Méthodes moléculaires pour la caractérisation des salmonelles

INTRODUCTION 

Les salmonelles sont des bacilles aéro-anaérobies Gram négatif, hôtes facultatifs du tractus digestif potentiellement pathogènes pour l’ homme et pour les animaux , appartenant à la famille des Enterobacteriaceae . Le genre Salmonella est divisé en deux espèces, Salmonella enterica et Salmonella bongori (très rare). Salmonella. enterica est divisée en 6 sous-espèces, S. enterica subsp. I ( subsp.enterica ) , II ( subsp. salamae ) , III ( subsp. arizonae ) , IIIb( subsp. diarizonae ), IV ( subsp. houtenae ) et VI ( subsp. indica).La sous espèce I, S. enterica subspecies enterica, représente plus de 99,5 % des souches isolées en pathologie. L’identification des espèces et sous-espèces se fait sur la base de caractères biochimiques. Au sein de ces espèces et sous espèces, les souches peuvent être différenciées par la sérotypie (antigènes somatiques O, antigènes flagellaires H et antigènes Vi d’enveloppe) définissant des sérovars ou sérotypes.

La dénomination actuelle des sérovars au sein de la sous-espèce est :
• dans la sous-espèce I, par exemple pour le sérotype Typhimurium : S. enterica subsp. Enterica sérotype Typhimurium ou plus simplement S. Typhimurium;
• dans les autres sous-espèces, les sérotypes sont désignés uniquement par leur formule antigénique. La sous-espèce I comprend, à ce jour, 2 435 sérovars. La contamination est surtout d’origine hydrique. Elle peut être directe (selles, linge souillé, mains sales, urines) ou indirecte (la plus fréquente) par ingestion d’eau ou d’aliments contaminés. [Chez l’homme, les salmonelloses sont à l’origine de deux types de pathologie.

Les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes ou salmonelloses majeures : elles sont dues à S. Typhi, S. Paratyphi A, B ou C, au cours desquelles deux mécanismes d’invasion se superposent :   Un processus entéro-invasif et l’action del’endotoxine (LPS). Après une période d’incubation variable (5 à 30 jours, en général 15 jours), la typhoïde comporte deux phases successives :
– l’apparition séquentielle de symptômes pendant la 1ère semaine : asthénie, céphalées, vertiges, signes digestifs (nausées, anorexie), état fébrile qui atteint 40 °C en quelques jours ;
– une phase d’état à la 2ème semaine, caractérisée par une fièvre en plateau à 40 °C, une diarrhée fétide couleur « jus de melon », des signes cutanés, une hépato-splénomégalie, un état de prostration (tuphos), des urines rares et foncées, parfois des signes respiratoires. Si le diagnostic et le traitement sont précoces, l’évolution est favorable. En absence de traitement, on note des complications digestives (hémorragies, cholécystites), cardiovasculaires, neuroméningées et ostéoarticulaires.

Définition et systématique 

Les Salmonella appartiennent à la famille des ENTEROBACTERIACEAE, bacilles Gram négatifs (BGN), mobiles (exceptés Salmonella pullorum- gallinarum), aéro- anaérobies facultatifs, essentiellement des parasites intestinaux des animaux vertébrés ; ils fermentent le glucose avec dégagement de gaz ; lactose négatif (sauf le genre Arizonæ) ; catalase positive ; H2S positif ; réaction de Vauges Proskauer (VP) négative. Ils sont responsables des fièvres typhoïdes et paratyphoïdes A, B et C. [8] Cette famille des entérobactéries comporte actuellement plus de 120 espèces génomiques.

Dans le genre Salmonella, deux espèces génomiques sont actuellement reconnues : Salmonella enterica l’espèce la plus courante qui renferme sept sous-espèces :
– enterica (I), Salamae (II), arizona (IIIa), diarizona (IIIb), houtenae (IV), indica et (VI) subspecies (VII)) et Salmonella bongori espèce rare. Ces sept espèces et sous-espèces sont différentiables à l’aide de caractères biochimiques. Les travaux de taxonomie moderne, en particulier les hybridations d’acides désoxyribonucléiques, ont montré que le genre Salmonella ne comporte qu’une seule espèce qui comprend elle-même sept sous-espèces facilement différenciables par leurs caractères phénotypiques. Les sous-espèces I, II et IV correspondent respectivement aux sous-genres I, II et IV de Kauffmann. Celles désignées IIIa et IIIb correspondent respectivement aux serovars monophasiques et diphasiques des Salmonella du sous-genre III de Kauffmann, qui furent successivement appelées Salmonella arizona, groupe  ≪Arizona », Arizona arizonae, et Arizona hinshawii. [9] Enfin, la sous-espèce V a été individualisée en 1982, la sous-espèce VI en 1986.

La très grande majorité des Salmonella isolées de l’homme et des animaux à sang chaud appartiennent à la sous-espèce I.

Pathogénie 

Les Salmonella sont des bactéries entéro- pathogènes invasives. A partir d’expérience chez des volontaires sains, la dose infectante a été estimée entre 105- 109 UFC/ml. Cette dose dépendra de plusieurs facteurs dont la virulence du germe, l’acidité gastrique du sujet. Après invasion silencieuse du tube digestif et du système réticulo-endothélial, les salmonelles pénètrent l’épithélium intestinal et l’adhèrent par un mécanisme inconnu, le traversent sans provoquer de lésions importantes pour atteindre la lamina propia et la sous muqueuse. Elles induisent des réactions inflammatoires avec afflux de polynucléaires et de macrophages qui phagocytent les bactéries. Les salmonelles gagnent ensuite les ganglions mésentériques, s’y multiplient et se propagent dans la circulation sanguine par le canal thoracique. Ce qui explique les septicémies ; une partie des salmonelles se lyse avec libération d’une toxine qui va irriter le sympathique abdominal provoquant par son intermédiaire l’ulcération des plaques de Peyer. Cette toxine transportée au niveau des ventricules cérébraux provoque l’abattement, le tuphos d’où le nom de fièvre typhoïde donnée à cette maladie.L’évolution spontanée cyclique de la fièvre typhoïde non traitée est devenue aujourd’hui exceptionnelle.

Antigènes flagellaires ou Antigènes H

Les flagelles sont des polymères de flagélline, molécules de protéine fibreuse, d’un poids moléculaire de 40 000 daltons environ. Ces molécules d’un diamètre de 4 à 4,5 nm sont disposées sur le flagelle comme les torons d’une corde. La composition en acides aminés de la flagelline est constante pour un type antigénique déterminé. Les anticorps H ont deux propriétés importantes : celle de produire une agglutination floconneuse, d’apparition rapide et dissociable par agitation, et celle d’immobiliser les bactéries, quand leur spécificité correspond à celle de l’antigène des flagelles. [8] Certains sérotypes ont un antigène H mono spécifique : quand ils sont mobiles, ils ont un antigène H ayant toujours la même spécificité : ainsi Salmonella Paratyphi A a toujours un même antigène H désigné H : a ; Salmonella Enteritidis l’antigène H : g, m ; Salmonella Typhi l’antigène H : d. La culture de ces souches respectives en présence d’anti- sérum a, g, m, ou d, elles sont immobilisées.

D’autres sérotypes ont un antigène H qui peut présenter deux spécificités totalement différentes. Ainsi une souche de Salmonella Paratyphi B peut être agglutinée, au moment de son isolement, uniquement par le sérum anti- b. Mais si nous les cultivons  sur gélose molle additionnée de ce sérum anti- b, nous constatons qu’elle n’est pas immobilisée et que la culture qui a envahi la surface n’est plus agglutinée par le sérum anti- b. Elle le sera par un autre sérum dénommé anti-1, 2. En fait, nous avons, en cultivant en présence de sérum anti- b, sélectionné les mutants ne possédant pas d’antigène de spécificité b, mais possédant une spécificité autre qui, pour Salmonella Paratyphi B, est toujours 1, 2. Il est possible de faire l’inverse : en cultivant notre deuxième culture en présence de sérum anti-1, 2, nous retrouverons une agglutinabilité dans le sérum anti-b. L’antigène H de Salmonella paratyphi B peut donc exister sous deux phases : b et 1,2. En cultivant en présence du sérum correspondant à la phase apparente, on réalise une inversion de phase.

Bien souvent une culture en nappe de Salmonella Paratyphi B est mixte,l’ agglutinabilité d’emblée par les sérums anti- b et anti-1,2, parce que contenant un mélange de bactéries possédant les unes des flagelles de spécificité b, d’autres des flagelles de spécificité 1,2. Toute culture de Salmonella Paratyphi B cultivée sur gélose molle additionnée à la fois de sérum anti- b et de sérum anti-1,2, est immobilisée. L’étude des antigènes O, H et Vi a abouti à l’établissement d’un catalogue des formules antigéniques, le schéma de KAUFFMANN-WHITE.

Identification d’un sérovars 

L’identification d’un sérovars se fera dans l’ordre suivant :
– Détermination du facteur O majeur caractéristique de groupe ; Seule en pratique Salmonella Typhi peut être O inagglutinable quand il est Sous forme V. Ses caractères biochimiques très particuliers et une forte agglutinabilité dans le sérum anti- Vi permettent aisément l’identification ; le chauffage à 100 °C permet de démasquer l’antigène O : 9 ;
-Détermination de l’antigène H en opérant par ordre de fréquence des sérovars et en s’aidant du schéma de KAUFFMANN-WHITE. Si, cas le plus fréquent, il s’agit d’un sérovars diphasique, il est nécessaire de déterminer les deux phases de l’antigène H. Si ces deux phases ne sont pas directement agglutinables sur la culture, il faudra sélectionner la phase inapparente en ensemencent une gélose pour essaimage (Sven Gard) additionnée de sérum correspondant à la phase apparente. Le diagnostic de sérovars sera établit sur la base de l’association du facteur O majeur et des facteurs H. Si la culture appartient à la sous-espèce 1, on trouvera son nom dans le schéma de KAUFMANN-WHITE en face de la formule correspondante. La variété antigénique du sérovars identifié pourra être précisée en recherchant l’agglutination dans les facteurs accessoires.

Table des matières

1-INTRODUCTION  
OBJECTIFS
Objectif principal
Objectifs spécifiques
2-GENERALITES  
2- 1 Historique 
2-2. Définition et systématique 
2-3.Habitat 
2-4.Physiopathologie 
2-4.1.Pouvoir Pathogène
2-4.2.Pathogénie
2-5. Caractères bactériologiques 
2-5.1.Morphologie et Colorabilité
2-5.2. Caractères culturaux et milieux de cultures
2-5.3. Caractères Biochimiques
2-5.4.Caractères antigéniques
2-5.4.1. Antigène du paroi ou antigène O
2-5.4.2.Antigène d’enveloppe ou antigène Vi
2-5.4.3. Antigène flagellaire ou antigène H
2-5.4.4. Identification d’un sérovars
2-6. Nomenclature 
2-7.Diagnostic biologique 
2-7.1.Méthode directe
2-7.1.1. Sang pour hémoculture
2-7.1.2.Selles pour coproculture
2-7.2. Méthode indirecte
2-7.3.Méthodes moléculaires pour la caractérisation des salmonelles
2-7.3.1.Caractérisation des protéines : analyses des iso enzymes
2-7.3.2. les marqueurs génotypiques pour la caractérisation des salmonelles
2-8. Traitements 
2-8.1. Prophylaxie
3-Methodologie  
3-1. Cadre d’étude 
3-2. Type et période d’étude 
3-3 Collecte et analyse des données 
3-3.1. Interrogatoires
3-3.2 Technique de laboratoire
3-3.2.1 Protocole technique des hémocultures positives
3-3.2.2.Techniques utilisées pour l’identification des bactéries
3 -3.2.2.1.Coloration de GRAM
3-3.2.2.2.Tests d’oxydase
3-3.2.2.3.Tests biochimiques et métabolique : API20E
3-3.2.2.4. Tests de sensibilités aux antibiotiques
3-3.2.2.Protocole et méthode de travail des cultures du LCR et autres liquides biologiques
3-3.2.5. Serogroupage
3-3.2.6. Typage des souches par PCR
3-3.2.6.1.Technique d’extraction de L’ ADN des salmonelles
3-3.2.6.2.Préparation du mélange mix (le master mix )
3-3.2.6.3.la réaction PCR Proprement dite
3-3.2.6.4. Electrophorèse sur gel d’agarose
3.4. Traitement informatique des données 
3.5. Aspects éthiques  
3.5.1. Consentement des malades
3.5.2. Inconvénients potentiels de cette étude
3.5.3. Bénéfices
4. PRESENTATION DES RESULTATS 
5. COMMENTAIRES ET DISCUSSION 
6. CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS 
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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