Méthodes d’extraction des plantes

Méthodes d’extraction des plantes

Matériel végétal

1. La récolte : Stévia a été récolté à partir de la région de ( Taounate )
2. La conservation : Les feuilles ont été triées, séchées à l’air ambiant.
3. le broyage : les feuilles ont été broyées à l’aide d’un broyeur.

Extraction des stéviol glycosides

Dans le but de déterminer la meilleure méthode d’extraction on a utilisé :
 Une méthode conventionnelle : Macération à chaud  Une méthode moderne : Sonication Extraction des stviol glycosides par macération à chaud : Pour indiquer le meilleur rendement en stéviol glycosides, on a comparé des feuilles entières et des feuilles broyées, pour cela deux étapes d’extraction ont été effectué:

 Préparation de l’extrait aqueux : solide -liquide
 100g du matériel végétal sec (feuilles broyées) a été mélangé avec un volume (1L) d’eau chaude (solvant), sous agitation pendant 4h à température (80°C _ 100°C).  La solution obtenue est ensuite filtrée à l’aide d’un papier filtre. Le processus d’extraction est répété avec le résidu obtenu 5 fois jusqu’à épuisement total du matériel végétal.
 Le volume total du filtrat est concentré sous vide avec un évaporateur rotatif muni d’une pompe à vide abaissant le point d’évaporation du solvant (50°C).

Préparation de l’extrait organique : liquide -liquide
 Le volume concentré obtenu de l’extrait aqueux est lavé, à l’aide d’une ampoule à décanter, avec un mélange du solvant composé d’acétate d’éthyles et n- butanol de pourcentage différent. Les stéviol glycosides sont soluble dans la phase organique qui dans ce cas le mélange de d’acétate d’éthyles et n- butanol.
 La phase organique est séparée et concentrée jusqu’a à la formation d’une masse
solide. Ainsi le rendement peut être calculé avec :
Rendement = masse de l’extrait obtenu (après concentration) en gramme / masse du matière végétale initiale en gramme
 Cristallisation : Pour une purification maximale de stéviol glycosides et élimination des produits pouvant migrer vers la phase organique, une étape de cristallisation semble très importante, la masse solide est alors dissoute dans le méthanol chaud, puis laissée refroidir à 4°C jusqu’à précipitation totale des cristaux : stéviol glycosides
Ainsi le rendement en stéviol glycosides est déterminé
Le protocole d’extraction des stéviol glycosides décrit ci-dessus est répété avec des feuilles non broyées, et on a comparé les résultats des rendements.
Extraction assistée par Ultrasons:

Préparation de l’extrait aqueux : solide –liquide

 100g de matière végétale, immergé dans 1l de l’eau distillée chaude, est exposée aux ultrasons pendant 30min. Ce processus est répété avec le résidu obtenu 5 fois jusqu’à épuisement total du matériel végétal.
 Ensuite, une évaporation est effectuée sous pression dans un rota-vapeur (BÜCHI) sous une température de 40°c, pour éviter toute dégradation de composés existants dans l’extrait II.2.2. Préparation de l’extrait organique : liquide –liquide
Pour l’extraction des cristaux de stéviol glycosides, on procède de la même manière que la macération chaude détaillée ci-dessus.

Purification des stéviosides par colonne

 1kg du stévia broyé a été macéré à chaud dans 5l d’eau distillée le résidu obtenu après filtration a été extrait de la même procédure 5 fois, pour une élimination totale des stéviosides.
Le filtrat obtenu (25l) est concentré sous pression à l’aide d’un rota vapeur pour avoir un volume final de 11L.
 Dans le but d’atténuer la couleur du filtrat concentré on fait une clarification réalisée par précipitation de l’extrait avec 100g de l’hydroxyde de calciumCa(HO) 2.  le mélange a été filtré par la suite pour élimination du précipité formé par Ca(HO)2. Décoloration de l’extrait de stevia : On fait Une décoloration par absorption des pigments sur une résine échangeuse de cation fortement acide macroporeux.
L’éluât est placé sur une seconde résine échangeuse de d’anion fortement basique qui va retenir spécifiquement les steviol glycosides qui sont alors élués de la résine par eau.
 cette technique d’extraction ne fait intervenir aucun solvant ou produit chimique pouvant présenter un risque au niveau alimentaire.  Préparation des colonnes : 1-Première Colonne : Échangeurs de cation : (résine fortement acide).
Après avoir rempli la colonne la phase stationnaire, qui est dans notre cas (Gel de type Tulsion T-42 H+).
 On place ensuite un morceau du coton en tête de colonne, puis on s’assure que la colonne est bien tassée.  on ajoute 600 ml de HCl de façon que la colonne soit bien régénérée (3 fois).  On dépose ensuite délicatement la solution filtrée de stévia en haut de colonne avec une pipette Pasteur afin de ne pas perturber la surface du la phase stationnaire. On ouvre le robinet et on le laisse couler doucement, goutte à goutte
2- Deuxième Colonne : Échangeurs de l’anion
De la même manière on se sert d’une colonne où la phase stationnaire est le Tulsion A2 XMP, on lave avec NaOH de concentration 50g/L (3 fois), et on fait éluer soigneusement la solution obtenue de la 1ére séparation.

Test d’effet antioxydant

La préparation de la solution de DPPH : Le DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (C18H12N5O6 ; Mr : 394.33), est solubilisé dans l’éthanol absolu pour en avoir une solution de 0.3 mM. On procède comme suivant :
On solubilise une quantité de 4 mg de DPPH dans 100ml de l’éthanol. Le mélange est laissé en agitation pendant 1h 30min dans un flacon brun et à température ambiante pour éviter la dégradation de ce radical.
La solution de DPPH est conservée au réfrigérateur à une température de 4C°.
La préparation de l’extrait : Pour évaluer l’activité antioxydante par le test de DPPH, on dissoudre l’échantillon dans l’éthanol.
Une solution mère est préparée avec une concentration de 12mg/ml. Différent concentration de
50µl ,20µl ,10µl, 5µl, 2µl et de 1µl ont été faite afin de déterminer l’IC50 de l’extrait (la concentration correspondant à 50% de la réduction du radicale libre de DPPH).
Protocol expérimentale : Pour chaque extrait on a fait deux essais:
 Test de blanc : Dans un tube sec et stérile, on introduit 3ml de la solution de l’extrait, puis on ajoute 3 ml du éthanol (on doit avoir 6ml de la solution expérimentale), on utilise le vortex pour homogénéiser le mélange, la solutionest mise dans un cuve de quartz pour mesurer son absorbance à l’aide d’un spectrophotomètre à la longueur d’onde de 517nm (domaine visible).
 Test contrôle : Le control négatif correspond à l’absorbance de DPPH avec l’éthanol, il consiste à mettre dans un tube stérile 0,4ml de DPPH et 1,60ml de l’éthanol.
 Test de l’extrait: Dans des tube secs et stériles, on ajoute 1 ml du méthanol, ensuite on introduit les différentes concentrations 50µl 20µl, 10µl, 5µl, 2µl et 1µl de la solution des extraits éthanoliques préparés, ensuite le volume correspondant de l’éthanol pour avoir le 1.6ml de solution et pour terminer le 6 ml on ajoute 3ml de DPPH.
On utilise le vortex pour homogénéiser le mélange, les mélanges sont laissés à l’obscurité pendant 30 min et la décoloration par rapport au contrôle négatif contenant uniquement la solution de DPPH est mesurée à 517 nm.

Table des matières

Remerciement
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
Introduction générale
Etude bibliographique
I. Plantes médicinales
Définition
Historique
Domaine d’application des plantes médicinales
II. Généralités Méthodes d’extraction des plantes
Les percolations
Les infusions
Les décoctions
Les macérations
Soxhlet
Le CO2 supercritique
III. Techniques de séparation
La chromatographie d’adsorption
Chromatographie de partage
Chromatographie en phase gazeuse
La spectrométrie de masse (SM)
IV. Activité antioxydante
Généralités sur l’effet antioxydant
Méthode d’étude d’activité des antioxydants des plantes médicinale
IV.2.1. Le β-carotène comme indicateur d’oxydation
IV.2.2. Test de réduction du radical-cation ABTS+° ou TEAC
IV.2.3. Test de capture des radicaux peroxyles :TRAP et ORAC
IV.2.4. Test de réduction du DPPH
V. plante sélectionnée: Stevia rebaudiana Bertoni 
Description botanique du Stevia rebaudiana Bertoni
Classification botanique
Étude phytochimique des feuilles de Stevia rebaudiana
VI. Les activités biologiques de steviarebaudiana 
Activité hypoglycémique
Activité antibactérienne et antifongique
Activité antivirale
Matériels et méthodes
I. Matériel végétal 
II. Extraction des stéviol glycosides
Extraction des stviol glycosides par macération à chaud
II.1.1. Préparation de l’extrait aqueux : solide -liquide
II.1.2. Préparation de l’extrait organique : liquide -liquide
Extraction assistée par Ultrasons
II.2.1. Préparation de l’extrait aqueux : solide –liquide
II.2.2. Préparation de l’extrait organique : liquide –liquide
III. Purification des stéviosides par colonne 
Décoloration de l’extrait de stevia
IV. Test d’effet antioxydant
La préparation de la solution de DPPH
La préparation de l’extrait
Protocol expérimentale
Expression des résultats
V. Criblage phytochimique
Tanins
Flavonoïdes
Saponosides
Résultats et discussion
I. Extraction par macération à chaud
L’extraction solide –liquide
Extraction liquide –liquide
II. Extraction assistée par Ultrasons 
III. Décoloration de l’extrait de stevia 
IV. effet antioxydant par test DPPH
V. Criblage phytochimique
Conclusion et perspective
Réferences

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