Méthodes d’étude des effets sur la croissance des micro-organismes

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Répartition géographique

La figure 2 (p. 8) montre la répartition géographique de Macarisia pyramidata. La plante a une large distribution géographique à Madagascar, (annexe 2).

Date et lieu de récolte

La plante a été récoltée à la station Niarovana-Caroline, région Ilaka-Est à 318Km d’Antananarivo sur la RN 11 A, au mois d’août 2006 durant le stade végétatif.
Elle a été identifiée par le Département de Botanique, division herbier du Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza, à Antananarivo.

Produits chimiques

Les produits chimiques utilisés pendant nos travaux sont en majorité de marque MERCK, PROLABO ou BDH et de qualité pour analyse.
Des plaques de gel de silice de marque MERCK (60F254, dimensions 20 × 20 cm) sont utilisées pour la chromatographie sur couche mince (CCM). Le gel de silice étalé sur feuille plastique (épaisseur 0,2 mm) est pourvu d’indicateur fluorescent.

Méthode de préparation et de conservation du matériel végétal

Les rameaux feuillus sont séchés pendant une semaine au soleil. Les feuilles sont ensuite réduites en poudre à l’aide d’un mixer de marque Blender, modèle GT 505.
La poudre obtenue constitue notre matériel végétal de départ. Elle est conservée à la température ambiante dans un récipient en plastique bien fermé.

Méthodes d’extraction des principes toxiques

La poudre végétale est mise en suspension dans le solvant d’extraction (eau distillée ou mélange hydroalcoolique 75 %) suivant le rapport 1/10 (p/v) qui veut dire 1g de poudre ajouté de 100 ml d’eau distillée. Le mélange est soumis à une agitation magnétique pendant 3h à la température ambiante, puis laissé macérer pendant une nuit à + 4°C.
Le macérat est de nouveau agité pendant 1h, puis filtré sur quatre épaisseurs de gaze. Le filtrat est ensuite centrifugé à l’aide d’une centrifugeuse de marque JOUAN (modèle T 52) à 10000trs/min pendant 30 min. Le culot est éliminé tandis que le surnageant est concentré par évaporation au moyen d’un évaporateur rotatif (cf. §. 2.2.4. p. 14).
La solution obtenue constitue l’extrait brut.

Extraction à chaud

Le matériel végétal sous forme de poudre est délayé dans le solvant d’extraction (eau distillée ou mélange hydro alcoolique 75 %) suivant le rapport 1/10 (p/v). La suspension obtenue est soumise à un chauffage à reflux à 60°C pendant 3h, sous agitation magnétique, puis laissée macérer à + 4°C pendant une nuit.
La suite de la manipulation se déroule de la même manière que pour l’extraction aqueuse à froid (cf. §. 2.2.2.1. p.9).

Méthodes de purification

(KAMOUN, 1991 ; MAHUZIER et HAMON, 1990 ; BRUNETON, 1993 ; AUDIGIER et coll., 1987)

Traitement par la chaleur

Cette méthode est utilisée pour éliminer certaines macromolécules telles les protéines, qui coagulent sous l’effet de la chaleur.

Mode opératoire

L’extrait à traiter est chauffé au bain-marie bouillant à 96°C pendant 15 min. Après refroidissement, le précipité formé est éliminé par centrifugation à 12000 trs/min pendant 15 min. Le surnageant est concentré jusqu’au volume initial de l’extrait tandis que le culot est éliminé.

Filtration sur charbon actif

Le charbon actif est un support chromatographique qui adsorbe une grande variété de composés, en particulier les substances à structure aromatique. Son pouvoir adsorbant est élevé.

Mode opératoire

La technique utilisée est celle mise au point par JEANNODA (1986). Dans un entonnoir, au-dessus d’un bouchon formé de fibres de verre, est tassée une couche de charbon actif. L’entonnoir est adapté à une fiole reliée à une pompe à vide. La solution à traiter est filtrée sous pression réduite sur la couche de charbon actif préalablement imprégnée d’eau distillée. Le traitement est suivi de plusieurs rinçages à l’eau distillée.
Pour éliminer les fines particules de charbon, l’extrait incolore obtenu est filtré sur papier filtre.
Il est ensuite concentré par évaporation sous pression réduite.

Méthode de concentration

Toutes les opérations d’évaporation de solvant et de réduction de volume d’extrait sont réalisées au moyen d’un évaporateur rotatif de marque HEIDOLPH à la température 50°C. La pression est réduite à l‘aide d’une pompe à vide.

Calcul de rendement

A chaque étape de la purification, le rendement est déterminé en évaporant à sec l’extrait toxique, puis le résidu obtenu est pesé. Le rendement, exprimé en pourcentage par rapport au poids du matériel végétal de départ, est calculé d’après la relation : ( Pc – Pv ) x 100 R = Q.
R : rendement en pourcentage.
Pc : poids du ballon avec le contenu (en g).
Pv : poids du ballon vide (en g).
Q : poids de la poudre végétale de départ (en g).

Chromatographie sur couche mince

(RANDERATH, 1964 ; VERNIN, 1970 ; AUDIGIE et coll., 1989 ; MAHUZIER et HAMON, 1990) Cette méthode de micro-analyse est couramment utilisée pour tester l’homogénéité d’un extrait. Elle fait intervenir les phénomènes de partage et d’adsorption. La migration des substances sur le support dépend de leur affinité pour l’adsorbant et de leur solubilité dans les solvants utilisés. Ainsi le produit est soumis à des échanges entre la phase liquide mobile (le solvant) et la phase polaire fixe (le support solide) d’une part, et à des forces d’adsorption dues au support d’autre part.
Il s’agit d’une chromatographie ascendante unidimensionnelle en atmosphère saturée. Le support utilisé est le gel de silice de marque MERCK, présenté au § 2.1.2. (p. 7).

Mode opératoire

Les extraits sont analysés sur une plaque de gel de silice découpée aux dimensions voulues. Ils sont déposés à l’aide d’un capillaire en traits horizontaux de 7 mm, espacés de 6 mm, à 1,5 cm du bord inférieur de la plaque et à 1,3 cm des deux bords latéraux. Les dépôts sont séchés au moyen d’un séchoir à main.
Développement de la plaque.
La chromatographie ascendante se déroule dans une cuve à chromatographie (DESAGA), préalablement saturée par les vapeurs du solvant de migration grâce à l’application de papier filtre imprégné de solvant contre ses parois internes.
Le système de solvants utilisé pour le développement est le mélange butanol / acide acétique / eau distillée (BAE) (60/20/20 ; p/p/p).
Lorsque le front du solvant se trouve à 0,5 cm du bord supérieur de la plaque, la plaque est retirée de la cuve puis séchée à l’aide d’un séchoir à main.
Révélation du chromatogramme.
Le chromatogramme est révélé par deux méthodes :
• Visualisation directe des substances ayant migré sous lumière ultra-violette de longueurs d’onde 254 nm et 366 nm. Les constituants apparaissent en taches fluorescentes.
• Pulvérisation sur la plaque du réactif à la vanilline sulfurique dont la composition est donnée en annexe 4. Les constituants apparaissent en taches roses qui noircissent après un chauffage à 120° C pendant 5 min.

Réactions de détection des familles chimiques

Pour chaque opération de détection, 1 ml de l’extrait à analyser est évaporé à sec.

Les anthraquinones : test de BORNTRÄGER

Le résidu d’évaporation à sec est repris dans de l’eau distillée.
Un volume de benzène est additionné du même volume de la solution aqueuse obtenue précédemment dans une ampoule à décanter. Après une forte agitation, le mélange est laissé au repos jusqu’à l’obtention de deux phases : une phase aqueuse et une phase benzénique. Cette dernière est recueillie dans un tube à essai, puis additionnée de 7 gouttes d’ammoniaque (NH4OH) à 25 %. Après agitation, le virage de la coloration dans la phase alcaline (phase inférieure) en rouge indique la présence d’anthraquinones.

Les triterpènes et stéroïdes (FONG et coll., 1977 ; NOHARA, 1989)

Le résidu d’évaporation à sec est repris dans 3 ml de chloroforme. Après agitation, la phase chloroformique est répartie dans 3 tubes à essai.

Test de LIEBERMAN –BÜRCHARD

Dans le deuxième tube, 2 gouttes d’anhydride acétique sont ajoutées. Après une agitation légère, un ajout de quelques gouttes d’acide sulfurique (H2SO4) 4N est effectué.
L’observation du changement de coloration au niveau de l’interface permet d’apprécier les résultats
– le virage au bleu-vert traduit la présence des stéroïdes .
– le virage au rouge, au violet ou au rose celle des triterpènes.

Test de SALKOWSKI :

Dans le troisième tube, 1 ml de H2SO4 12N est ajouté en inclinant le tube. La formation d’un anneau mauve au niveau de l’interface indique la présence de stérols insaturés.

Les flavonoïdes et leucoanthocyanes (FONG et coll., 1977)

Le résidu est dissous dans 2 ml d’éthanol 80 % puis la solution obtenue est répartie dans trois tubes à essai, dont le premier sert de témoin.

Les flavonoïdes : test de WILSTATER

Deux tests sont réalisés, respectivement dans le deuxième et le troisième tube à essai :
• Test 1 : 0,5 ml d’extrait + 2 ml d’acide chlorhydrique (HCl) 2N ou 0,5 ml de HCl 12N + 2 tournures de magnésium .
• Test 2 : 0,5 ml d’extrait + 2 ml de HCl 2N ou 0,5 ml de HCl 12N + 2 tournures de magnésium + 0,2 ml d’eau distillée + 0,2 ml d’alcool isoamilyque.
La lecture des résultats se fait au bout de 10 min pour les 2 tubes. Le changement de coloration traduit la présence de flavonoïdes, à savoir :
– une coloration rouge pour les flavones .
– une coloration rouge-violacé pour les flavonones .
– une coloration rouge-pourpre pour les flavonols.

Les leucoanthocyanes : Test de BATE – SMITH (FONG et coll., 1977)

Au quatrième tube est ajouté 0,5 ml de HCl 12N, puis le mélange est placé dans un bain-marie bouillant pendant 30 min. Après refroidissement, l’apparition d’une coloration rouge ou rouge-violet indique la présence de leucoanthocyanes.

Les saponines (FONG et coll., 1977)

Le résidu d’évaporation à sec de l’extrait à tester est dissous dans 1 ml d’eau distillée. La solution obtenue est soumise à une agitation énergique pendant 3 secondes. L’apparition d’une mousse de 3 cm de hauteur, persistant pendant 30 min, indique la présence de saponines dans l’extrait.
Si le test de mousse est positif, le test hémolytique est effectué pour confirmer le résultat (voir plus loin § 2.2.1.2. p.32).

Les tanins et polyphénols (HEMINGWAY et KARCHESY, 1989)

Le résidu est repris dans 3 ml d’eau distillée et la solution est répartie dans 4 tubes à essai dont le premier sert de témoin.

Test à la gélatine 1 % :

Dans le deuxième tube sont versées 4 gouttes de gélatine aqueuse 1 %. La présence de tanins hydrolysables de type catéchique dans l’extrait est montrée par la formation d’un précipité blanc.

Test à la gélatine salée :

Quatre gouttes de gélatine salée (gélatine 1% dans une solution de NaCl 1%) sont ajoutées dans le troisième tube. L’apparition d’un précipité blanc indique la présence de tanins de type pyrogallique.

Test au chlorure ferrique :

Quatre gouttes d’une solution méthanolique de chlorure ferrique (FeCl3) à 10 % sont additionnées dans le quatrième tube.
Une coloration bleu-vert traduit la présence de tanins de type catéchol et une coloration noire bleuâtre celle de tanins de type pyrogallol.
Une réaction négative à la gélatine accompagnée d’une réaction positive au chlorure ferrique 10 % (coloration verte ou bleue) traduit la présence de composés phénoliques autres que les tanins.

Les désoxyoses : test de KELLER- KILIANI (FONG et coll., 1977)

Le résidu d’évaporation à sec de l’extrait à analyser est repris dans de l’eau distillée. A 0,5 ml de la solution aqueuse obtenue sont ajoutés 0,5 ml d’une solution aqueuse de FeCl3 (10 %) et 0,5 ml d’acide acétique glacial dans 0,5 ml. Après une légère agitation, 1 ml de H2SO4 12N est versé en inclinant le tube.
L’extrait contient des désoxyoses lorsqu’un anneau pourpre ou rouge se forme à l’interface.

Les alcaloïdes (DALTON, 1979 ; CORDELL, 1981 ; BRUNETON, 1993)

Le résidu obtenu par évaporation à sec de l’extrait à étudier est macéré dans 3 ml de HCl 2N pendant 30 min. La solution ainsi obtenue est répartie dans 4 tubes à essai, dont un sert de témoin et les trois autres sont utilisés pour les trois tests.
La composition des réactifs utilisés pour la détection des alcaloïdes est donnée en annexe 3.

Test de MAYER

Quatre gouttes de réactif de MAYER sont ajoutées dans le deuxième tube. L’apparition d’une floculation ou d’un précipité blanchâtre révèle la présence d’alcaloïdes.

Test de WAGNER

Quatre gouttes de réactif de WAGNER sont ajoutées dans le troisième tube. La présence d’alcaloïdes est indiquée par une floculation ou un précipité.

Test de DRAGENDORFF

Dans le quatrième tube sont ajoutées trois gouttes du réactif de DRAGENDORFF. L’apparition d’une floculation ou d’un précipité montre la présence d’alcaloïdes.

Les iridoïdes (FONG et coll., 1977)

Le résidu d’évaporation est dissous dans 1 ml d’eau distillée. La solution obtenue est agitée puis additionnée de 2 ml de HCl 2N. Le tout est chauffé au bain-marie bouillant pendant 30 min. La présence d’iridoïdes est montrée par l’apparition d’une coloration bleue après refroidissement.

Fractionnement par le n-butanol

L’extrait brut de volume 5 ml est traité trois fois par le n-butanol, selon la méthode décrite au § 2.2.3.3. (p.11). Une phase aqueuse de couleur marron foncé, limpide, ainsi qu’une phase butanolique de couleur jaune paille, limpide sont obtenues. L’injection des deux phases sur souris provoque des symptômes d’intoxication pendant une heure puis les animaux se rétablissent.
Ce procédé n’a pas été retenu car les principes toxiques se partagent entre les deux phases ; c’est pour cela que les deux phases sont peu toxiques.

Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)

L’extrait brut de volume 5 ml est traité par 0,2 ml de solution d’ANP 20 %. L’excès de plomb est éliminé par 0,1 ml de solution aqueuse de phosphate disodique, selon la méthode décrite au § 2.2.3.4. (p.11). A la fin de l’opération, nous avons obtenu un extrait très peu coloré. Son injection provoque des symptômes d’intoxication pendant une heure trente minutes, sans entraîner la mort des souris.
Cette technique ne peut pas être retenue car l’extrait obtenu n’est pas létal, étant donné que la toxine est en partie précipitée par l’ANP.

Méthodes retenues dans le procédé de purification

L’extrait brut de volume 30 ml, est traité par l’éthanol 25 %, selon la méthode décrite au § 2.2.3.5. (p.11). A la fin de l’opération, nous avons obtenu un surnageant limpide, de couleur marron foncé, toxique sur souris. Il constitue l’extrait E1.
Le culot de couleur blanche, repris dans de l’eau distillée et testé sur souris n’est pas toxique. D’après l’analyse par CCM, cette technique permet d’éliminer des contaminants dans le culot.

Degré d’homogénéité des différents produits

L’évolution de l’homogénéité des extraits aux cours des étapes de purification a été suivie par chromatographie sur couche mince, en utilisant le système de solvants : butanol / acide acétique / eau B/A/E (60/20/20 ; p/p/p).
Les différentes bandes sont observées à la lumière ultra-violette de longueur d’onde λ = 254 nm et λ = 366 nm. Les substances apparaissent sous forme de bandes fluorescentes blanches. Elles sont ensuite révélées par le réactif à la vanilline sulfurique (figure 4).
L’extrait brut comporte 7 bandes majeures révélables alors que l’extrait E2 n’en comporte plus que 3. La purification a donc permis d’éliminer 4 bandes majeures.

Table des matières

PREMIERE PARTIE : ETUDE CHIMIQUE
1. INTRODUCTION
2. MATERIELS ET METHODES
2.1. MATERIELS
2.1.1. Matériel végétal
2.1.1.1. Classification
2.1.1.2. Description botanique de Macarisia pyramidata
2.1.1.3. Répartition géographique
2.1.1.4. Date et lieu du récolte
2.1.2. Produits chimiques
2.2. METHODES
2.2.1. Méthode de préparation et de conservation du matériel végétal
2.2.2. Méthode d’extraction des principes toxiques
2.2.2.1. Extraction à froid
2.2.2.2. Extraction à chaud
2.2.3. Méthode de purification
2.2.3.1. Traitement par la chaleur
2.2.3.1.1. Principe
2.2.3.1.2. Mode opératoire
2.2.3.2. Filtration sur charbon actif
2.2.3.2.1. Principe
2.2.3.2.2. Mode opératoire
2.2.3.3. Fractionnement par le n-butanol
2.2.3.3.1. Principe
2.2.3.3.2. Mode opératoire
2.2.3.4. Précipitation par l’acétate neutre de plomb
2.2.3.4.1. Principe
2.2.3.4.2. Mode opératoire
2.2.3.5. Précipitation par l’éthanol 12,5 %
2.2.3.5.1. Principe
2.2.3.5.2. Mode opératoire
2.2.3.6. Dialyse
2.2.3.6.1. Principe
2.2.3.6.2. Mode opératoire
2.2.4. Méthode de concentration
2.2.5. Calcul de rendement
2.2.6. Méthode analytique
2.2.6.1. Chromatographie sur couche mince
2.2.6.1.1. Principe
2.2.6.1.2. Mode opératoire
2.2.6.2. Réactions de détection des familles chimiques
2.2.6.2.1. Les anthraquinones : test de BORNSTRÄGER
2.2.6.2.2. Les triterpènes et stéroïdes
2.2.6.2.2.1. Test de LIEBERMAN-BÜRCHARD
2.2.6.2.2.2. Test de SALKOWSKI
2.2.6.2.3. Les flavonoïdes et leucoanthocyanes
2.2.6.2.3.1. Les flavonoïdes : test de WILSTATER
2.2.6.2.3.2. Les leucoanthocyanes : test de BATE-SMITH
2.2.6.2.4. Les saponines
2.2.6.2.5. Les tanins et polyphénols
2.2.6.2.5.1. Test à la gélatine 1 %
2.2.6.2.5.2. Test à la gélatine salée
2.2.6.2.5.3. Test au chlorure ferrique
2.2.6.2.6. Les désoxyoses
2.2.6.2.7. Les alcaloïdes
2.2.6.2.7.1. Test de MAYER
2.2.6.2.7.2. Test de WAGNER
2.2.6.2.7.3. Test de DRAGENDORFF ..
2.2.6.2.8. Les iridoïdes
3. RESULTATS
3.1. EXTRACTION ET PURIFICATION
3.1.1. Extraction des principes toxiques
3.1.2. Purification
3.1.2.1. Méthodes non retenues dans le procédé de purification
3.1.2.1.1. Traitement par la chaleur
3.1.2.1.2. Filtration sur charbon actif
3.1.2.1.3. Fractionnement par le n-butanol
3.1.2.1.4. Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)
3.1.2.2. Méthodes retenues dans le procédé de purification
3.1.2.2.1. Précipitation par l’éthanol 12,5 %
3.1.2.2.2. Dialyse
3.2. DEGRE D’HOMOGENEITE DES DIFFERENTS PRODUITS
3.3. RENDEMENT EN TOXINE
3.4. CARACTERISATION CHIMIQUE
3.4.1. Propriétés physico-chimiques
3.4.2. Nature chimique
DEUXIEME PARTIE : ETUDE TOXICOLOGIQUE
1. INTRODUCTION
2. MATERIELS ET METHODES
2.1. MATERIELS
2.1.1. Les animaux d’expérience
2.1.1.1. Les souris
2.1.1.2. Les poissons
2.1.1.3. Les têtards
2.1.1.4. Les larves de moustique
2.1.2. Les plantes d’expérimentation
2.1.3. Les germes utilisés et les milieux de culture
2.1.3.1. Les germes utilisés
2.1.3.2. Les milieux de culture
2.1.4. Les disques pour les tests d’antibiogramme
2.1.5. La stérilisation
2.2. METHODES
2.2.1. Méthodes d’étude des effets sur les animaux
2.2.1.1. Chez la souris
2.2.1.1.1. Estimation de la toxicité .
2.2.1.1.2. Détermination de la DL50
2.2.1.2. Test sur les hématies de mouton
2.2.1.2.1. Principe
2.2.1.2.2.Mode opératoire
2.2.1.3. Test sur les animaux à sang froid
2.2.1.3.1. Principe
2.2.1.3.2. Mode opératoire
2.2.1.3.2.1. Expérience sur les alevins de carpe
2.2.1.3.2.3. Expérience sur les têtards
2.2.1.3.2.3. Test sur les larves de moustique
2.2.2. Méthodes d’étude des effets sur les végétaux
2.2.2.1. Etude des effets sur la germination des graines
2.2.2.2. Etude des effets sur la croissance des jeunes plantules
2.2.2.2.1. Principe
2.2.2.2.2. Mode opératoire
2.2.2.3. Etude des effets sur la levée de la dominance apicale
2.2.3. Méthodes d’étude des effets sur la croissance des micro-organismes
2.2.3.1. Identification des germes par la méthode de coloration GRAM
2.2.3.1.1. Principe
2.2.3.1.2. Mode opératoire
2.2.3.2. Etude de l’activité antimicrobienne des extraits
2.2.3.2.1. Principe
2.2.3.2.2. Mode opératoire
2.2.3.3. Détermination de la CMI
2.2.3.4. Détermination de la CMB
3. RESULTATS
3.1. EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD
3.1.1. Effets sur la souris
3.1.1.1. Description des symptômes
3.1.1.2. Détermination de la DL50 (24h)
3.1.2. Activité hémolytique
3.2. EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
3.2.1. Effets de l’extrait brut sur les alevins de carpe
3.2.2. Effets sur les larves de moustique
3.2.3. Effets de EB sur les têtards de grenouille
3.3. EFFETS SUR LES VEGETAUX
3.3.1. Effets sur le pouvoir germinatif des graines
3.3.2. Effets sur la croissance des jeunes plantules
3.3.3. Effets de l’extrait brut et de l’extrait E2 sur le développement des bourgeons axillaires
3.4. EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT ET DE L’EXTRAIT E2 SUR LES MICROORGANISMES
3.4.1. Identification des germes
3.4.2. Activité anti-microbienne des extraits
DISCUSSION ET CONCLUSIONS
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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