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Les désaminations et la formation de sites abasiques
Les bases puriques et pyrimidiques possèdent une certaine instabilité chimique. En effet, si la liaison phosphodiester est très résistante dans l’ADN par comparaison avec celle de l’ARN, la liaison N-glycosidique des bases de l’ADN est plus fragile. Une conséquence possible sera alors l’hydrolyse des bases de l’ADN (dépurination, dépyrimidination) conduisant à la formation de sites abasiques [14]. Ces sites abasiques sont intrinsèquement instables et peuvent entraîner des ruptures de chaîne dans la double hélice de l’ADN sous l’action de la chaleur, de produits chimiques basiques, ou des ions Mg2+. Ces sites sont donc fortement mutagènes in vivo [15].
Ils sont formés par perte spontanée de bases, résultat de l’action d’agents alkylants ou par l’action des glycosylases. Ce sont les lésions les plus fréquentes de l’ADN car on estime qu’il existe 50 000 à 200 000 sites par cellule à l ’état basal [16] et que 10 000 sites sont créés par jour dans chaque cellule humaine [17]. Si ils ne sont pas réparés, ils représentent dessites potentiels pour des mutations. Il s’agit de la règle du A (insertion préférentielle d’une adénine).
De plus, ces lésions sont dangereuses car elles bloquent la réplication de l’ADN avec des conséquences cytotoxiques[16].
Par ailleurs, les bases qui possèdent des amines exocycliques (Adénine, Guanine et Cytosine) peuvent être désaminées à température etpH physiologiques [18]. La guanine et l’adénine se désaminent pour former respectivement la xanthine et l’hypoxanthine. La désamination de la cytosine explique la présence anormale d’uracile dans l’ADN. La structure en double brin assure à l’ADN une protect ion relative face aux réactions de désamination. Ces dernières sont facilitées lorsquel’ADN est sous forme simple brin.
Les lésions par formation d’adduits
De nombreux produits chimiques vont pouvoir gagner le noyau cellulaire et se fixer par une liaison covalente sur une des bases de l’ADN, le plus souvent la guanine. L’alkylation de l’ADN a généralement lieu sur les positions N-7 etO-6 de la guanine et N-3 de l’adénine. Certains réactifs possèdent deux sites électrophiles et sont ainsi capables de former deux liaisons avec l’ADN, ce qui conduit à des pontages intra-brins ou inter-brins.
Cet effet est souvent le fait de produits toxiques polluant l’environnement dont les plus connus sont les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dont fait partie notamment le benzoapyrène. Cette famille de composés génotoxiques estlargement présente dans la fumée de tabac mais aussi dans l’alimentation (aliments fumés ou grillés), la pollution atmosphérique (gaz d’échappement) ou les émissionsindustrielles.
Des adduits peuvent également être formés à partirdes produits endogènes issus des métabolismes cellulaires, dont les dérivés de l’oxydation des lipides, notamment les aldéhydes comme le 4-hydroxy-nonén-2-al, ou les dérivés chlorés issus de l’inflammation. L’addition d’aldéhydes aboutira à la formation d’éthénoadduits ou, lorsqu’il s’agit de bis-aldéhydes comme le malonaldéhyde, à la formation d’un nouveau cycle sur la guanine. Des produits d’oxydation du glucose , comme le glyoxal et le méthylglyoxal sont fréquemment induits par le stress oxydant chez le diabétique [19]. Les protéines ou polyamines entourant l’ADN peuvent aussi former de tels adduits en cas d’attaque radicalaire.
Les dommages de l’ADN ne sont pas toujours isolés, mais peuvent se trouver nombreux dans une portion étroite de la molécule (un à deuxtours d’hélice), on parle alors de lésions multiples ou de cluster de lésions. La définition ed « clustered damage » correspond minimum à deux dommages produits sur une longueur d e 10 paires de bases [22]. Lorsque deux lésions sont sur le même brin d’ADN, il s’agitde lésions « tandem ».
Inversement ces propriétés sont exploitées dans lalutte contre le cancer dans la réalisation de médicaments alkylants qui en se fixant sur l’ADN entraîneront la mort par apoptose des cellules cancéreuses. Il s’agit par exemple du cis-platine, des dérivés de la nitroso-urée ou de la mitomycine C.
Les lésions photochimiques
Les rayonnements ultraviolets (UV) vont selon leur longueur d’onde réaliser des réactions photochimiques directes sur les bases de l’ADN aboutissant à la formation de dommages particuliers, les photoproduits. Le maximum d’absorption de l’ADN étant à 260 nm, le rayonnement UVB dont la longueur d’onde est comprise entre 285 et 315 nm a un effet direct sur la molécule d’ADN. Ce sont les bases pyrimidiniques qui vont pouvoir réagir avec ces photons pour former des dimères cyclobutanes ou des photoproduits (6-4) au niveau de deux bases pyrimidiniques adjacentes [20].
Cette action était jusqu’il y a peu de temps attribuée uniquement aux UVC (présents dans le vide mais pas à la surface de la terre) et aux UVB dont ils expliquaient l’action carcinogène sur la peau. Des travaux récents de Thierry Douki ont montré que les rayonnements UVA formaient eux aussi des quantités non négligeablesde photoproduits [21].
Les lésions multiples
Les rayonnements ionisants forment un grand nombre de ces clusters de lésions. En effet ils agissent dans la cellule surtout indirectement en ionisant la molécule d’eau ce qui conduit à la formation de différentes espèces réactives. Ilsvont déposer leur énergie le long de leur trajet à travers l’ADN créant ainsi un grand nombre de cassures doubles et de lésions multiples. Le stress oxydant et certains anticancéreux radiomimétiques comme la bléomycine peuvent aussi générer un certain nombrede lésions multiples. Celles-ci sont très dommageables pour la cellule car beaucoup plus difficiles à réparer comme nous le verrons plus loin.
LES GRANDS MECANISMES DE REPARATION
La réparation doit être replacée dans son contextecellulaire ; il s’agit d’une réponse cellulaire possible parmi d’autres, face à une lésion de l’ADN. La conséquence première est un arrêt de la réplication ou de la transcriptionLa. cellule peut s’orienter vers une tolérance de la lésion (mutation avec ou sans conséquence phénotypique). On sait en effet que la grande partie du génome des Mammifères n’est pas transcrite dans chaque cellule et ces régions inactives pourraient tolérer certains dommages. Le déclenchement de l’apoptose est une autre réaction cellulaire possible, en particulier quand la réparation est un échec.
a : arrêt du cycle cellulaire
b : activation d’un grand nombre de gènes, rôle dan s la survie cellulaire ?
c : apoptose, probablement quand les autres réponse ne sont pas suffisamment efficaces
d : tolérance de la lésion (mutation)
e : réparation de l’ADN
Une fraction considérable du génome code des protéines qui recherchent et réparent l’ADN [25] lésé . En 2009, plus de 150 gènes associés à la réparation de l’ADN sont identifiés chez l’homme [26]. L’importance de la réparation est illustrée par esl syndromes de déficience de réparation qui seront abordés ultérieurement.
La suppression des nucléotides triphosphatesanormaux
Il s’agit du système de prévention de l’incorporation des bases oxydées.
Les désoxynucléotides triphosphates libres peuvent s’oxyder puis les bases anormales produites être alors introduites dans l’ADN en cours de sa synthèse.
Chez E. coli, l’enzyme MutT est chargée d’hydrolyser la molécule de 8-oxodGTP (8-oxo-7,8-dihydro-2’-désoxyguanosine 5’- triphosphate). Une mutation de cette protéine entraîne un nombre de transversions A.T C.G 100 à 100000 fois supérieur au taux de l’espèc sauvage [30]. L’enzyme humaine appelée MTH1, qui est une 8-oxodGTPase représente également le premier niveau de protection. Ceci permet d’éviter l’incorporation de 8-oxoG lors de la néosynthèse de l’ADN[31].
Pour éviter l’incorporation d’uracile en cours de synthèse d’ADN, une désoxyuridine triphosphatase (dUTPase) hydrolyse le dUTP formé accidentellement ou provenant d’une désamination du dCTP, régénérant le dUMP utilisabledans la biosynthèse de la thymidine.
La réversion directe des dommages
Des dommages peuvent être directement supprimés, sans remplacer le nucléotide endommagé par un nouveau.
L’enzyme AGT ( O6-alkylguanine-ADN transferase), aussi nommée O6-methylguanine-ADN methyltransferase (MGMT), déméthyle les O-méthyle ou alkyle guanine, ainsi que plus lentement les O4-methylthymine, dans de nombreuses espèces des bactéries à l’homme [27].
Les bases méthylées sont réparées par le même mécanisme chez les bactéries comme chez l’homme. Les enzymes AlkB chez E. coli et hABH 2 et 3 chez l’homme déméthylent les N1-méthyl-adénine et les N3-méthyl-cytosine, par uneéactionr d’oxydation [32].
Un système enzymatique de photoréversion directe des dimères cyclobutanes par des photolyases utilise l’énergie lumineuse pour couper les liaisons entre les deux bases des dimères de pyrimidine et régénérer deux bases intactes. Ces systèmes ont été identifiés chez les bactéries et chez des eucaryotes primitifs, mais ne semblent pas exister chez l’homme [33].
Nous pouvons citer également l’enzyme polynucléotide ligase qui élimine les cassures simple brin [34].
La recombinaison
Au cours de la vie cellulaire, des cassures de la double hélice d’ADN peuvent survenir. Actuellement, nous connaissons deux systèmes de réparation permettant de corriger ces dommages.
En phases S ou G2 du cycle cellulaire, il s’agit d’ une recombinaison de type homologue (HR) qui est impliquée dans la réparation des cassures simples et doubles brins de l’ADN. En revanche, lorsque les cellules se trouvent en phase G1, il s’agit plutôt d’une recombinaison de type non-homologue par jointure des extrémités (NHEJ). NHEJ et HR jouent des rôles superposables dans la réparation des coupures doubles brins dans la phase S du cycle cellulaire.
Réparation par recombinaison homologue
Cette réparation utilise la partie homologue du génome [34].
Le mécanisme consiste à éliminer une grande portionde nucléotides autour de la lésion non réparable et à copier la bonne information génétique sur le brin similaire du chromosome apparié. Ceci va nécessiter une machinerie complexepour rapprocher les deux brins d’ADN de chromosomes différents[35].
1ière étape: la protéine ATM prend en charge la reconnaissance des lésions, active le complexe Rad50/Mre11/Nbs1 et provoque l’apparition d’une extrémité 3’ qui sera protégée par la protéine RPA.
2e étape: BRCA1 active Rad51. La protéine Rad51 (en collaboration avec d’autres protéines : Rad52 et Rad54) est alors chargée de cette extrémité simple brin : Rad51 recherche l’homologie puis elle va positionner un simple brin jugé homologue dans la cassure comme s’il s’agissait d’un ADN simple brin et non plus d’une cassure double brin.
3e étape: Les dernières étapes de la recombinaison font intervenir plusieurs enzymes : une ADN polymérase qui est chargée de synthétiser le brin complémentaire, une ligase pour souder la liaison phosphodiester et des nucléases pour séparer les deux ADN doubles brins homologues.
La cassure double brin est ainsi réparée. La protéine majeure de cette voie est la protéine Rad51.
Dans les cancers du sein familiaux, soit 5% des cancers du sein, des mutations du gène BRCA1 sont retrouvés[36].
Réparation par recombinaison non homologue
La réparation par suture ou jonction des extrémités(Non Homologous End Joining) est aussi utilisée pour la réparation des cassures double brin. Comme précédemment, c’est la protéine ATM qui joue un rôle central en stoppant le cycle c ellulaire pour permettre les réactions de réparation [37]. Dans le NHEJ les extrémités de l’ADN sont jointes directement. Les principaux composants du NHEJ sont la sous-unité catalytique de la DNA protéine kinase (DNA-PKcs) qui est recrutée par la protéine DNA Ku(hétérodimére), XRCC4 et la DNA ligase IV.
La réparation par le NHEJ n’est toutefois pas une voie de réparation fidèle, puisque des délétions de quelques nucléotides peuvent avoir lieu lors du processus. L’inhibition de NHEJ peut être utilisée comme sensibilisant de la radiothérapie des cancers.
La réparation par excision de base (BER)
Ce type de réparation corrige les altérations de bases qui ne modifient pas la structure générale de l’hélice ; les modifications concernéessont les oxydations, les déaminations, les ouvertures de cycle et certaines méthylations endogènes. Nous détaillerons davantage ce mécanisme car il est celui étudié dans nos travauxexpérimentaux. De plus, la BER est probablement le mécanisme de réparation le plus important quantitativement [5]. Dans les
cellules humaines, la BER serait impliquée dans la réparation d’environ 20000 lésions par cellule et par jour [38].
Mécanisme
Il s’agit du retrait d’une base aberrante par une g lycosylase. En fait, quatre enzymes sont impliquées dans la BER : une ADN glycosylase spécifque, une AP endonucléase, une ADN polymérase et enfin une ADN ligase[17]. Ce système fonctionne en trois étapes :
1ière étape: l’ADN glycosylase spécifique coupe la liaison qui relie la base endommagée au sucre, la transformant alors en un site abasique. Il existe plusieurs ADN glycosylases présentant chacune une spécificité de substrat plusou moins large. Le chapitre suivant leur est consacré car nous avons étudié le comportementde deux d’entre elles sur une puce à ADN. La multiplicité de ces enzymes permet la réparation d’une grande variété de dommages. Le type de terminaison généré par les différents clivages enzymatiques des sites abasiques est déterminant pour la sélection de la oiev BER :
le short patch est favorisé par la présence d’un nucléotide avec un résidu 3’ intact (action d’une enzyme bifonctionnelle)
le long patch est favorisé par l’existence d’un déoxyribose phosphate en 3’ (action d’une enzyme monofonctionnelle) [11]. Mais ce mécanisme reste discuté en 2009 et la concentration en ATP à proximité du site abasique pourrait influencer la voie choisie [39].
2e étape: une AP endonucléase coupe les liaisons phosphodiesters entourant le site abasique, avec ou sans l’aide d’une AP lyase. En fonction de la conséquence de la première étape, deux voies sont possibles après le retrait de la base :
voie courte (un seul nucléotide excisé) : l’ADN polymérase interagit avec XRCC1 qui est la première protéine recrutée et l’ADN ligase II. Dans ce cas, il y a intervention de la protéine PARP qui recrute les autres protéines. Lerôle essentiel de la protéine XRCC1 est de stabiliser le complexe.
Cette voie est également opérationnelle s’il existeune compétition entre les mécanismes de NER et de BER pour un substrat [40] puisqu’en condition de stress oxydant interne, il est possible que les acteurs de la voie du long-patch soient limitants à cause de leur participation à la réparation d’autres lésions[16].
voie longue (excision d’un fragment de 6 à 13 nucl éotides) : cette voie nécessite la protéine nucléaire PCNA et les polymérases ou [27]. La protéine PCNA coordonne les activités enzymatiques des polymérases et de la protéine FEN1[39].
3e étape: la base complémentaire est resynthétisée et religuée à l’aide de, respectivement, des ADN polymérasesβ et δ/ε et des ligases I et III.
Mais les polymérases impliquées dans le long patchne sont pas encore parfaitement identifiées[16].
C’est le mécanisme « short patch » qui est responsable du retrait de la base oxydée 8-oxoG dans les cellules de Mammifères [11]. Mais pour quelques purines oxydées avec un fort pouvoir mutagène (comme 8-oxoG), la capacité de BERdes cellules de Mammifères est limitée en comparaison de la capacité de réparationd’autres lésions endogènes fréquentes comme l’uracile [41] et les sites abasiques.
La plupart des acteurs de la BER interagissent avec XRCC1, protéine essentielle pour la coordination et la stimulation de toute la réaction[43]. Ce mécanisme d’excision-resynthèse est en effet coordonné de façon rigoureuse pour assurer une réparation fidèle des sites abasiques sans entrainer des cassures de brins, eux-mêmes extrêmement toxiques pour les cellules. XRCC1 est une véritable plaque tournante de la BER qui reste sur le site de la lésion durant toutes les étapes.
Types de glycosylases impliquées dans la BER
Pour la réparation directe et la BER, les lésions onts reconnues par une protéine à activité enzymatique : une ADN glycosylase [44]. Ces enzymes sont présentes dans le noyau cellulaire et ne sont pas induites par des lésions génotoxiques [34]. Elles constituent d’excellents modèles pour l’étude des interactions entre ADN lés et protéines .
Les ADN glycosylases reconnaissent les bases modifiées (oxydées, alkylées, pontées, hydrolysées, fragmentées) et les purines à cycle imidazole ouvert [45].
Ces enzymes sont des petites protéines de 16 à 42 kDa ne nécessitant pas de cofacteur [46] [38] et 11 chez métallique ou d’énergie exogène . Il existe 8 ADN glycosylases pour E.coli l’homme [39]. La redondance de certaines de leurs fonctions souligne le rôle important de la réparation par excision de bases dans la cellule[47].
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Table des matières
Introduction
CHAPITRE I Les lésions de l’ADN et leur réparation
I Structure de l’ADN
II Nature et origine des lésions de l’ADN
II.1 Les lésions oxydatives
II.2 Les désaminations et la formation de sites abasiques
II.3 Les lésions par formation d’adduits
II.4 Les lésions photochimiques
II.5 Les lésions multiples
III Les grands mécanismes de réparation
III.1 La suppression des nucléotides triphosphates anormaux
III.2 La réversion directe des dommages
III.3 La recombinaison
III.3.1 Réparation par recombinaison homologue
III.3.2 Réparation par recombinaison non homologue
III.4 La réparation par excision de base (BER)
III.4.1 Mécanisme
III.4.2 Types de glycosylases impliquées dans la BER
III.4.3 Les enzymes de la BER chez les bactéries
III.4.3.1 Fpg protéine (Fapy-glycosylase ou Mut M)
a) Description de la Fpg
b) Reconnaissance des lésions
c) Activité enzymatique de la Fpg
III.4.3.2 Endonucléase III
III.4.3.3 Endonucléase IV
III.4.3.4 Endonucléase VIII
III.4.4 Les enzymes de la BER eucaryotes
III.4.4.1 Les enzymes OGG
III.4.4.2 Uracile ADN N-Glycosylase (UNG)
III.4.4.3 Ape1, ou HAP1, Ref-1, APEX-1
III.5 La réparation par excision de nucléotides (NER)
III.6 La réparation des mésappariements
III.7 La réparation des lésions multiples
III.7.1 Cas des lésions sur brins opposés
III.7.2 Cas des lésions sur le même brin (lésions tandem)
IV Fonctionnement des systèmes de réparation
IV.1 Déclenchement de la réparation et kinases
IV.2 Expression des gènes de réparation et adaptation au stress
IV.3 Adaptation par translocation nucléaire
IV.4 Variations physiologiques
V Conséquences des lésions pour les êtres vivants
V.1 Mutations et évolutions
V.2 Apoptose
V.3 Carcinogenèse
V.3.1 Maladies héréditaires
V.3.2 Maladies acquises
V.3.3 Thérapeutique
V.4 Sénescence
CHAPITRE II : Méthodes d’étude des interactions ADN/protéines
I Etude in vivo des lésions ou de la réparation de l’ADN
I.1 Des méthodes indirectes
I.2 Des méthodes directes
II Etude in vitro des protéines de reconnaissance et de réparation de l’ADN
II.1 Techniques avec marquage
II.1.1 Radioactivité
II.1.1.1 Filtration sur membrane
II.1.1.2 Gel shift : EMSA : Electrophoretic Mobility Shift Assay
II.1.1.3 Analyse des coupures par électrophorèse
II.1.1.4 Mesure du blocage de la réplication par une lésion (extension d’amorce)
II.1.1.5 Mesure des mutations
II.1.1.6 Crosslinking induit
II.1.1.7 Universal Protein Array (UPA)
II.1.1.8 Southwestern Blotting
II.1.2 Fluorescence
II.1.2.1 Biopuces
II.1.2.2 Spectroscopie par fluorescence
II.1.2.3 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer
II.1.3 Marquage photo-chimique
II.2 Techniques de « Binding »
II.2.1 Immunoprécipitation
II.2.2 Tag des protéines avec une séquence poly-histidine
II.2.3 Billes magnétiques
II.2.3.1 Billes fixées à des oligonucléotides dans le but de piéger une ou plusieurs protéines d’intérêt
II.2.3.2 Cas particulier d’utilisation des billes : purification du complexe ADN/protéine
a) Le test de trapping
b) Oligonucléotide conjugué à une molécule photo-réactive
II.3 Techniques de Footprinting
II.4 Protéomique
II.4.1 Electrophorèse bidimensionnelle Cas particulier : Technique DIGE : DIfference Gel Electrophoresis
II.4.2 Surface Enhanced Laser Desorption Ionization : SELDI
II.5 Méthodes optiques
II.5.1 Spectrophotométrie en flux stoppé
II.5.2 Résonance Plasmonique de Surface : SPR
II.6 Spectrométrie de masse
II.6.1 Utilisée de manière indépendante
II.6.2 Utilisée de manière couplée à une autre technologie
II.6.2.1 Premier cas : analyse directe sur le prisme
II.6.2.2 Deuxième cas : analyse après élution
II.6.2.3 Troisième cas : séquençage par spectrométrie de masse en tandem
CHAPITRE III Principe SPRi et Résultats
I Principe
II Dispositif
II.1 Système optique
II.2 Surface métallique
II.3 Sensorgramme
II.4 Avantages de cette technique
III Contexte de son utilisation
IV Description de notre dispositif
IV.1 Les zips et leur hybridation (construction du ligand)
a) Substitution possible par une base oxydée
b) Substitution possible par une base cyclisée
c) Substitution possible par un analogue de site abasique
d) Lésions tandem
IV.2 Le tampon
IV.3 Le blocage de la surface
V Etude des enzymes de réparation
V.1 Les protéines analysées
V.2 La régénération
V.3 Analyse de la liaison ADN/enzyme
V.4 Révélation de l’activité enzymatique
V.4.1 Première approche : deux injections consécutives d’enzyme
V.4.2 Deuxième approche : révélation par la température
V.4.3 Troisième approche : réaction de trapping avec le borohydrure de sodium
V.5 Amplification possible du signal
V.5.1 Signal de fixation de la protéine à l’oligonucléotide
V.5.2 Signal de révélation de l’activité après dissociation thermique
V.6 Identification des protéines fixées
VI Discussion sur les résultats obtenus vis-à-vis des différentes lésions
VI.1 Dans le cas d’un site lésé unique
VI.2 Dans le cas de lésions tandem
VI.2.1 Etude de Fpg
VI.2.1.1 Interprétation du signal d’injection de Fpg
VI.2.1.2 Interprétation du signal d’hybridation
VI.2.2 Etude de EndoIV
VI.2.3 Etude de OGG1
VI.2.4 Etude de l’action couplée de 2 enzymes
VII Perspectives
Conclusion
Références
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