Méthodes d’étude des effets in vitro sur les microorganismes

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PROPRIETES BIOLOGIQUES

Les plantes du genre Albizia sont connues pour leurs nombreuses activités biologiques.

Chez les Albizia étrangères :

Plusieurs propriétés thérapeutiques des Albizia étrangères ont été révélées lors des études approfondies. A titre d’illustration, on peut citer :
A. zygia : l’extrait hydroéthanolique présente des propriétés anti-inflammatoire, antipyrétique et analgésique (ABOTSI et coll., 2016) ;
A. lebbeck Benth. présente une activité antidiarrhéique dans ses graines et une activité anti-convulsivante dans ses feuilles (KASTURE et coll., 1996 ; BESRA et coll., 2002) ;
A. julibrissin : les écorces de tige ont des activités antioxydante, anti-tumorale, anti-inflammatoire, cytotoxique et sédative (KANG et coll., 2000 ; JUNG et coll., 2003 ; ZHENG et coll., 2006 ; ZOU et coll., 2006 😉
A. adinocephala : l’extrait méthanolique de l’écorce de tige inhibe l’enzyme plasmepsine II de la malaria (OVENDEN et coll., 2002)
A. anthelmintica : l’extrait de l’écorce de ses racines présente une activité antimicrobienne vis-à-vis de Candida albicans (RUNYODO et coll., 2006)
A. myriophylla : présente une propriété antibactérienne contre Streptococcus mutans ATCCC 25775 et l’extrait éthanolique, les différentes fractions et les composés issus du bois de cette plante présentent une activité inhibitrice de l’alpha-glucosidase (JOYCHARAT, 2013 ; JOYCHARAT et coll., 2017)
A. schimperiana : possède une activité antimicrobienne contre Staphyloccocus aureus et Escherichia coli, une activité cytotoxique vis-à-vis des lignées cellulaires et du cancer des reins (SAMOYLENKO et coll., 2009)
A. odoratissima Benth : l’extrait méthanolique de l’écorce de cette plante présente une activité antidiabétique (KUMAR et coll., 2011).
A. gummifera : l’extrait aqueux de l’écorce de tige est dotée d’une activité antioxydante et anti-infectieuse contre Salmonella (ATSAFACK et coll., 2016). L’extrait hydroéthanolique des graines d’A. gummifera possède une activité toxique (EVALYN, 2012 ; DEBEBE et coll., 2017). L’extrait dichlorométhane, méthanol et acétone des feuilles exercent une activité antimicrobienne sur quatre sérovars de Salmonella (MAHLANGU et coll., 2017).

Description botanique (DUPUY et coll., 2002 ; TERA, 2011 ; web 10)

Description du genre Albizia

Trente espèces d’Albizia sont présentes à Madagascar dont 24 sont endémiques, 3 pantropicales et 3 introduites.
Albizia est un arbre ou arbuste à stipules variables, souvent caducifolié (à feuilles caduques) précoce et à croissance rapide. Les feuilles sont bipennées et les pétioles présentent généralement une glande. Il se caractérise aussi par une inflorescence sphérique à tête hémisphérique, axillaire, solitaire, combinée en une panicule terminale de tête. La plupart des fleurs sont hermaphrodites. La fleur mâle centrale, rarement bisexuée, voire manquante est généralement plus grande que les fleurs bisexuées et présente un long tube staminal plus long et plus large qui forme une tasse pour contenir les grandes quantités de nectar que ces fleurs produisent. La présence de nombreuses étamines, avec plus de deux fois le nombre de pièces de la corolle, est aussi l’un des caractères du genre Albizia. Les cosses sont plates, épaisses et boisées, parfois fortement rétrécies entre les graines et se divisant en deux vannes plates ou indéhiscentes.

Description de l’espèce Albizia gummifera

Albizia gummifera (figure 1, p. 12) est un arbre caducifolié qui peut atteindre 30 m de hauteur et jusqu’à 75 à 100 cm de diamètre. Le bois, tendre est de couleur blanche légèrement rosée. L’écorce est généralement fibreuse, lisse de couleur jaunâtre à grise. Les feuilles sont alternes, composées bipennées puis paripennées asymétriques. Les folioles sont obliques et souvent auriculées au côté proximal de la base. L’inflorescence est axillaire sur un pédoncule de 2,5 – 5 cm de long. Les fleurs sont bisexuées avec des étamines nombreuses et de 2,5 – 3,5 de long et un ovaire supère et ellipsoïde de 1,5 – 2,5 mm de long. Elles sont régulières, pentamères et de couleur blanc-rougeâtre. Les fruits sont généralement des gousses aplaties, oblongues, ligneuses, pouvant renfermer 9-12 graines.

Date et lieu de récolte

La plante a été récoltée en Novembre 2016 dans le Parc de Tampolo, région d’Alaotra Mangoro (partie Est de Madagascar : Fenerive-Est). Elle était au stade de fructification

Préparation et conservation du matériel végétal

Après la récolte, les écorces de tige d’Albizia gummifera sont séchées pendant environ 1mois dans un endroit propre et aéré à l’abri du soleil. Ensuite, les écorces séchées sont découpées en petits morceaux puis broyées à l’aide d’un mini-broyeur de marque IKA (MF10) jusqu’à pulvérisation. La poudre fine obtenue est conservée dans un bocal bien fermé et placé dans un endroit sec à la température ambiante. Elle constitue notre matériel d’étude.

Les produis chimiques

Les produits chimiques utilisés durant les expériences sont de marque Merck et Prolabo, de qualité pure ou « pour analyse ».
Le support prêt à l’emploi utilisé pour la chromatographie sur couche mince (CCM) est le gel de silice 60F254 de marque Merck, muni d’un indicateur de fluorescence, étalé sur des plaques en plastique de 20 x 20 cm de dimensions (épaisseur de la couche : 0,2 mm).

METHODES

Méthodes d’extraction des principes actifs

Extraction à froid

La poudre d’écorces de tige est mise en suspension dans le solvant d’extraction (éthanol 75%) suivant le rapport 1/10 (p/v), c’est-à-dire 1 g de poudre dans 10 ml de solvant. Le mélange est agité pendant 3 h à la température ambiante sur un agitateur magnétique. Il est ensuite laissé macérer pendant une nuit à + 4°C. Après macération, la suspension est de nouveau agitée pendant 30 min puis filtrée sur 4 épaisseurs de gaze pour écarter le marc. Le filtrat est ensuite centrifugé à 10 000 tours/min pendant 15min à l’aide d’une centrifugeuse de marque Hettich (Universal II). Le culot obtenu est éliminé. Le surnageant est concentré à l’aide d’un évaporateur rotatif de marque Büchi (Rotavapor R110) jusqu’à ce que son volume atteigne le rapport 1/1 (p/v) c’est-à-dire 1 ml d’extrait pour 1 g de poudre (voir méthode au paragraphe 2.3, p. 15). Une deuxième centrifugation à 10 000 tours/min pendant 5 min s’avère nécessaire pour éliminer le trouble apparu lors de la concentration. Le second surnageant constitue l’extrait brut.

Extraction à chaud

La poudre végétale est délayée dans l’eau distillée suivant le rapport 1/10 (p/v). Le mélange est ensuite chauffé à reflux sous agitation magnétique (décoction) pendant 3 h. Le mélange refroidi est laissé macérer à +4°C pendant une nuit. La suite de l’opération est identique à celle de la méthode d’extraction à froid (voir paragraphe 2.1.1, p. 13).

Méthodes de purification

Fractionnement par le n-butanol (MAHUZIER et HAMON, 1990 ; BRUNETON, 1993)

Principe

Cette méthode de purification consiste à séparer les molécules d’un extrait par partition entre deux solvants différents non miscibles : l’eau et le n-butanol.

Mode opératoire

Dans une ampoule à décanter, l’extrait à purifier est mélangé volume à volume avec le n-butanol. Après une forte agitation, le mélange est laissé décanter jusqu’à la séparation nette de deux phases : une phase supérieure butanolique et une phase inférieure aqueuse. La phase butanolique est recueillie alors que la phase aqueuse est soumise à 4 autres traitements identiques au premier. Les 5 phases butanoliques rassemblées sont filtrées sur papier filtre pour éliminer les éléments insolubles, puis évaporées pour éliminer le butanol après addition d’un grand volume d’eau distillée. Le butanol résiduel de la phase aqueuse est aussi évaporé.

Traitement par le charbon actif (JEANNODA, 1986)

Principe

Le charbon actif est un support chromatographique permettant d’adsorber un grand nombre de composés, notamment ceux à structure aromatique. Cette technique est utilisée pour dépigmenter les extraits végétaux.

Mode opératoire

Une couche de charbon actif est déposée dans un entonnoir bouché avec des fibres de verre et adapté à une fiole reliée à une pompe à vide.
La solution à traiter est déposée minutieusement sur la couche de charbon actif imprégné d’eau distillée, puis filtrée sous pression réduite. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur papier Whatman pour éliminer les fines particules de charbon actif.

Méthode de concentration

Toutes les opérations d’évaporation de solvant et de réduction de volume d’extraits sont réalisées à l’aide d’un évaporateur rotatif de marque Büchi (Rotavapor R110), à la température de 45°C – 50°C. La pression est réduite à l’aide d’une pompe à vide.

Calcul du rendement

Les extraits obtenus lors de l’extraction et des différentes étapes de purification sont évaporés à sec. Les résidus secs obtenus sont ensuite pesés afin de déterminer le rendement à partir de la formule suivante : Rendement(%) =0.
Cette formule permet de calculer 3 types de rendement :
le rendement d’extraction au niveau de l’extrait brut par rapport au matériel de départ ;
le rendement de purification au niveau de l’extrait purifié par rapport à l’extrait brut ;
le rendement en toxines au niveau de l’extrait purifié par rapport au matériel de départ.

Méthodes d’analyse

Chromatographie sur couche mince (AUDIGIE et coll., 1989 ; MAHUZIER et HAMON, 1990 ; HAHN-DEINSTROP, 2007).

Principe

La CCM est une méthode d’analyse basée sur les phénomènes de partage et d’adsorption. La vitesse de déplacement des substances dépend de leur affinité pour la phase mobile organique d’une part, et des forces d’adsorption dues au support d’autre part.

Mode opératoire

Préparation de la cuve chromatographique

Cette première étape consiste à saturer l’enceinte de la cuve avec les vapeurs du solvant de chromatographie. Pour ce faire, celui-ci est introduit dans la cuve et son niveau est ajusté à 5 mm du fond. Les faces internes de la cuve sont tapissées de papier filtre et il est hermétiquement fermé.

Extrait chloroformique

Un gramme de poudre ou de résidu sec est délayé dans 10 ml de chloroforme. Le mélange est laissé macérer pendant une nuit à +4°C. Le macérat est ensuite filtré sur du coton hydrophile. Le filtrat obtenu constitue l’extrait chloroformique utilisé pour détecter les stéroïdes et les triterpènes.

Extrait acide

La poudre ou le résidu sec pesant 1 g est laissé macérer dans 10 ml d’acide chlorhydrique (HCl) l2 N, pendant une nuit à +4°C. La solution obtenue après filtration correspond à l’extrait acide, utilisé pour la détection des alcaloïdes.

Réactions de détection des familles chimiques (BRUNETON, 1993)

Les alcaloïdes

Quatre tubes à essai contenant chacun 1 ml d’extrait acide sont nécessaires pour la manipulation. Les trois premiers tubes sont utilisés respectivement pour les tests de MAYER, de DRAGENDORFF et de WAGNER. Le 4ème tube sert de témoin. La composition des réactifs est donnée en ANNEXE I.
a)Test de MAYER : L’extrait acide du premier tube à essai reçoit cinq gouttes de réactif de MAYER. La formation d’un précipité indique la présence d’alcaloïdes dans l’extrait testé.
b)Test de DRAGENDORFF : Cinq gouttes de réactif de DRAGENDORFF sont versées dans l’extrait du tube 3. L’apparition d’un précipité blanc révèle la présence d’alcaloïdes.
c)Test de WAGNER : Cinq gouttes de réactif de WAGNER sont versées dans le deuxième tube à essai. L’apparition d’un précipité démontre la présence d’alcaloïdes dans l’extrait testé.
Un test de confirmation est réalisé pour les résultats positifs : après addition de 5 gouttes d’éthanol 80% dans chaque tube, les précipités disparaissent, ce qui confirme la présence des alcaloïdes dans l’extrait à tester.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. UTILISATION EN MEDECINE TRADITIONNEL
2. STRUCTURES CHIMIQUES DES PRINCIPES CTIFS
2.1. Chez les Albizia étrangères
2.1. Chez les Albizia malgaches
3. PROPRIETES BIOLOGIQUES
3.1. Chez les Albizia étrangères
3.2. Chez les Albizia malgaches
Première partie : ETUDE CHIMIQUE
INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
1. MATERIELS
1.1. Matériel végétal
1.1.1. Classification de la plante
1.1.2. Description botanique
1.1.2.1. Description du genre Albizia
1.1.2.2. Description de l’espèce Albizia gummifera
1.1.3. Répartition géographique d’Albizia gummifera
1.1.4 Date et lieu de récolte
1.2. Préparation et conservation du matériel végétal
1.3. Les produits chimiques
2. METHODES
2.1. Méthodes d’extraction des principes actifs
2.1.1. Extraction à froid
2.1.2. Extraction à chaud
2.2 Méthodes de purification
2.2.1. Fractionnement par le n-butanol
2.2.1.1. Principe
2.2.1.2. Mode opératoire
2.2.2. Traitement par le charbon actif
2.2.2.1. Principe
2.2.2.2. Mode opératoire
2.3. Méthode de concentration
2.4. Calcul du rendement
2.5. Méthodes d’analyse
2.5.1. Chromatographie sur couche mince
2.5.1.1. Principe
2.5.1.2.1. Préparation de la cuve chromatographique
2.5.1.2.2. Dépôt des échantillons
2.5.1.2.3. Développement du chromatogramme
2.5.1.2.4. Révélation du chromatogramme
2.5.2. Criblage phytochimique
2.5.2.1. Préparation des extraits
2.5.2.1.1. Extrait aqueux
2.5.2.1.2. Extrait hydroéthanolique
2.5.2.1.3. Extrait chloroformique
2.5.2.1.4. Extrait acide
2.5.2.2. Réaction de détection des familles chimiques
2.5.2.2.1. Les alcaloïdes
a) Test de MAYER
b) Test de DRAGENDORFF
c) Test de WAGNER
2.5.2.2.2. Les saponosides : Test de mousse
2.5.2.2.3. Les tanins et les polyphénols
2.5.2.2.4. Les désoxyoses : Test de KELLER-KILIANI
2.5.2.2.5. Les iridoïdes
2.5.2.2.6. Les anthraquinones : Test de BORNTRAGER
2.5.2.2.7. Les flavonoïdes et leucoanthocyanes
a) Les flavonoïdes : test de WILLSTATTER
b) Les leucoanthocyanes : test de BATE-SMITH
2.5.2.2.8. Les stéroïdes et les triterpènes
a) Test de LIEBERMANN-BURCHARD
b) Test de SALKOWSKI
RESULTATS
1. EXTRAITS OBTENUS
1.1. Extraits obtenus à froid
1.1.1. Extrait aqueux
1.1.2. Extrait hydroéthanolique
1.2. Extrait aqueux à chaud
2. EXTRAITS PURIFIES
2.1. Extrait butanolique
2.2. Extrait charbon actif
3. RENDEMENTS
4. DEGRE D’HOMOGENEITE DES EXTRAITS
5. CARACTERISATION CHIMIQUE
5.1. Propriétés physico-chimiques
5.2. Nature chimique
DISCUSSION ET CONCLUSIONS
Deuxième partie : ETUDE TOXICOLOGIQUE
INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
1. MATERIELS
1.1. Les animaux d’expérimentation : animaux à sang chaud
1.2. Les matériels de microbiologie
1.2.2. Les milieux de culture
1.2.3. Les disques d’antibiogramme
2. METHODES
2.1. Méthodes d’étude des effets sur souris
2.1.1. Voies d’administration des extraits
2.1.1.1. Par voie orale (gavage)
2.1.1.2. Par voie intrapéritonéale (ip)
2.1.2. Détermination de la DL 50 (24 h) par voie ip
2.1.2.1. Méthode de REED et MUENCH (1938)
2.1.2.2. Méthode graphique de BOYD (1966)
2.2. Méthodes d’étude des effets in vitro sur les microorganismes
2.2.1. Stérilisation
2.2.2. Détermination de l’activité antimicrobienne des extraits
2.2.2.1. Principe
2.2.2.2. Mode opératoire
2.2.3. Détermination de la CMI
2.2.3.1. Méthode de dilution en milieu liquide sur microplaque
2.2.4. Détermination de la CMB
2.3 .Etude de l’activité antioxydante.
2.3.1. Principe
2.3.2. Mode opératoire
RESULTATS
1 EFFET DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD
1.1.Description des symptômes d’intoxication
1.2.Détermination de la DL 50 (24 h)
2. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES
2.1. Activité antimicrobienne des différents extraits bruts et purifiés
2.2. Détermination de la CMI et la CMF
2.2.1 Détermination de la CMI
2.2.2 Détermination de la CMF
3. ACTIVITE ANTIOXYDANTE
DISCUSSION – CONCLUSIONS
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
REFERENCES WEBOGRAPHIQUES

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