Méthodes de génotypage de M. tuberculosis

Méthodes de génotypage de M. tuberculosis

GENERALITES SUR LA TUBERCULOSE

La tuberculose est une maladie contagieuse, se propageant par voie aérienne. Elle affecte fréquemment les poumons, mais peut aussi toucher d’autres organes comme les reins, la colonne vertébrale ou le cerveau, etc… L’agent causal de la tuberculose humaine, le complexe M. tuberculosis (MTBC), est représenté par plusieurs espèces : M. africanum trouvé en Afrique de l’ouest (Bonard et al., (2000), M. canetti trouvé en particulier à Djibouti (van Soolingen et al., 1997), M. bovis trouvé chez les bovins et les humains (O’Reilly and Daborn, 1995), M. microti, caprae et pinnipedii trouvés respectivement chez les rongeurs, les chèvres et les mammifères marins (Prodinger et al., 2002).

DE L’INFECTION A LA MALADIE

La tuberculose se transmet dans la plupart des cas par inhalation des gouttelettes infectantes produites sous forme d’aérosol par les patients contagieux lors de la toux, la parole ou les éternuements. Les gouttelettes inhalées sont transportées et déposées dans les alvéoles pulmonaires où les bacilles sont phagocytés par les macrophages alvéolaires. Une fois activée, la réponse immunitaire spécifique est mise en place conduisant à la formation d’un granulome constitué de macrophage infectés et d’autres cellules immunitaires. A ce stade, le sujet reste asymptomatique, c’est la primo-infection tuberculeuse (PIT). Dans ces cellules phagocytaires, les bacilles peuvent échapper à la digestion enzymatique, persister et se multiplier. Dans 90% des cas, l’infection est contrôlée au stade de primo-infection par le système immunitaire de l’organisme, le granulome se calcifie et les bacilles emprisonnés dans un caséum restent sous contrôle à l’état quiescent, et le sujet reste asymptomatique, on parle d’une infection tuberculeuse latente (ITL) (Smith, 2003). Dans 10% des cas, l’infection évolue vers une tuberculose maladie qui est qualifiée de tuberculose active.

DIAGNOSTIC

Le diagnostic de la tuberculose est évoqué par les signes cliniques de la maladie. L’apparition des symptômes comme la toux persistante (>3semaines), l’expectoration parfois teintées de sang, l’asthénie, l’anorexie, l’amaigrissement, la subfébrilité et la sudationnocturne, est le signe d’une tuberculose active diagnostiquée généralement par la bacilloscopie. Cette dernière consiste à identifier les Bacilles Acido-Alcoolo-Résistants (BAAR) dans les frottis de produits pathologiques après coloration de Ziehl-Nelsen ou à l’auramine. Les manifestations cliniques extra-respiratoires comme les douleurs lombaires et articulaires, symptômes de tuberculose extra-pulmonaire, orientent le diagnostic vers des examens plus profonds tels que la radiologie ou l’imagerie (scanner). Dans tous les cas, la culture de bactéries sur milieu spécifique est la méthode de référence pour l’identification des souches tuberculeuses et pour évaluer la résistance aux antituberculeux.

TRAITEMENT

A Madagascar, la DLT prend en charge le traitement de la maladie. Les nouveaux cas de tuberculose sont traités par un régime thérapeutique standardisé d’une durée de 6 mois : une combinaison de 4 antibiotiques [rifampicine (R), isoniazide (H), pyrazinamide (Z) et l’éthambutol (E)] pendant les 2 premiers mois correspondant à la phase d’attaque, puis de  antibiotiques (RH) pendant 4 mois pour la phase de continuation. Les médicaments sont disponibles et dispensés gratuitement dans les CDT. Le traitement est administré sous observation directe ou «DOTS» ou en appliquant un suivi régulier permettant d’identifier rapidement les irréguliers. Des contrôles sont réalisés périodiquement afin de suivre l’évolution du patient. Les rechutes, les reprises de traitement et les échecs bénéficient d’un régime de retraitement standardisé d’une durée de 8 mois dont 2 mois sous RHZE accompagné d’une
injection de streptomycine (S), mois sous RHZE, puis 5 mois sous RHE. Les malades de la tuberculose multirésistante ou TB-MR sont traités dans des services spécialisés (Hospitalisés) avec un schéma de 3ème ligne de longue durée comprenant 6 moisde phase initiale sous Z, Ethionamide (ET),  Cyclosérine (C), Ofloxacine (O) accompagné d’une injection de Kanamycine (K) pendant les 3 premiers mois, puis 12 à 18 mois de phased’entretien sous Z, ET,O.

PREVENTION

Les mesures préventives préconisées par la DLT consistent en un dépistage et traitemen des cas de tuberculose pulmonaire à microscopie positive (TPM+), la vaccination par le BCG des enfants dès la naissance, le traitement préventif par l’isoniazide (chimio prophylaxie) des  enfants de moins de 5 ans et des personnes vivant avec le VIH (chez qui la maladie active de la tuberculose a été exclue) étant en contact avec un sujet tuberculeux.

Table des matières

DEDICACE.
REMERCIEMENTS
RESUME
ABSTRACT.
TABLE DES MATIERES
GLOSSAIRE
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
I INTRODUCTION.
II GENERALITES.
Generalites sur la tuberculose
IDe l’infection à la maladie
Diagnostic
Traitement 
Prévention.
Les mycobactéries 
Taxonomie.
Caractéristiques de M. tuberculosis
Caracteristiques morphologiques et phenotypiques
Le génome de M.tuberculosis
Les marqueurs genetiques de M.tuberculosis
Méthodes de génotypage de M. tuberculosis
Classification des souches du complexe M.tuberculosis (MTBC):
Base de données
Epidémiologie moléculaire des souches M. tuberculosis à Madagascar 
Etude épidémiologique de la tuberculose utilisant le système d’information géographique (SIG)
MATERIELS ET METHODES
Recrutement
Methodes
Extraction d’ADN à partir de lames de diagnostic
Principe
Méthodes
Spoligotyping 
Principe
Méthodes.
Enregistrement des données
Attribution des numeros IPM.
Saisie des données et résultats sur Excel
Validation des résultats
Classification des souches
Analyse des clusters spatiaux de cas de tuberculose à Antananarivo 
Cartographie des Spoligotypes sur le logiciel Quantum Gis®.
Association cluster spatial de cas et cluster génotypique
Analyse statistique
RESULTATS 
Caractéristiques de la population d’étude
Distribution des patients selon leur tranche d’âge et leur sexe
ANALYSE BACTERIOLOGIQUE des échantillons 
Résultat du spoligotyping sur membrane 
Genotypage des extraits de lames et de cultures
Description des spoligotypes par comparaison des profils obtenus à la base de
données internationale (Sitvitweb) 
Description des spoligotypes obtenus à partir des ADN extraits des lames de
diagnostic
Description et distribution des spoligotypes obtenus à partir des ADN extraits de culture.
distribution des spoligotypes concordants entre les profils d’extraits de lame et
culture 
Définition du nouveau cluster spatial de cas de tuberculose 
Cartographie des spoligotypes majeurs de M. tuberculosis à Antananarivo renivohitra a partir des extraits de cultures
IV.9 Analyse association cluster spatial de cas et clusters génotypiques à partir des extraits de cultures
V DISCUSSION
VI CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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