METHODES DE DOSAGE DE L’INSULINE DANS LES MILIEUX BIOLOGIQUES

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Hydrosolubilité

L’insuline humaine et ses analogues rapides sont hydrosolubles à pH >5,4 ou < 5,3. A pH ≥7, ces insulines ne sont solubles qu’en l’absence des ions Zn2+. L’insuline glargine (un analogue de l’insuline, a une durée d’action prolongée) est soluble dans l’eau à pH<4 et précipite à pH> 6,7 [5].
Comme la plupart des protéines, l’insuline est relativement instable en solution aqueuse. Sa dégradation est majoritairement due à des réactions d’hydrolyse (décomposition par l’eau) ou à des mécanismes de polymérisation (interaction de molécules entre elles pour former des molécules de taille plus élevée). La principale réaction hydrolytique subie par l’insuline est la désamination qui est une réaction chimique au cours de laquelle une molécule perd un groupement amine ce qui entraîne la libération d’ammoniac (NH3), une molécule très toxique pour la cellule [6].

Cristallisation

En présence des ions Zn2+, l’insuline humaine donne des cristaux rhombohédriques constitués d’unités d’hexamères d’insuline avec deux ions Zn2+ par hexamère.
En présence du phénol(ou de dérivés phénoliques) et des ions Zn2+, l’insuline humaine cristallise pour donner des hexamères contenant 6 molécules de phénol et deux ions Zn2+ par hexamère [5].

Propriétés physiques

L’insuline n’est pas seulement sensible à des facteurs de dégradation chimiques. La température et la lumière, qui sont des grandeurs physiques, sont aussi des éléments à surveiller et à maîtriser au cours du procédé de fabrication, de par leur possible impact sur la protéine pouvant être à l’origine d’une dégradation rapide, importante et définitive.
Il est bien connu que l’insuline est un médicament thermosensible devant être stocké au réfrigérateur. Cependant, avant de se retrouver sous la forme d’un produit prêt à l’emploi avec des conditions de conservation particulières, les cartouches, flacons ou stylos d’insuline doivent être fabriqués. Il sera donc essentiel de maîtriser la température tout au long du procédé de fabrication.

Thermosensibilité

L’insuline humaine et ses analogues sont thermolabiles et doivent être conservées à l’état sec, à l’abri de la lumière et à une température comprise entre +2 et + 8°C Jusqu’à son utilisation [5]. On pense en général qu’elle n’est dégradée que par la chaleur mais pas par le froid. Or, ce dernier est beaucoup plus dangereux pour l’insuline que la chaleur, car lors de la congélation la dégradation du produit est immédiate, tandis qu’avec une augmentation de température l’insuline perd graduellement de son efficacité. Elle doit donc être protégée contre la chaleur mais aussi contre le froid (températures inférieures à 0°C pouvant amener à la congélation du médicament).
En effet, les basses températures peuvent dénaturer les protéines par dissociation des structures polymériques, amenant le plus souvent à des réassociations non fonctionnelles. Lorsque l’insuline gèle (température inférieures à -0,5°C), il se forme des cristaux et des agrégats affectant la structure quaternaire des molécules et donc sa conformation spatiale, à l’origine de son efficacité. Il n’y aura pas de réel préjudice physique à l’injection d’une insuline ayant été congelée, mais à cause de la perte de l’activité moléculaire, cette insuline n’aura aucun effet sur la glycémie. Il existe donc un vrai risque d’hyperglycémie à l’utilisation d’une insuline congelée [11].
De manière générale, toute variation anormale de température est nocive pour le produit et entraîne une altération plus ou moins importante. La dégradation d’un produit de santé est d’autant plus dangereuse qu’elle est invisible. Le médicament peut ainsi subir une détérioration progressive par la chaleur, suite à des élévations de température répétées, ou une dégradation par le froid [6]. Une exposition thermique de l’insuline peut amener à de profondes modifications, comme par exemple la destruction des acides aminés constituant les chaînes polypeptidiques de la molécule. Une altération des acides aminés soufrés (comme la cystéine ou la méthionine), va amener à produire notamment du sulfure d’hydrogène qui est un gaz toxique. La sérine, la thréonine et la lysine sont elles aussi susceptibles d’être dégradées par la température. Si cette dernière est supérieure à 100°C, il peut survenir des réactions de désamination avec libération d’ammoniac, provenant des groupements « acétamido » de la glutamine ou de l’asparagine [10]. A haute température, il est même possible d’assister à la transformation de la stéréochimie des acides aminés avec passage d’un isomère de la série L à un isomère de la série D. La quasi-totalité des acides aminés trouvée dans les molécules du vivant étant de la série L, leur transformation en l’énantiomère D induit une conformation biologiquement inactive.

Photosensibilité

Les protéines pharmaceutiques, qui sont majoritairement fabriquées sous forme de liquides injectables et conditionnées dans des contenants primaires transparents, sont sujettes à recevoir de la lumière ; ce qui est le cas de l’insuline.
Tout d’abord, il faut savoir que tous les rayonnements lumineux ne sont pas identiques. En effet, l’énergie émise par un rayonnement est inversement proportionnelle à sa longueur d’onde. Les longueurs d’ondes les plus courtes, correspondant au spectre du rayonnement ultra-violet (UV), sont celles qui auront le plus d’impact sur les protéines et donc sur l’insuline.
L’insuline, au cours de son procédé de fabrication, est susceptible d’être dégradée par absorption de l’énergie lumineuse, principalement des rayonnements UV, et cela via deux voies majeures. La première est liée à une absorption directe des radiations UV par certains constituants de la molécule, conduisant à la formation d’espèces à l’état excité ou de radicaux. La seconde voie met en jeu des processus indirects faisant intervenir des photo-sensibilisateurs exogènes ou endogènes [12].
Les dommages provoqués par la lumière se traduisent par des perturbations des structures primaire (oxydation de certains acides aminés), secondaire et tertiaire des protéines avec majoritairement la formation de liens intermoléculaires, l’agrégation des protéines entre elles, ou encore un processus de fragmentation.
Cela a donc des conséquences sur l’activité biologique de l’insuline, pouvant amener à sa perte de fonctionnalité.
Au sein des protéines, ce sont les acides aminés qui absorbent la lumière. Mais quatre d’entre eux sont particulièrement impliqués dans ces phénomènes d’absorption de par la présence de groupements chromophores au sein de leurs structures. Il s’agit de la tyrosine, de la cystéine, du tryptophane et de la phénylalanine.

ROLE PHYSIOLOGIQUE DE L’INSULINE

L’insuline possède de nombreuses propriétés pharmacologiques touchant au métabolisme glucidique, lipidique et protéique [Figure 2].

Action sur le métabolisme glucidique

Au niveau du foie

L’insuline inhibe la dégradation du glycogène en glucose par inhibition du glycogène phosphorylase et de la glucose-6-phosphatase. Elle favorise la synthèse du glycogène par stimulation de la glucokinase et du glycogène synthétase. Elle inhibe la néoglucogenèse par diminution de la quantité d’acides aminés glucoformateurs et inhibition de la phosphoénolpyruvate-carboxykinase
[33].

Au niveau des muscles et du tissu adipeux

L’insuline favorise le transport membranaire du glucose par recrutement notamment du transporteur du glucose du compartiment cellulaire vers la membrane plasmique. Elle favorise la conversion du glucose en glycogène et la synthèse d’acétyle-coenzyme A avec formation d’acide gras et de triglycérides [34].

Action sur le métabolisme lipidique

L’insuline inhibe la lipolyse par son action sur la triglycéride lipase, ce qui conduit à une diminution de la sécrétion d’acide gras et de glycérol. Au niveau des hépatocytes, elle inhibe la cétogenèse et favorise la synthèse de triglycérides. Elle stimule la synthèse de la lipoprotéine lipase au niveau hépatique, ce qui favorise la synthèse lipidique au niveau du tissu adipeux [35].

Action sur le métabolisme protéique

L’insuline possède un effet inhibiteur du catabolisme protéique et une action anabolique par stimulation de la synthèse protéique. A l’état physiologique, elle participe au maintien de l’équilibre azoté [36].

Autres actions de l’insuline

L’insuline favorise le passage des ions potassium du milieu extracellulaire vers le milieu intracellulaire et stimule la réabsorption rénale de sodium. Elle possède également des effets sur la croissance. Pendant l’embryogenèse, l’insuline stimule la prolifération des cellules épithéliales de l’intestin humain. Au niveau de la bordure en brosse, elle agit en stimulant la libération de polypeptides impliqués dans les mécanismes d’action de l’hormone de croissance. Compte tenu de leur affinité pour le récepteur à l’insuline, ces peptides ont été dénommés insulin growth factor (igf 1 et igf 2). Enfin, l’insuline présente un effet inhibiteur de la sécrétion de glucagon, qui est une hormone hyperglycémiante [27].

Différents types d’insuline

Il existe plusieurs types d’insuline qui diffèrent essentiellement par leur rapidité de passage dans la circulation sanguine ainsi que par leur durée d’action [figure 3].
De la protamine et/ou du chlorure de zinc sont ajoutés aux insulines pour prolonger leurs durées d’action ce qui consiste à ralentir leurs résorptions après administration sous cutanée. De nouvelles formes, issues de modification de la séquence d’insuline permettent également aujourd’hui de ralentir l’action de l’insuline afin d’améliorer le contrôle de la glycémie : quantité d’insuline constante sur une durée plus longue [3].

Insuline à action rapide

Ce sont des suspensions limpides de monocristaux à faible teneur en zinc, sans protamine. L’effet hypoglycémiant débute 10 à 30 minutes après injection sous cutanée et ne dépasse pas 8 heures, avec un maximum entre la 2ème et la 3ème heure. Ces préparations peuvent aussi être injectées par voie intramusculaire ou intraveineuse en cas d’urgence permettant une action presque immédiate avec un maximum atteint vers la 30ème minute. Ce type d’insuline est employé essentiellement dans trois cas :
Traitement du coma diabétique (acidocétosique) du fait de leur action rapide par injection intraveineuse;
Complément de traitement chez un diabétique traité par une insuline à action retardée pour éviter la carence insulinique au début de la matinée;
Contrôle parfait de l’insulinémie dans des cas particuliers : interventions chirurgicales, grossesses, stress… [37].

Insulines à action intermédiaires ou semi lentes

Ces insulines sont caractérisées par un retard d’action par rapport aux précédentes. La prolongation de l’effet hypoglycémiant est obtenue en associant à l’insuline du zinc et ou de la protamine. L’effet hypoglycémiant débute 15 à 60 minutes après l’injection sous cutanée et persiste 12 à 16 heures. Ce type d’insuline est essentiellement utilisé dans les cas suivants :
En injection, le soir, pour prolonger la durée d’action durant la nuit chez le diabétique traité par l’insuline rapide le matin et à midi;
En une injection unique, le soir, chez le sujet ayant un diabète basal dans le but d’éviter une insulinémie nocturne trop basse;
En deux injections (matin et soir) pour couvrir une période de 24 heures [38].

Insulines à action lente ou retard

Le délai d’action de ces insulines se situe entre 90 et 180 minutes; leur durée d’action est de 24 heures en moyenne (jusqu’à 30 heures pour l’insuline ultra lente) après injection sous cutanée.
Ce type d’insuline permet de réaliser une seule injection quotidienne et d’augmenter ainsi le confort du malade. Mais en pratique, on préfère, au détriment du confort du malade, augmenter le nombre d’injections et se rapprocher d’avantage du processus physiologique [39].

Insulines mixtes ou composées

Ce sont des associations toutes préparées constituées par un mélange d’insuline rapide et d’insuline à action prolongée, ou d’insuline ultra lente et d’insuline intermédiaire. Elles sont administrées exclusivement par voie sous cutanée profonde [40].

FONCTION DES EXCIPIENTS DE FORMULATION DE L’INSULINE

Les différents excipients ajoutés au cours de la formulation d’insulines, que ce soient les conservateurs, les agents ionisants, les substances tampons ou encore le zinc, vont avoir une influence sur la stabilité chimique mais aussi physique des molécules d’insuline. Le choix de la substance à utiliser doit être minutieux, pour cela différentes formules sont réalisées puis testées avant de convenir de la plus adaptée, n’ayant pas d’impact négatif sur la matière active.

Solution tampon

Une solution tampon est une solution dont la composition est telle que son pH varie peu. Ainsi, elle possède la capacité de maintenir approximativement le même pH, malgré l’addition de petites quantités d’ions oxonium ou hydroxyde.
Le Tris (abréviation de trishydroxyméthylaminométhane), est un tampon particulièrement convoité dans le milieu des injectables, et notamment pour la fabrication des médicaments du fait de son pKa de 8,30 à 20°C, qui permet de réguler un intervalle de pH compris entre 6,5 et 9,7. Il est donc idéal pour les formulations à pH neutre. Mais le Tris n’est pas le seul tampon utilisable en milieu neutre puisqu’il existe aussi le tampon phosphate salin, basé sur le couple dihydrogénophosphate / hydrogénophosphate dont le pKa est de 7,2.
L’utilisation de tampons au sein de solutions d’insuline neutres, n’ont que très peu, voire pas du tout, d’influence sur les réactions de désamination pouvant survenir sur les molécules de principe actif. Mais la composition du tampon peut avoir un effet à d’autres niveaux, il est donc important de prendre en compte tous ces paramètres lors de la fabrication.

Conservateurs

La plupart des insulines commercialisées contiennent du phénol et/ou du métacrésol, qui sont des conservateurs. Leur rôle principal est avant tout d’éviter la contamination microbienne, mais ils auront aussi un impact sur la stabilité de la structure hexamèrique, formée par les molécules d’insuline regroupées autour d’un noyau de zinc, en induisant notamment la formation de liaisons supplémentaires entre les chaînes. L’addition de ces nouvelles liaisons, aux précédentes, permet de limiter les réactions chimiques conduisant à la dégradation des protéines d’insuline, en renforçant la structure.
Premièrement, ces molécules induisent la formation d’un segment additionnel du côté N-terminal de la chaîne B, là où des réactions de désamination pouvaient avoir lieu (en B3 notamment), bloquant ainsi les phénomènes d’hydrolyse à ce niveau.
Ensuite, les molécules de phénol ont la capacité de siéger dans des cavités, au sein de la structure tridimensionnelle de l’insuline, situées entre les dimères lorsque l’insuline est assemblée sous forme d’un hexamère. Le phénol va ainsi former des liaisons de Van der Walls (interactions électriques de faible intensité) entre les histidines situées en position B5, augmentant de ce fait la stabilité de la structure [8].
L’association de phénol ou de ses dérivés à une solution d’insuline permet de diminuer le ratio isoAspartate/Aspartate, ce qui montre qu’un changement dans la structure peut réduire les réactions d’hydrolyse à ce niveau.
L’utilisation de phénol en tant que conservateur induit aussi une baisse de la formation de protéines de haut poids moléculaire, due aux phénomènes de polymérisation, plus importante que le métacrésol ou encore le méthylparabène [7].
La combinaison de liaisons de Van der Waals, d’interactions hydrophobes et de changement conformationnel favorisé par les conservateurs est impliquée dans la liaison entre les molécules. Bien qu’ayant une action positive sur les formulations d’insuline, ce ne sont pas des agents neutres puisqu’ils sont à l’origine de réactions chimiques impliquant la protéine d’intérêt. Il est donc essentiel de bien connaître leurs effets sur les molécules d’insuline ainsi que leurs mécanismes d’action afin de cibler et d’aiguiller les réactions qu’ils induisent dans le but d’en retirer des bénéfices favorables à la stabilité de la préparation [7,8].

Agents ionisants

Afin de favoriser la tolérance de l’organisme aux substances injectées, il est préférable d’administrer un produit isotonique. Ainsi, les préparations injectables doivent avoir la même pression osmotique que celle du sang, c’est-à-dire la même concentration moléculaire que lui, pour que les hématies y soient en équilibre. L’exemple type est le sérum physiologique qui est une solution aqueuse de chlorure de sodium (NaCl) concentrée à 9 g/L et parfaitement isotonique au sang. Ainsi, pour faciliter l’administration de médicaments, il convient d’injecter une substance la plus isotonique possible par rapport au sang.
Dans l’industrie pharmaceutique, les agents ionisants ont pour rôle d’ajuster l’équilibre ionique du médicament afin de le rapprocher le plus possible de la concentration moléculaire plasmatique. Les plus couramment utilisés sont le chlorure de sodium, le glycérol et le glucose.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES SUR L’INSULINE
I. Structure chimique et propriétés physico-chimiques de l’insuline
I.1. Structure chimique de l’insuline
I.2. Propriétés physicochimiques de l’insuline
I.2.1 Propriétés chimiques
I.2.1.1 Ph
I.2.1.2 Hydrosolubilité
I.2.1.3 Cristallisation
I.2.2 Propriétés physiques
I.2.2.1 Thermosensibilité
I.2.2.2 Photosensibilité
II.ROLE PHYSIOLOGIQUE DE L’INSULINE
II.1. Action sur le métabolisme glucidique
II.1.1 Au niveau du foie
II.1.2. Au niveau des muscles et du tissu adipeux
II.2. Action sur le métabolisme lipidique
II.3. Action sur le métabolisme protéique
II.4. Autres actions de l’insuline
III. Différents types d’insuline
III.1. Insuline à action rapide
III.2. Insulines à action intermédiaires ou semi lentes
III.3. Insulines à action lente ou retard
III.4. Insulines mixtes ou composées
IV. FONCTION DES EXCIPIENTS DE FORMULATION DE L’INSULINE
IV.1 Solution tampon
IV.2 Conservateurs
IV.3 Agents ionisants
IV.4. Zinc
V.MALADIES LIEES A L’INSULINE
V.1 Diabète
V.1.1. Définition et critères de diagnostic
V.1.2 Diabète de type 1
V.1.2.1 Complications à court terme ou aigues
V.1.2.1.1 Acidocétose diabétique
V.1.2.1.2 Coma hyper-osmolaire
V.1.2.1.3. Hypoglycémie
V.1.2.2 Complications à long terme
V.1.3. Diabète de type 2
V.1.4. Diabète gestationnel
V.2. Insulinome
V.3 Syndrome métabolique
V.4 Syndrome des ovaires polykystiques (SOPK OU PCOD)
DEUXIEME PARTIE : METHODES DE DOSAGE DE L’INSULINE DANS LES MILIEUX BIOLOGIQUES
I. OBJECTIFS DE L’ETUDE
I.1 Objectif général
I.2 Objectifs spécifiques
II. METHODOLOGIE
III. PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS
IV. METHODES D’ANALYSE DE L’INSULINE
IV.1. Méthodes immunologiques
IV.1.1 Méthode immuno-enzymatique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
IV.1.2 AlphaLISA.
IV.1.3 Fluorescence homogène à résolution temporelle(HTRF)
IV.1.4 Dosage immunologique par chimiluminescence (CLIA)
IV.1.5. Dosage radio-immunologique (RIA)
IV.1.6. Dosages immunologiques sur puce
IV.2. Méthodes chromatographiques et électrophorétiques
IV.2.1 Chromatographie liquide haute performance avec détecteur UV (HPLC-UV)
IV.2.2. Chromatographie capillaire électrocinétique micellaire (MECC)
IV.2.3. Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS / MS)
IV.2.3.1. Méthode ascendante
IV.2.3.2. Méthode descendante
IV.2.3.2.1 SPE-LC-MS / MS
IV.2.3.2.2. LC-MS / MS multidimensionnelle
IV.2.3.2.3. Immunocapture-LC-MS / MS
V. AUTRES METHODES
CONCLUSION
Références Bibliographiques

Télécharger le rapport complet