquées à la détermination en « routine » de l’activité d’un grand nombre d’antibiotiques sur une souche bactérienne. Pour cela, on utilise la méthode par diffusion ou méthode par disques.

Méthode par diffusion : méthode des disques

Des disques de papier buvard, imprégnés d’une quantité définie d’antibiotique, sont déposés à la surface d’un milieu gélosé préalablement ensemencé avec une suspension de bactéries en phase exponentielle de croissance.
A partir du disque, l’antibiotique diffuse dans la gélose, sa concentration étant plus faible qu’on s’éloigne de la source (gradient de concentration).
Après une incubation du milieu de culture (18 heures à 37oC), on constate que chaque disque est entouré d’une zone d’inhibition de croissance bactérienne ; la multiplication des micro-organismes s’arrête là où il existe dans la gélose une concentration d’antibiotique supérieure ou égale à la CMI.
Pour chaque antibiotique, on mesure le diamètre d’inhibition de la croissance bactérienne et on en déduit la valeur (approchée) de la CMI de l’agent antimicrobien vis à vis de la souche étudiée. En effet, pour un antibiotique donné, une relation existe entre la valeur du diamètre d’inhibition de croissance et celle de la CMI. Celle-ci étant établie par des études comparatives préalables portant sur un grand nombre de souches appartenant à des espèces bactériennes différentes, il faut signaler que la gélose de Mueller-Hinton doit avoir une épaisseur de 4 mm et être séchée avant emploi.

E-test (Epsillometer test)

Le E-test est une technique de détermination de la CMI basée sur l’utilisation de bandelettes imprégnées d’un gradient exponentiel prédéfini de l’antibiotique à tester couvrant une zone continue de 0,016 à 256 mg/l ou 0,002 à 32 mg/l en fonction des molécules.
Le E-test associe les caractéristiques des méthodes de diffusion et de dilution en milieu solide.
Les bandelettes sont des supports inertes, hydrophobes de 5 mm de large et 50 mm de long. Elles sont appliquées sur la surface d’une gélose préalablement ensemencée avec la souche à étudier. Après incubation, l’inhibition de la croissance se traduit par la présence d’une ellipse dont le point d’intersection avec une bandelette définit la CMI.
Cette nouvelle méthode de mesure de la CMI présente les avantages des méthodes de diffusion : simplicité, rapidité, large choix des molécules à tester.
Cependant, la mise en place des bandelettes et l’interprétation sont délicates.

METHODES AUTOMATIQUES

* Système à deux concentrations d’antibiotiques
La croissance bactérienne est mesurée en présence de deux concentrations critiques basse et haute de l’antibiotique. La lecture se fait au photomètre après 24 h de croissance.
* Système rapide à un seul antibiotique
Une seule concentration d’antibiotique indépendante des concentrations critiques est choisie. Le résultat est obtenu au bout de 3 à 6 heures.

MICROMETHODES D’ETUDE IN VITRO DE LA SENSIBILITE DES GERMES AUX ANTIBIOTIQUES

Méthode utilisant deux concentrations critiques

Les concentrations en antibiotique qu’il est possible d’obtenir dans l’organisme se définissent par une zone de taux thérapeutique délimitée par deux valeurs critiques exprimées en µg/ml.
• La concentration critique inférieure (CCI) correspond au taux sanguin moyen obtenu aux posologies habituelles.
• La concentration critique supérieure (CCS) correspond au taux sanguin maximal obtenu par l’administration de fortes doses. Avec cette méthode, on peut interpréter directement les résultats de l’antibiogramme.
En effet, on utilise les concentrations critiques supérieures et inférieures fixées par les comités nationaux d’antibiogramme.
Le résultat obtenu est logique :
– la croissance en présence de la plus forte concentration d’antibiotique est le fait de souches résistantes ;
– la croissance en présence de la plus faible concentration est caractéristique des souches intermédiaires ;
– l’inhibition de la croissance aux deux concentrations d’antibiotique est spécifique des souches sensibles.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I – LES BACTERIES
1.1. – STRUCTURE ET SCHEMA GENERAL
1.2. – PAROI BACTERIENNE
1.2.1. – Paroi des bactéries à Gram positif
1.2.2. – Paroi des bactéries à Gram négatif
1.2.3. – Rôle de la paroi bactérienne
1.2.3.1. – Protection de la cellule
1.2.3.2. – Interface avec le milieu extérieur
1.2.3.3. – Cibles des antibiotiques
1.3. – STRUCTURES EXTERNES
1.3.1. – Pili ou fimbiae
1.3.2. – Flagelles
1.4. – FORMATIONS EXCELLULAIRES
1.5. – MEMBRANE CYTOPLASMIQUE
1.5.1. – Structure
1.5.2. – Rôle de la membrane cytoplasmique
1.6. – LE CYTOPLASME
II – LES ANTIBIOTIQUES
2.1. – DEFINITION
2.2. – CLASSIFICATION
2.2.1. – Bêta-lactamines
2.2.1.1. – Premier groupe
2.2.1.2. – Deuxième groupe
2.2.1.3. – Troisième groupe
2.2.2. – Aminosides
2.2.3. – Macrolides, lincosamides, Streptogramines (MLS)
2.2.4. – Cyclines
2.2.5. – Phénicolés
2.2.6. – Quinolones
2.2.7. – 5-nitro-imidazolés
2.2.8. – Nitrofuranes
2.2.9. – Sulfamides
2.2.10 – 2-4 diaminopyrimidines
2.2.11. – Associations sulfamides-diaminopyrimidines
2.2.12. – Antifoliques
2.2.13 – Polypeptides
2.3. – DIFFERENTES METHODES D’ETUDE DE LA SENSIBILITE
2.3.1. – Macrométhode d’étude in vitro de la sensibilité des antibiotiques
2.3.1.1. – Méthode par dilution en milieu liquide
2.3.1.2. – Méthode par dilution en milieu solide
2.3.2. – Méthode par diffusion : méthode des disques
2.3.3. – E-test (Epsillometer test)
2.4. – METHODES AUTOMATIQUES
2.5. – MICROMETHODES D’ETUDE IN VITRO DE LA SENSIBILITE DES GERMES AUX ANTIBIOTIQUES
2.5.1. – Méthode utilisant deux concentrations critiques
2.5.2. – Méthodes utilisant une concentration critique
2.5.3. – Système effectuant une analyse cinétique de la croissance
2.5.4. – Dilution en bouillon
2.5.5. – Avantages et inconvénients
2.5.6. – Facteurs influant l’étude de la sensibilité aux antibiotiques
2.5.6.1. – Facteurs extrinsèques
2.5.6.1.1. – Environnement des cultures
2.5.6.1.2. – Antibiotique
2.5.6.1.3. – Inoculum bactérien
2.5.6.1.4. – Lecture
2.5.6.2. – Facteurs liés à la bactérie
2.5.6.2.1. – Notion de résistance
2.5.6.2.2. – Types de résistance
II.6. – UTILISATION DES RESULTATS DE SENSIBILITE EN CLINIQUE
III – MODELES STATISTIQUES
3.1. – METHODES BIOMETRIQUES D’ETUDE DE LA CROISSANCE ET PREDICTION
3.1.1. – « Microbiologie prédictive »
3.1.2. – Modélisation classique
3.1.3. – Différents types de modèle
3.1.3.1. – Modèles classiques
3.1.3.1.1. Limites de la modélisation classique
3.1.3.2. – Méthode d’interférence Bayésienne
3.1.3.2.1. – Principe
3.1.3.2.2. – Théorème de BAYES
3.1.4. – Ajustement d’un modèle d’étude
3.1.4.1 – Covariance
3.1.4.2 – Coefficient de corrélation
3.1.5. – Modèle de régression simple
3.1.6. – Estimation des paramètres
3.4.7. – Régression non paramétrique
3.4.8. – Méthode des « courbes de concordance »
3.1.9. – Validation du modèle
3.1.9.1. – Linéarité
3.1.9.2. – Normalité des « Affichage de l’histogramme des résidus
3.1.10. – Prévision
3.1.11. – Applications
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I – CADRE DE L’ETUDE
II – POPULATION D’ETUDE
III – MATERIELS ET METHODES
3.1. – MATERIELS
3.2. – RECUEIL DE DONNEES
3.3. – DESCRIPTION MATHEMATIQUE DES DONNEES
IV. LOGICIEL DE TRAITEMENT DES DONNEES
V – RESULTATS
5.1. – PROFIL DE SENSIBILITE DU STREPTOCOCCUS PYOGENES
5.1.1. – Etude de la liaison entre la CMI
et le diamètre d’inhibition
5.1.2. – Choix du modèle de régression linéaire simple
5.1.3. – Application du modèle sur le test avec l’érythromycine
5.1.4. – Application du modèle sur le test avec la teicoplanine
5.1.5. – Application du modèle sur le test avec le levofloxacine
5.1.5.1. – Echec de l’application du modèle sur la Pénicilline G et le Chloramphénicol
5.1.5.2. – Choix du modèle des courbes de concordance
5.1.5.3. – Application du modèle sur le test avec la Pénicilline G
5.1.5.4. – Application du modèle sur le test avec le chloramphénicol
5.2. – PROFIL DE SENSIBILITE DU STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
5.2.1. – Liaison entre la CMI et le diamètre d’inhibition
5.2.2. – Modèle de régression simple pour le test avec la Pénicilline G, l’érythromycine et le chloramphénicol
5.2.3. – Modèle des courbes de concordance sur le test avec la teicoplanine
5.3. – PROFIL DE SENSIBILITE DE HAEMOPHILUS INLUENZAE
5.3.1. – Liaison entre la CMI et le diamètre d’inhibition
5.3.1.1. – Modèle de régression simple pour le test avec l’Ampicillineet le Chloramphénicol
5.3.1.2. – Modèle des courbes de concordance pour le test avec la Levofloxacine
VI – DISCUSSION
CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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