Méthodes de synthèse des 1,2,3-triazènes

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Paludisme viscéral évolutif

Il survient en zone d’endémie, essentiellement chez les enfants soumis à une infection répétée de P. falciparum et/ou P. vivax et se soumettant à une chimioprophilaxie peu efficace. La forme subaigüe ou chronique du paludisme, le tableau clinique associé est le suivant : une anémie parfois intense, un subictère, une splénomégalie constante, une fébricule irrégulière à 38 ºC et parfois des poussées thermiques plus importantes (Malin Trop Afrique., 2002).

Fièvre bilieuse hémoglobinurique

Elle est une complication qui survenait chez les sujets paludéens traités par la quinine. Elle est consécutive à un éclatement massif des globules rouges. Cliniquement, le début est brutal et marqué par des lombalgies violentes, un état de prostration, une fièvre avec vomissement, un ictère hémolytique une anémie et un collapsus (Brune l. F., et col. 2002).

Diagnostic biologique

Les techniques de diagnostic actuellement utilisées comprennent la mise en évidence des parasites ou du matériel du parasite, antigène (ADN) dans les prélèvements et le titrage des anticorps anti-plasmodiums dans le sérum.

Diagnostic direct

 Technique de référence : Goutte Epaisse (GE), Frottis Mince (FM)

La recherche du parasite par les techniques du frottis mince et de la goutte épaisse colorés au Giemsa. Il faut d’abord effectuer un prélèvement de sang chez le malade en recueillant sur lame porte objet par piqûre à l’aide d’un vaccinostyle au bout du doigt, au lobule de l’oreille ou au talon chez l’enfant après infection. Le frottis mince permet l’identification précise du Plasmodium puisque les hématies peuvent être observées de même que la morphologie des parasites. La goutte épaisse réalise une concentration des parasites sur une surface plus petite que le frottis, ce qui permet de dépister une parasitémie moindre (Ambroise-thoma P. et col., 1992).

 Test de Diagnostic Rapide (TDR)

Le TDR est une des étapes majeures et fondamentales dans la prise en charge du paludisme. En effet, plus la détection de la maladie se fait rapidement, mieux elle sera prise en charge. Ce test repose sur le principe de la detection de la protéine HRP-2 ou Histidin Rich Protein ou de l’enzyme Lactate Déshydrogénase (pLDH) présente dans les infections palustres. Les TDR sont d’exécution rapide et la lecture facile pouvant être réalisés par un personnel moyennement formé. Ils sont indiqués particulièrement dans les structures non spécialisées lorsque l’examen microscopique n’est pas disponible (Hance P. et col., 2005).

 Quantitative Buffy Caot (QBC)

Il repose sur le marquage de l’ADN du Plasmodium par un fluorochrome l’acridine orange. Par ailleurs cette technique ne permet pas l’identification précise d’espèces ni une numération des hématies parasitées (Wery W., 1991).

 Polymerase Chain Reaction (PCR)

C’est une technique fondée sur la detection du matériel génétique parasitaire. L’amplification génique par PCR est la technique la plus utilisée. C’est une technique sensible et spécifique qui permet de détecter de très faible parasitémie de l’ordre de 0,3 parasite/µl (Hänscheid T. et col., 2002).

 Illumigen LAMP

Développé avec le concours des chercheurs Sénégalais et de plusieurs partenaires internationaux, la LAMP constitue une nouvelle norme en matière de diagnostic du paludisme.

Illumigen® Malaria une technique de diagnostic moléculaire 80 000 fois plus sensible que les options actuelles et c’est un test breveté qui va permettre à l’Afrique, au monde et principalement au Sénégal, d’accentuer ses efforts dans la lutte contre le paludisme et vers l’élimination (Dieng, 2016). Elle s’appuie sur la technologie moléculaire de LAMP les résultats obtenus avec illumigen sont disponibles en une heure. Le test est simple à utiliser dans la mesure où il ne repose pas sur une expertise technique de haut niveau (Parida M. et col., 2008).

Développée en 2000 La LAMP pour loop-mediated isothermal amplification ou technique d’amplification isotherme de l’ADN, elle permet d’amplifier la séquence d’ADN cible avec une haute sensibilité et spécificité, le tout dans les conditions isothermales et en une heure environ. C’est une méthode alternative à la PCR classique (Notomi T. et col., 2000).

LAMP diffère de la PCR classique du fait qu’elle ne nécessite pas de changement cyclique de la température contrairement à la PCR; cela facilite l’adaptation sur le champ d’étude. La réaction positive à la LAMP se traduit par la formation d’un précipité qui peut être détecté visuellement par turbidimétrie (Mori Y. et col., 2001) ou en utilisant un indicateur à base d’ion métallique tels que la calcéine (Tomita N. et col., 2008), et le bleu d’hydroxynaphtol (Goto M. et col., 2009).

Diagnostic indirect

C’est une technique immunologique basée sur la detection des anticorps sériques anti-plasmodium. Il est utilisé pour la réalisation des enquêtes épidémiologiques, le dépistage lors des dons de sang et le diagnostic rétrospectif d’une fièvre. Il s’agit de :

– L’immunofluorescence indirecte ;

– L’hémagglutination ;

– L’immunodiffusion

Traitement du paludisme

Le traitement du paludisme est basé sur l’utilisation de médicaments antipaludiques, qui sont des molécules chimiques contre les différentes formes et stades parasitaires.

L’OMS recommande d’utiliser les associations thérapeutiques à base de dérivé d’artémisinine pour traiter les cas de paludisme simple à P. falciparum. Les CTA ont été adoptés comme traitement de première intention au Sénégal en 2005.

Traitement du paludisme simple

Principales molécules antipaludiques

Schizonticides

Ce sont des molécules qui par divers mécanismes tuent le parasite lorsqu’il est au stade schizonte (Le Loup G. et col., 2010 ; Bruce-Chwatt L. J. et col., 1986).

Les schizonticides comprennent deux groupes :

Les schizonticides naturels (quinine et artemisinine) et les schizonticides de synthèse (4-aminoquinoleine, aryl-amino-alcool, antifolates).

Schizonticides naturels

• Quinine

Elle est extraite des écorces de cinchona. On la retrouve sous forme de base faible. Ce sont des sels qui sont utilisés en thérapeutique sous forme de formiate, de chlorhydrate, de sulfate et de bisulfate. La quinine existe en comprimé ou en solution injectable IM ou IV. Aux doses thérapeutiques la quinine est peu toxique. Mais en cas de surdosage des troubles sensoriels (acouphène, hypoacousie), collapsus cardiovasculaire peuvent apparaitre ainsi que des nausées, vomissements et l’hypoglycémie.

• Artemisinine

L’artemisinine est extraite d’une plante de la médecine traditionnelle chinoise l’armoise douce ou annuelle. C’est une lactone sesquiterpenique présentant un groupement endoperoxyde support de l’activité antipaludique (Boucaud O. et col., 1995). Deux de ces dérivés sont recommandés en combinaisons thérapeutiques par l’OMS dans le traitement du paludisme simple : artésunate et arteméther.

4-Aminoquinoléines

Ce sont des antipaludiques de synthèse et ils constituent le groupe le plus utilisé. La chloroquine (Nivaquinine®) et l’amodiaquine (Flavoquine®) sont les médicaments de référence dans ce groupe. La chloroquine est réservée dans le traitement de l’accès palustre à la posologie de 25 mg/kg. La posologie de l’amodiaquine en traitement curatif pour l’accès palustre est de 10 mg/kg. Le seul inconvénient pour ces deux molécules est la fréquence des résistances (Badiane M. et col., 1995).

Antifolates

Ils ont une action sur la voie de synthèse des folates qui est essentielle dans la synthèse des acides nucléiques (Badiane M. et col., 1995). Les antifolates sont divisés en deux groupes :

– Les antifoliques qui inhibent la dihydroptéroate synthétase qui produit de l’acide folique. Ils sont constitués par les sulfamides comme la sulfadoxine

– Les antifoliniques inhibent la dihydrofolate réductase qui intervient dans la production de l’acide folinique. Dans cette classe on retrouve la pyriméthamine.

Elle est utilisée en association avec la sulfadoxine (Fansidar® comprimé et solution injectable).

Associations d’antipaludiques

L’OMS classe les associations d’antipaludiques en deux grands groupes :

 Celles à base d’artémisinine ou CTA

Ces associations thérapeutiques consistent à administrer simultanément au moins deux schizonticides sanguins agissant indépendamment l’un de l’autre et dont la cible biochimique dans l’hématozoaire est différente. Elles reposent sur un double principe :

Une association médicamenteuse improbable où un hématozoaire apparait spontanément au cours médicament.

est souvent efficace. Dans le cas très mutant résistant à l’un des médicaments de l’infestation, il serait tué par l’autre

Les CTA présentent différents avantages :

– Réduction rapide et sensible de la biomasse parasitaire ;

– Disparition rapide des symptômes cliniques ;

– Efficacité sur P. falciparum polychimiorésitant ;

– Réduction de la charge gamétocytaire ;

– Peu d’effet clinique indésirable.

L’OMS recommande l’utilisation :

Artémether + Luméfantrine (COARTEM®)

Artésunate + Amodiaquine (COARSUCAM®)

Artésunate + Méfloquine (ARTEQUIN®)

 Les associations non basées sur des dérivés de l’Artémisinine : Sulfadoxine + Pyriméthamine (FANSIDAR®)

Chloroquine + Proguanil (SAVARINE®)

Dapsone + Pyriméthamine (MALOPRIME®)

Atovaquone + Proguanil (MALARONE®)

Traitement du paludisme grave

Il se faisait sur plusieurs jours depuis longtemps avec la quinine en perfusion en milieu hospitalier. Depuis Avril 2011, l’OMS recommande l’utilisation de l’artésunate en intraveineuse qui peut être plus efficace que la quinine (OMS., 2011).

RAPPELS SUR LES TRIAZENES

Structure générale des 1,2,3-triazènes

Les 1,2,3-triazènes sont des composés caractérisés par un groupement fonctionnel N N N comme une partie des triazèno (Hill D. T. et col., 1983). La structure générale des triazènes est indiquée dans la figure 8 ou R peut être un groupement alkyle ou aryle. Selon le système de nomenclature de l’IUPAC, les atomes d’azote du groupement azénique sont numérotés consécutivement d’un bout l’autre, en assignant le plus petit nombre la double liaison à savoir le N(1)=N(2) N(3) (Stefane B. et col., 1997). Tous les composés qui ont ce motif sont appelés des 1,2,3-triazènes.

Méthodes de synthèse des 1,2,3-triazènes

Les triazènes ou diazoamines constituent une classe de composés possédant trois atomes d’azotes consécutifs dans un arrangement acyclique (Khramov D. M. et col., 2007).

Les triazènes peuvent être obtenus par diverses voies de synthèses qui sont reparties en deux grandes méthodes :

 La réaction incluant le couplage d’un sel de diazonuim avec une amine primaire ou secondaire en milieu acide en présence de nitrite de sodium (NaNO2) (Rouzer C. A. et col., 1996 ; Doucet K. G. et col., 2006).

 La réaction d’un dérivé organométallique avec un azoture de sodium qui peut être suivi de la réaction d’un alkyl azide avec un réactif de Grignard ou d’un alkyllithuim (David B. et col., 2002).

Applications thérapeutiques des triazènes

Les triazènes sont des éléments importants en synthèse organique. Ils sont doués de plusieurs activités tels que :

• Activité anticancéreuse

Les triazènes sont également des agents chimio thérapeutiques pour beaucoup de tumeurs tels que la tumeur cérébrale, la leucémie, le mélanome, le lymphome et le sarcome (Nishiwaki K. et col., 2007; Kanjeekal S. et col., 2005).

Le 3,3-diméthyl-1-aryltriazène ou la dacarbazine, le témozolomide et le mitozolomide sont des triazènes utilisés dans le traitement clinique des tumeurs c’est-à-dire les maladies néoplasiques y compris les hémopathies malignes. Des études ont montré que leurs activités antitumorales dépendent des trois atomes d’azotes adjacents (Marchesi F. et col., 2007; Ünsalan S. et col., 2011). Par ailleurs, l’autre mécanisme présumable de ces triazènes cytotoxiques anti-prolifératifs peut être attribué à une alkylation de l’ADN par méthylation de l’O-6-guanine, médiée par l’ion méthyldiazonium, un dérivé très réactif, l’inhibition de l’ADN et la synthèse de l’ARN (Matheson SL. et col., 2001; Matheson SL. et col., 2004; Mokhtari S. et col., 2012).

• Activité antipaludique

L’activité antipaludique de plusieurs 1-aryl-3,3-dialkyltriazènes a été évaluée chez le Plasmoduim berghei NK-65 sur des souris infectées. On a constaté que certains de ces 1-aryl-3,3-dialkyltriazènes ont une activité antipaludique puissante avec une dose de 100 mg/kilogramme de poids corporel. Il est également décrit que le bérénil® qui est un triazène est 125 fois plus actif que la chloroquine (CQ) en activité antipaludique in vivo (O’ Reilly S. M., et col., 1993).

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Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
CHAPITRE I : RAPPELS SUR LE PALUDISME
I. Définition
II. Historique
III. Épidémiologie
III.1. Agent pathogène
III.1.1. Classification
III.1.2. Morphologie de Plasmodium falciparum
III.1.3. Biologie
III.1.3.1. Habitat
III.1.3.2. Cycle évolutif
III.1.4. Culture des plasmodies
III.2. Vecteur et transmission
III.2.1. Vecteur
III.2.2. Mode de contamination
III.3. Situation dans le monde et répartition géographique
III. 4. Facteurs favorisants
III.4.1. Facteurs physiques
III.4.2. Facteurs socio-économiques
III.4.3. Facteurs individuels
IV. Cliniques
IV.1. Paludisme de primo-invasion
IV.2. Accès palustre simple
IV.3. Accès Pernicieux
IV.4. Paludisme viscéral évolutif
IV.5. Fièvre bilieuse hémoglobinurique
V. Diagnostic biologique
V.1. Diagnostic direct
V.2. Diagnostic indirect
VI. Traitement du paludisme
VI.1. Traitement du paludisme simple
VI.1.1. Principales molécules antipaludiques
VI.1.1.1. Schizonticides
VI.1.1.1.1 Schizonticides naturels
VI.1.1.1.2. 4-Aminoquinoléines
VI.1.1.1.3. Antifolates
VI.1.1.2. Gamétocytocides
VI.1.1.3. Antibiotiques
VI.1.1.4. Associations d’antipaludiques
VI.2. Traitement du paludisme grave
CHAPITRE II : RAPPELS SUR LES TRIAZENES
I. Structure générale des 1,2,3-triazènes
II. Méthodes de synthèse des 1,2,3-triazènes
III. Applications thérapeutiques des triazènes
IV. Autres applications des triazènes
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL
I- CADRE D’ETUDE : LA SLAP DE THIES
I.1. Généralités sur la région de Thiès
I.1.1. Description de la région de Thiès
I.1.2. Endémicité palustre de la région
I.1.3. Situation sanitaire
I.1.4. Section de Lutte Antiparasitaire (SLAP)
I.2. Période d’étude
I.3. Population d’étude
I.4. Critères d’inclusion et de non inclusion
I.4.1. Critères d’inclusion
I.4.2. Critères d’exclusion
II- MATERIEL ET METHODE
II-1. Matériel
II-2. Méthode
II-2.1. Méthode d’obtention des 1,2,3-triazènes
II-2.2. Recrutement des patients et prélèvement
II-2.2.1. Recrutement des patients
II-2.2.2. Prélèvement
II-3. Technique du « SYBR Green I »
II-3.1. Définition
II-3.2. Principe
II-3.3. Mode opératoire
II-3.3.1. Préparation et conservation des plaques de culture contenant nos molécules candidates
II-3.3.2. Préparation et Supplémentation du RPMI
II-3.3.3. Préparation de la solution tampon de lyse
II-3.3.4. Préparation de la solution tampon SYBR Green
II-3.3.5. Préparation des isolats
II-3.3.6. Culture proprement dite
II-3.3.7. Mesure de la fluorométrie selon la méthode de SYBR Green et Détermination de la CI50 par l’utilisation du logiciel Graphpad prism
III- RESULTATS
III. 1. Répartition globale des résultats en fonction des structures moléculaires
IV- DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES