Méthodes d’étude des effets des extraits sur les microorganismes

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Propriétés biologiques des espèces d’Albizia

Les quelques espèces d’Albizia étudiées au LABASM (voir introduction générale), ont montré une activité toxique sur souris. Leurs extraits lysent les hématies de mouton ; certaines sont également toxiques sur quelques animaux à sang froid comme les têtards et les alevins de poisson ou inhibent soit la croissance de graines de Monocotylédones ou Dicotylédones, soit la croissance des jeunes plantules (ANDRIANTSOA, 1983 ; RANDRIANARIVO, 1996 ; RAKOTONDRASOA, 2000 ; RAJEMIARIMOELISOA, 2001 ; RAONIHARISOA, 2003).
D’après la littérature, certains Albizia sont toxiques comme A. versicolor dont les jeunes cosses ont causé des empoisonnements appelés albiziosis, au bétail : ce qui a entraîné la mort des moutons et des cobayes qui les ont consommées (GUMMOW et ERASMUS, 1990 ; GUMMOW et al., 1992). Les premières manifestations de cette maladie se produisent à la fin de l’hiver ou au commencement de l’automne quand les cosses sont soufflées des arbres et elle se manifeste par des crises convulsives précédant la mort de l’animal. Les graines d’A. julibrissin sont aussi très toxiques du fait qu’elles contiennent de puissantes neurotoxines (ZOU et al., 2006). Il en est de même pour les extraits de feuilles d’A. boinensis (AHMED, 2009). A. odorata contient une toxine de nature saponosidique appelée albodorine, toxique pour divers animaux comme le rat, souris, cobaye, grenouilles, poisson, mollusque et moustique (RAJEMIARIMOELISOA, 2001).

Propriété antimicrobienne

Certaines Albizia ont une propriété antimicrobienne ; c’est le cas de: A. arenicola (RANDRIANARIVO, 1996) ; A. procera (DURAIPANDIYAN et al., 2006) et A. myriophylla (RUKAYADI et al., 2008) qui sont actifs sur Candida albicans. C’est aussi le cas d’A. gummifera avec une CMI de 6,3 μg/ml (HAILU et al., 2005 ; RUKUNGA et al., 2007). D’après les recherches faites par AGYARE et al. en 2006 ; A. ferruginea est actif sur Pseudomonas aeruginosa (MBOSSO et al., 2010).

Utilisations thérapeutiques

Certaines d’entre ces Albizia sont utilisées en thérapeutique traditionnelle :
– le décocté d’écorces d’Albizia lebbeck est utilisé pour traiter les manifestations allergiques telles que l’asthme, l’eczéma, le prurit. Les graines sont utilisées pour soigner les maladies vénériennes (RAJEMIARIMOELISOA, 2000).
– les tiges et les feuilles d’Albizia gummifera sont utilisées pour soigner la blennorragie, la diarrhée et certaines maladies nerveuses (PERNET, 1957).
– les écorces d’Albizia anthelmintica sont employées comme anthelminthique (BOITEAU et ALLORGE-BOITEAU, 1993 ; RUNYORO et al., 2006 ; GALAL et al., 1991).
– les feuilles d’Albizia fastigiata sont utilisées contre la syphilis (PERNET, 1957).
– les recherches antérieures ont révélé le pouvoir antiparasitaire de certaines espèces d’Albizia, telle A. anthelmintica employée comme anthelmintique (RUNYORO et al, 2006).
– A. gummifera a une propriété anti-Plasmodium (RUKUNGA et al, 2007), l’extrat aqueux de feuille d’A. adinocephala agit aussi contre Plasmodium falciparum (OVENDEN et al, 2002).
– les extraits d’Albizia julibrissin présentent une activité cytotoxique (WON et al., 2006).
– en Inde, A. odoratissima est utilisé pour traiter la lèpre et les ulcères de la peau (RAO et al., 2002).

Préparation et conservation du matériel végétal

Les graines sont broyées à l’aide d’un mixer de marque SATELLITE jusqu’à l’obtention d’une poudre fine. Cette dernière, conservée dans des bocaux hermétiquement fermés, constitue le matériel végétal d’étude.

LES PRODUITS CHIMIQUES

Les produits chimiques ainsi que les solvants utilisés, de marque « Prolabo » et «Merck » sont de qualité pure ou « pour analyse ».
Le support employé pour la chromatographie sur couche mince (CCM) est le gel de silice Kieselgel 60 F254 de marque MERCK étalé sur des feuilles en plastique (plaque prête à l’emploi de 20 x 20 cm de dimensions et de 20 μm d’épaisseur, munie d’un indicateur de fluorescence à la longueur d’onde λ = 254 nm).

Extraction par épuisements

La poudre végétale est soumise à une extraction par épuisements successifs avec des solvants de polarité croissante, à savoir l’hexane, l’acétate d’éthyle et le méthanol. Les caractéristiques de ces solvants sont données en ANNEXE II.
C’est une méthode basée sur l’affinité des molécules présentes dans le matériel végétal vis-à-vis du solvant. La poudre végétale (50 g) est délayée dans le premier solvant selon le rapport 1/30 poids/volume (P/V), soit 1 g de poudre délayé dans 30 ml de solvant. Ce rapport permet d’obtenir une suspension fluide. Le mélange est mis à macérer pendant 17 h sous agitation magnétique à la température du laboratoire (entre 20 et 25°C). La mixture est ensuite filtrée sur coton hydrophile. Le filtrat est récupéré, puis évaporé à sec sous pression réduite à l’évaporateur rotatif (cf. § 2.4. page 13) tandis que le marc est réépuisé avec le même solvant de même volume. L’opération est répétée jusqu’à ce que la poudre soit épuisée totalement, état prouvé par la décoloration du filtrat obtenu. Les résidus secs sont rassemblés et laissés sécher à l’air libre, puis pesés pour en déduire le rendement tandis que le marc est épuisé de la même manière avec le solvant suivant, plus polaire que le précédent. Après l’épuisement par le solvant le plus polaire, les résidus sont conservés à la température ambiante jusqu’à leur utilisation. Ainsi, à la fin de l’extraction, 3 extraits sont obtenus : l’extrait hexanique (EB1), l’extrait acétate d’éthyle (EB2) et l’extrait méthanolique (EB3).

Extraction aqueuse à froid

La poudre végétale est délayée dans l’eau distillée suivant le rapport 1/10 (P/V). Le mélange est homogénéisé par agitation magnétique pendant 3 h à la température ambiante, puis laissé macérer pendant une nuit à +4°C. Le macérat est ensuite filtré après avoir été agité de nouveau pendant 1 h. Le marc est éliminé tandis que le filtrat est centrifugé à 10 000 tours/min pendant 15 min à l’aide d’une centrifugeuse de marque Jouan (modèle TH 12). On obtient deux phases : le culot est éliminé alors que le surnageant est récupéré et son volume est réduit jusqu’au rapport 1/1 (P/V). Autrement dit, si le matériel de départ pèse 1 g, après extraction, le volume du surnageant est ramené à 1 ml par évaporation. La solution obtenue constitue l’extrait brut (EB).

Fractionnement par l’acétate d’éthyle

(KAMOUN, 1991 ; RAKOTONIAINA, 2008)
L’extrait à traiter est repris dans de l’eau distillée et subit ce fractionnement visant à extraire les produits ayant une affinité pour l’acétate d’éthyle. L’extrait aqueux est mélangé volume à volume avec l’acétate d’éthyle dans une ampoule à décanter, le mélange est agité fortement puis laissé reposer jusqu’à séparation nette de deux phases : la phase supérieure, appelée phase organique, est recueillie alors que la phase inférieure, appelée phase aqueuse, est soumise à deux autres traitements identiques au premier.
Les trois phases organiques rassemblées ainsi que les phases aqueuses sont évaporées l’une après l’autre afin d’éliminer totalement l’acétate d’éthyle, en y ajoutant une certaine quantité d’eau distillée. Les solutions finales sont enfin ramenées à leur volume initial par concentration.

Fractionnement par le n-butanol

La technique est la même que celle décrite à propos du fractionnement par l’acétate d’éthyle. L’extrait à purifier subit 3 traitements par le n-butanol. Les solutions finales sont enfin ramenées à leur volume initial par concentration.

METHODE DE CONCENTRATION

Toutes les opérations de concentration d’extrait et d’évaporation de solvants sont effectuées à l’évaporateur rotatif (ROTAVAPOR R110) à 50°C. La pression est réduite au moyen d’une pompe à vide.

Révélation du chromatogramme

La révélation se fait :
– soit par visualisation des substances ayant migré sous lumière ultraviolette à 254nm et à 366 nm. Les constituants apparaissent sous forme de taches violette fluorescentes .
– soit par pulvérisation de la plaque avec le réactif à la vanilline sulfurique. Les constituants apparaissent sous forme de taches rose-violacé qui deviennent noires après chauffage à 120°C pendant 5 min.
La composition du réactif à la vanilline sulfurique est donnée en ANNEXE III.
La référence frontale (Rf) de chaque tache est calculée par la formule suivante (MOGODE, 2005) : ??=Distance parctourue par la Substance (mm)Distance parcourue par le Solvant (mm)

Réactions de détection des familles chimiques (Criblage phytochimique)

Le criblage phytochimique peut être effectué sur la poudre végétale de la plante ou encore sur le résidu sec après évaporation de l’extrait à analyser. Ainsi, on doit préparer 4 extraits à partir de la poudre végétale ou du résidu sec : un extrait aqueux pour la détection des saponosides, des tanins et polyphénols, des irridoïdes, désoxyoses ; un extrait hydroéthanolique pour détecter les quinones, les flavonoïdes ; un extrait chloroformique pour les alcaloïdes et un extrait chloroformique pour détecter les triterpenes et les stéroïdes.

Extrait aqueux

On mélange la poudre ou le résidu à tester avec de l’eau distillée ; après une légère agitation, le mélange est placé dans un bain-marie à 95°C pendant 30 min, laissé macérer à +4°C pendant une nuit puis filtré pour éliminer le marc.

Détection des saponosides

L’extrait aqueux est agité vigoureusement pendant 30 s puis laissé reposer pendant 3min : la présence de saponosides dans un extrait est marquée par la présence d’une mousse de plus de 3cm qui persiste 3 min après agitation.

Détection des tanins et polyphénols

L’extrait aqueux est réparti dans 4 tubes à essai : le premier sert de témoin et les trois autres pour détecter la présence des tanins condensés, des tanins hydrolysables et des polyphénols :

Test à la gélatine

Le deuxième tube reçoit 4 gouttes de gélatine à 1%. L’apparition d’une floculation blanche indique la présence de tanins hydrosolubles de type catéchique et la formation de précipité celle de polyphénols.

Test à la gélatine salée

Quatre gouttes de gélatine salée (10 g de chlorure de sodium (NaCl) dans 100 ml de gélatine aqueuse à 1%) sont versées dans le troisième tube. La présence de tanins condensés de type pyrogallique se traduit par la formation d’un précipité.

Test au chlorure ferrique

Quatre gouttes de chlorure ferrique (FeCl3) à 10% en solution méthanolique sont ajoutées dans le quatrième tube. Une coloration bleu-vert et l’apparition d’un précipité vert-noir indiquent la présence de tanins de classe catéchol, tandis que le virage de la coloration en noir bleuâtre dénote la présence de tanins hydrolysables de type pyrogallol.
Une réaction négative au test à la gélatine salée accompagnée d’une coloration verte de la solution indique la présence d’un autre composé phénolique.

Détection des désoxyoses : test de KELLER-KILIANI

Dans un tube à essai, l’extrait est dissous dans une solution de FeCl3 10% additionnée de 4 ml d’acide acétique glacial (18 N). Après une légère agitation, le mélange est additionné de 0,5 ml d’acide sulfurique (H2SO4) 36 N. L’apparition d’un anneau pourpre à l’interface indique la présence de désoxyoses.

Extrait hydroéthanolique

Pour ce type d’extrait, la poudre végétale ou le résidu sec sont additionnés d’éthanol 75%. Le mélange est laissé macérer pendant 24 h à 4°C puis filtré. Le filtrat constitue l’extrait hydroéthanolique.

Détection des quinones : test de BORNTRÄGER

L’extrait hydroéthanolique est versé dans une ampoule à décanter puis ajouté d’un égal volume de benzène. Après agitation, le mélange est laissé au repos jusqu’à l’apparition de deux phases. 0,5 ml d’ammoniaque (NH4OH) 25% y est ensuite versé et après une légère agitation, une coloration violacée de la phase inférieure indique la présence de quinones dans la plante.

Détection des flavonoïdes : test de WILSTATER

L’extrait hydroéthanolique est réparti dans 3 tubes à essais dont le premier sert de témoin : l’extrait dans le deuxième tube est additionné de 0,5 ml de HCl 12 N et de 2 tournures de magnésium. La présence de flavonoïdes est observée après 10 min : elle se traduit par le changement de la coloration de la solution :
– en rouge pour les flavones.
– en rouge pourpre pour les flavonols.
– en rouge violacé pour les flavonones.
L’extrait hydroéthanolique dans le troisième tube est aussi additionné de 0,5 ml de HCl 12 N et de 2 tournures de magnésium mais après la dissolution des tournures de magnésium, 1ml d’eau distillée et 1ml d’alcool isoamilique sont versés. Au bout de 10 min, le virage au rouge de la phase supérieure montre la présence de flavones dans la solution tandis que le changement de la coloration au rouge-pourpre ou rouge violacé indique respectivement la présence de flavonols ou de flavonones.

FRACTIONNEMENT PAR L’ACETATE D’ETHYLE

L’extrait brut méthanolique a été soumis à un fractionnement par l’acétate d’éthyle selon la méthode décrite au § 2.2.1. (page 13). La phase aqueuse obtenue, de couleur marron, limpide et de goût amer, s’est avérée plus toxique que la phase organique. La suite de la purification a été donc effectuée sur cette phase aqueuse appelée E1.

FRACTIONNEMENT PAR LE N-BUTANOL

L’extrait E1, fractionné par le n-butanol (cf. § 2.2.2. page 13), donne une phase organique ou butanolique (Eb) limpide, de couleur marron et de goût amer, toxique sur souris jusqu’à une concentration de 2 mg/ml. Cette phase organique, appelée E2, a été utilisée pour la détermination de la DL50 et pour tout le reste du travail.
En résumé, le procédé d’extraction et de purification comprend : une extraction par épuisements suivie d’une purification par un traitement par l’acétate d’éthyle, puis un traitement par le n-butanol. Il est montré sur la figure 4.

Etude des effets sur les animaux à sang chaud

(RAJEMIARIMOELISOA, 2000 ; RANDRIAMAMPIANINA, 2008)

Estimation de la toxicité par voie intrapéritonéale

La toxicité aiguë sur souris est estimée par injection par voie intrapéritonéale (ip) d’un volume de 0,3 ml d’extrait pour 25 g de souris. La souris est tenue par la peau de la nuque, pincée entre le pouce et l’index d’une main. L’extrait est injecté au niveau de l’abdomen (http://www.research.psu.edu/arp/experimental-guidelines/administration). Pour chaque test, un lot de trois souris est utilisé et un autre lot de trois souris sert de témoin.).

Méthode de détermination de la DL50 (24 h)

La dose létale 50% (24 h) ou dose qui tue 50% des animaux testés pendant 24 h, est estimée par la méthode de REED et MUENCH (1938). Six doses en progression géométrique de l’extrait à étudier sont injectées à six lots de cinq souris de même sexe de 25 ± 2 g. Ces doses se situent entre la plus faible dose entraînant la mort de 100% des animaux testés (DL100) et la dose la plus élevée provoquant 0% de mortalité (DL0). L’extrait à tester est administré par voie ip à raison de 0,3 ml pour 25 g de poids de souris. Les souris sont laissées à jeun 24 h avant le test. Par cette méthode, la valeur de la DL50 (24 h) est calculée de deux façons : – Soit par la formule suivante Avec : B = dose immédiatement inférieure à la DL50 Log DL 50=log??+(0,5−??)(??−??)log??.

Table des matières

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Première partie : ETUDE CHIMIQUE
A-INTRODUCTION
B- MATERIELS ET METHODES
1. MATERIELS
1.1. La plante
1.1.1. Classification
1.1.2. Déscription botanique
1.1.3. Distribution géographique
1.1.4. Date et lieu de récolte
1.1.5. Préparation et conservation du matériel végétal
1.2. Les produits chimiques
2. METHODES
2.1. Méthodes d’extraction des principes actifs
2.1.1. Extraction par épuisement
2.1.2. Extraction aqueuse à froid
2.2. Méthodes de purification
2.2.1. Fractionnement par l’acétate d’éthyle
2.2.2. Fractionnement par le n-butanol
2.3. Méthode de concentration
2.4. Calcul du rendement
2.5. Méthodes d’analyse
2.5.1. Chromatographie sur couche mince
2.5.1.1. Principe
2.5.1.2. Mode opératoire
2.5.1.2.1. Dépôt de l’échantillon
2.5.1.2.2. Développement de la plaque
2.5.1.2.3. Révélation du chromatogramme
2.5.2. Réactions de détection des familles chimiques (criblage phytochimique)
2.5.2.1. Extrait aqueux
2.5.2.1.1. Détection des saponosides
2.5.2.1.2. Détection des tanins et polyphenols
a) Test à la gélatine
b) Test à la gélatine salée
c) Test au chlorure ferrique
2.5.2.1.3. Détection des irridoïdes
2.5.2.1.4. Détection des desoxyoses : test de KELLER-KILIANI
2.5.2.2. Extrait hydroéthanolique
2.5.2.2.1. Détection des quinones : test de BORNTRÄGER
2.5.2.2.2. Détection des flavonoides : test de WILSTATER
2.5.2.2.3. Détection des leucoanthocyanes : test de BATE-SMITH
2.5.2.3. Extrait acide
2.5.2.3.1. Détection des alcaloides
a) Test de MAYER
b) Test de WAGNER
c) Test de DRAGENDORFF
2.5.2.4. Extrait chloroformique
2.5.2.4.1. Détection des steroides, triterpenes :test de LIEBERMANN-BURCHARD
2.5.2.4.2. Détection des sterols insatures : test de SALKOWSKI
C-RESULTATS
1. EXTRACTION
1.1. Extraction par épuisement
1.2. Extraction aqueuse à froid
2. PURIFICATION
2.1. Fractionnement par l’acétate d’éthyle.
2.2. Fractionnement par le n-butanol
3. DEGRE D’HOMOGENEITE DES EXTRAITS
4. CARACTERISATION CHIMIQUE
4.1. Propriétés physico-chimiques.
4.2. Nature chimique
D- DISCUSSION ET CONCLUSION
Deuxième partie : ETUDE TOXICOLOGIQUE
A.INTRODUCTION
B.MATERIELS ET METHODES
1. MATERIELS
1.1. Les animaux d’experimentation
1.1.1. Les souris
1.1.2. Les rats
1.1.3. Les têtards
1.1.4. Les poussins
1.2. Les végétaux d’experimentation
1.3. Les microorganismes
1.4. Les milieux de culture
1.4.1. Milieu solide : milieu de MUELLER-HINTON
1.4.2. Milieu liquide : BOUILLON NUTRITIF (POOR BROTH)
1.5. Les disques pour antibiogramme
2. METHODES
2.1. Méthodes d’etude des effets des extraits sur les animaux
2.1.1. Etude des effets sur les animaux à sang chaud
2.1.1.1. Test sur les souris
2.1.1.1.1. Estimation de la toxicité par voie intrapéritonéale
a) Test de toxicité aiguë
b) Méthode de détermination de la DL50 (24 h)
2.1.1.1.2. Estimation de la toxicité par voie orale : gavage
2.1.1.2. Test sur les rats
2.1.1.3. Test sur les poussins
2.1.2. Etude des effets sur les animaux à sang froid
2.1.2.1. Test sur les têtards de grenouille
2.1.2.1.1. Principe
2.1.2.1.2. Mode opératoire
2.2. Méthodes d’étude des effets des extraits sur les végétaux
2.2.1. Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines
2.2.1.1. Etude préliminaire
2.2.1.2. Etude de l’effet-dose sur le pouvoir germinatif des graines
2.2.2. Etude des effets sur les bourgeons axillaires
2.3. Méthodes d’étude des effets des extraits sur les microorganismes
2.3.1. Technique de stérilisation
2.3.2. Détermination de l’activité antimicrobienne
2.3.2.1. Principe
2.3.2.2. Mode opératoire
2.3.3. Détermination de la CMI par observation macroscopique
2.3.3.1. Principe
2.3.3.2. Mode opératoire
2.3.4. Détermination de la CMB par encemensement en milieu solide
C-RESULTATS
1. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX
1.1. Effets sur les animaux a sang chaud
1.1.1. Effets sur la souris
1.1.1.1. Administration par injection intrapéritonéale
1.1.1.1.1. Toxicité aiguë
1.1.1.1.2. Détermination de la DL50 24 h
1.1.1.2. Administration par voie orale: gavage
1.1.2. Effets sur les rats : test par gavage
1.1.3. Effets sur les poussins
1.2. Effets sur les animaux à sang froid
1.2.1. Effets sur les têtards de grenouille
2. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES VEGETAUX
2.1. Effets sur le pouvoir germinatif des graines
2.1.1. Test préliminaire
2.1.2. Effet-dose
2.2. Effets sur les bourgeons axillaires
3. EFFET DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES
3.1. Détermination de l’activité antimicrobienne
3.2. Détermination de la CMI et de la CMB
3.2.1. Détermination de la CMI
3.2.2. Détermination de la CMB
D- DISCUSSION ET CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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