Soutenance mémoire
Historique
La culture in vitro d’organes isolés de plante date du début du siècle avec les travaux d’HEBERLANDT en 1902. Mais les travaux de WHITE aux Etats-Unis en 1922, sur la croissance indéfinie en milieu liquide de racines de tomate, marquent réellement le début de la culture in vitro. Dès 1934, GAUTHERET obtient, en France, une prolifération cellulaire à partir de prélèvement de tissus cambiaux d’arbres. Avec les résultats de NOBERCOURT en France et de WHITE aux Etats Unis en 1939 sur les tissus tumoraux de tabac, la culture in-vitro va prendre un formidable essor et ouvrir d’extraordinaires potentialités dans de nombreux domaines de la recherche. Les observations sur l’absence de virus dans les méristèmes de tabac virosé ont été faites par LIMASSET ET CORNUET en 1949. MOREL ET MARTIN (1952) , ont mis à profit ces observations et ont entrepris de mettre en culture in vitro des méristèmes de dahlia et de pomme de terre atteints de maladies à virus. A partir de méristèmes, ils ont obtenu des plantes entières qui, remises en culture normale, se sont révélées saines au contrôle.
Dans un tout autre domaine, la culture in vitro a permis de faire des progrès considérables dans la connaissance des tumeurs végétales, en particuliers le « crown gall » . BRAUN (1941) fut l’un des premiers à aborder l’étude de ce phénomène. C’est, en partie, grâce à ces recherches sur le crown gall que les premiers essais de manipulation génétique ont pu être réalisés. Un point longtemps contesté est la possibilité d’obtenir une prolifération de tissus à partir d’une cellule végétale mise en culture in vitro. TORREY, en 1957, réussit à suivre sous microscope l’évolution de cellules isolées de tissus de pois, mises en culture à proximité d’un tissu « nourricier ». Les tissus compacts, normaux ou tumoraux, méristèmes, bourgeons, racines et enfin cellules isolées sont devenus, grâce aux techniques de culture in vitro, le matériel de choix pour les physiologistes végétaux et les botanistes.
Méthodes d’ obtention de cellules libres
Les cellules libres peuvent être obtenues par :
– des techniques mécaniques (agitation ou broyage ménagé des tissus en milieu liquide )
– des techniques enzymatiques (action d’enzymes pectocellulolytiques).
Lorsqu’on applique ces techniques à des tissus provenant directement du végétal comme le tissu foliaire, on obtient des suspensions cellulaires dites primaires. Lorsqu’on les applique à des tissus néoformés résultant de la prolifération in-vitro d’un explant prélevé sur le végétal, on obtient des suspensions cellulaires dites secondaires.
Dissociation mécanique : obtention de cellules d’origine secondaire
Production de cellules libres à partir de cals friables
L’essor des cultures de tissus végétaux, qui a suivi les premiers travaux de WHITE (1934) , GAUTHERET et NOBECOURT (1977), a apporté une contribution considérable aux cultures de cellules en permettant la mise au point d’une méthode commode d’obtention de cellules libres.
Les tissus de carotte cultivés en présence d’auxine (AIA : acide indolyl acétique) ont un texture si friable qu’ils peuvent se dissocier spontanément en cellules séparées (GAUTHERET, 1934) . L’aptitude à la dissociation d’une culture de tissus dépend de l’espèce choisie, du type de tissu et de la composition du milieu de culture. La présence d’auxine à forte dose est souvent un facteur très favorable. Les suspensions de cellules libres, à partir d’agrégats cellulaires de taille variable, sont obtenues en transférant des cals friables en milieu liquide agité (MUIR et col, 1954) . La filtration des suspensions obtenues sur des tamis de mailles convenables a permis, par la suite, d’augmenter la proportion de cellules libres.
Caractéristiques des cellules séparées de cals friables
Les suspensions d’origine secondaire ne sont jamais constituées exclusivement de cellules séparées, malgré des filtrations répétées. En effet, les dimensions cellulaires sont très hétérogènes dans les cals. Les hasards de la dissociation peuvent fournir des agrégats de quelques cellules dont la taille est peu différente de la moyenne des cellules libres. En conséquence, les filtrats contiennent toujours un pourcentage très variable de colonies cellulaires de petite taille mélangées aux cellules libres. D’autre part, au moment de la séparation, toutes les cellules d’un cal ne sont pas dans le même état physiologique. Elles peuvent, par exemple être d’âges variés, se trouver à diverses étapes du cycle cellulaire et même posséder des propriétés métaboliques différentes (JULIEN, 1980).
Dissociation du tissu assimilateur foliaire: obtention de cellules d’origine primaire
méthodes mécaniques
Les premières cellules séparées ont été obtenues par HEBERLANDT (1902) grâce à une méthode mécanique qui a nécessité la pratique de dissections fines des feuilles. Cette méthode, délicate à mettre en œuvre, a permis l’obtention de cellules viables, mais en petites quantités. RACUSEN et ARONOFF (1953) ont eu les premiers l’idée de remplacer ces dissections par un broyage modéré réalisé au moyen d’un homogénéisateur manuel dans une solution tampon.
D’autres méthodes de dissections mécaniques du tissu foliaire non pratiquées aseptiquement, ont été utilisées lors d’études relatives au métabolisme photosynthétique. Elles semblent très spécifiques et sont d’emploi plus délicat, ce qui limite leur intérêt.
Méthodes enzymatiques
Les techniques de dissociation enzymatique se sont essentiellement développées après les travaux de TAKEBE et coll. (1968) sur la feuille de tabac. Leur principe consiste à faire agir des enzymes pectolytiques et cellulolytiques sur le tissu foliaire fortement plasmolysé. On obtient d’abord des cellules séparées, puis des protoplastes. Il faut souligner que le champ d’application des méthodes enzymatiques est beaucoup plus large que celui des méthodes mécaniques. L’utilisation de diverses combinaisons d’activités enzymatiques dégradant la parois cellulaire devrait permettre d’obtenir des cellules et plus facilement encore des protoplastes à partir de n’importe quel tissu foliaire.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
PREMIERE PARTIE : Généralités
A-CULTURE IN-VITRO
1-Historique
2-Méthodes d’obtention de cellules libres
2-1-Dissociation mécanique : obtention de cellules d’origine secondaire
2-1-1-Production de cellules libres à partir de cals friables
2-1-2-Caractéristiques des cellules séparées de cals friables
2-2-Dissociation du tissu assimilateur foliaire : obtention de cellules d’origine primaire
2-2-1-Méthodes mécaniques
2-2-2-Méthodes enzymatiques
3-Méthodes de culture des cellules libres
3-1-Les microcultures
3-2-Les cultures en milieu gélosé
3-3-Les cultures en milieu liquide
B-MATERIELVEGETAL : Lantana camara
1-Classification
2-Description botanique
2-1-Appareil végétatif
2-2-Appareil reproducteur
3-Composition chimique de L. camara
4-Utilisations de L. camara
a-Utilisations médicales
b- Autres utilisations
C-Applications des cultures de cellules végétales
1-Multiplication végétative
2-Amélioration des plantes
3-Biotechnologie et les cultures de cellules végétales
3-1-Production de métabolites secondaires par les cultures de cellules
3-2-Biotransformations réalisées par les cultures de cellules
DEUXIEME PARTIE : Callogenèse
A-Matériels
1-Matériel végétal
2-Milieux de culture
2-1-Milieux de base
2-1-1-Macroéléments
2-1-2-Oligo-éléments
2-1-3-Vitamines
2-2-Composition des milieux de base
2-3-Préparation des milieux
2-3-1-Solutions- mères
2-3-2-Source de carbone
2-3-3-Gélification du milieu
2-4- Stérilisation du milieu
2-5-Hormones végétales
2-6-Conditionnement du milieu de culture
B-Méthodes de culture
1-Méthodes expérimentales
2-Multiplication par microbouturage
2-1-Stérilisation des explants
2-1-1-Stérilisation à l’hypochlorite de sodium
2-1-2-Stérilisation au bichlorure de mercure
2-1-3-Combinaison de ces deux agents stérilisants
2-2-Mise en culture
2-3-Conditionnement d’environnement de la culture
3-Callogenèse (embryogenèse somatique indirecte)
3-1-Initiation de cals à partir de lobes de feuilles
3-2-Initiation de cals à partir de méristèmes ou apex de tige
3-2-1-Rappel
3-2-2-Mise en culture
3-2-3-Transfert des cals sur le milieu de maturation GD6
3-2-4-Evaluation des traitements
C-Résultats et discussions
1-Stérilisation des explants
2-Productiiondes cals à partir de lobes de feuilles
3-Production de cals à partir de l’apex de tige
4-Transfert des cals sur le milieu de maturation GD6
5-Conclusion
TROISIEME PARTIE : Extraction de l’ADN génomique
A-Materiels
B-Méthodes
1-Préparation du phénol
2-Extraction d’ADN génomiques de L. camara
3-Analyse de l’ADN en gel d’agarose
4-Digestion de l’ADN génomique par des enzymes de restriction
5-Coloration et révélation de l’ADN
C-Résultats et discussions
1-Analyse de la quantité de l’ADN génomique
2-Digestion de l’ADN génomique
CONCLUSIONS GENERALES
