METHODES D’ANALYSES DES AFLATOXINES DANS LES ALIMENTS

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MOISISSURES PRODUCTRICES

Définition

Les moisissures sont des champignons microscopiques, ubiquistes, eucaryotes, hétérotrophes, pluricellulaires, à croissance filamenteuse, sans organisation tissulaire (Nishio, 2008).
Ils font partie du taxon des mycètes. Entre 5 et 10 millions d’espèces sont classées dans ce groupe (Meredith, 2011 ; Hawksworth, 2006). Cependant toutes ces espèces fongiques ne sont pas productrices de toxines et certaines toxines peuvent être produites par plusieurs espèces. On note aussi qu’à l’intérieur même d’une espèce, il existe des différences entre les souches (Steyn, 1980).
L’appareil végétatif (le thalle), est formé de longs filaments ramifiés et souvent cloisonnés (hyphes mycéliens). On les retrouve dans le vaste embranchement des Ascomycètes puis dans la famille des Septomycètes comme Penicillium et Aspergillus (Barnett et Hunter, 1998).
Dans les conditions environnementales appropriées, l’ensemble des hyphes constitue un mycélium visible à l’œil nu et chargé de spores de couleur variée (vert, jaune, blanc, noir, gris…).
En raison de la structure filamenteuse du thalle qui les rend particulièrement aptes à coloniser des substrats solides, les moisissures peuvent alors acidifier, décolorer, fermenter et altérer la qualité organoleptique des aliments.
Les mycotoxines sont principalement synthétisées par cinq espèces toxinogènes de champignons microscopiques : Aspergillus, Penicillium, Claviceps, Fusarium et Alternaria (Tableau I).

Reproduction :

Pour un même champignon, selon ses conditions de vie, deux types de processus peuvent être à l’origine de la production des spores (aussi nommée fructification) :
– La reproduction sexuée :
Elle concerne les champignons téléomorphes, ou formes parfaites. Les gamètes mâles et femelles sont produits par des organes différenciés et spécialisés, appelés gamétocystes. Il y a par la suite fusion des gamètes, par caryogamie, permettant l’obtention d’une cellule œuf diploïde contenant un nombre pair de chromosomes. Ce zygote va se diviser par méiose et donner des spores haploïdes, ne possédant qu’un seul exemplaire de chromosomes (Bouchet et al., 2005).
– La reproduction asexuée :
Ce type de reproduction concerne les formes imparfaites, ou anamorphes (Deuteromycota).En général, elle se manifeste lorsque les conditions de vie sont difficiles (hiver, sécheresse).Le noyau des spores est issu directement du noyau du thalle par simple mitose. Les cellules obtenues sont identiques aux cellules-mères haploïdes. Par conséquent, tous les thalles engendrés sont des clones du thalle parent (figure 3).
NB : Chez la majeure partie des mycètes, les formes anamorphes et téléomorphes coexistent. Ces champignons, possédant à la fois le mode de reproduction sexuée et asexuée, sont désignés sous le terme de holomorphes (Campbell et al., 1996).

Utilisation industrielle

Si certains espèces sont pathogènes, d’autres ont un intérêt industriel. C’est le cas de Penicillium camemberti et Penicillium roqueforti indispensable à la fabrication de certains fromages. Penicillium griseofulvum a quant à lui un intérêt médical car il joue un rôle dans la synthèse d’un antifongique : la griséofulvine. On peut aussi citer Penicillium notatum, producteur de la pénicilline, découverte par Alexander Flemming et qui a permis de donner naissance à des antibiotiques majeurs (amoxicilline, piperacilline…) (Assaoui, 2018).
D’autres espèces sont utilisées dans l’industrie agro-alimentaire et dans l’industrie des biotechnologies, impliquée dans la production d’acides organiques, d’enzymes et de pigments. Aspergillus niger est employé pour la synthèse d’acides alimentaires comme l’acide citrique et l’acide gluconique, ainsi que pour la production d’enzyme (alpha amylase, lipase, pectinase…). Aspergillus oryzae est utilisé dans les pays asiatiques pour la production de produits fermentés à base de soja (Botton et al., 1990 ; Schuster et al., 2002).
Les alcaloïdes de l’ergot ont des propriétés thérapeutiques indéniables. Les propriétés vasoconstrictrices de l’ergotamine et de ses dérivés hemisynthétiques sont détournées actuellement pour traiter les cas d’hypotension orthostatique et des crises migraineuses.
La bromocriptine, bloquant la lactation chez les femmes ne voulant pas allaiter, doit son utilisation à son action anti dopaminergique. D’autre part en association avec la levodopa, il permet l’atténuation des symptômes de la maladie de Parkinson (Robbers, 1984).

MYCOTOXINOGENESE

Les mycotoxines peuvent être produites à tous les stades de la chaîne alimentaire depuis le champ jusqu’au produit fini (Pfohl-Leszkowicz et Castegnaro, 1999). Elles peuvent survenir au champ (avant récolte), lors du transport, pendant le stockage ou au cours de la transformation (figure 4). La mycotoxine peut aussi être présente alors que l’agent responsable a disparu, soit du fait de l’évolution de la microflore, soit du fait de traitements technologiques.

Voies de biosynthèse des mycotoxines

Les mycotoxines font partie des métabolites secondaires, qui ne jouent pas de rôle évident dans le métabolisme du microorganisme. Ce sont probablement un moyen de défense pour les champignons contre les parasites ou les autres micro-organismes en concurrence dans le même environnement (Adams et Moss, 2002). Ces composés non essentiels au métabolisme basique des moisissures sont produits au cours de l’idiophase (phase stationnaire) à partir des précurseurs issus du métabolisme primaire, tels que l’acétyl-CoA, les acides aminés, les phénols ou les composés terpéniques (Steyn, 1998). Les voies de biosynthèse sont longues et complexes et les réactions sont catalysées par des enzymes de spécificité différente de celle du métabolisme primaire.
Contrairement au métabolisme primaire, qui est fondamentalement le même pour tous les êtres vivants, le métabolisme secondaire dépend de l’espèce considérée, et très souvent de la souche. La nature des métabolites secondaires, très hétérogènes, dépend des caractères individuels de la souche et des conditions environnementales (Steyn, 1980).
Le métabolisme secondaire, très important chez les moisissures, aboutit à une grande diversité de molécules dont les mycotoxines. Ces produits sont très souvent classés par famille de produits chimiquement voisins (les aflatoxines, les trichothécènes, etc.). Elles ont trois origines biosynthétiques principales : la voie des poly acétates, celle des terpènes et celle des acides aminés (Tabuc, 2007) (figure 5).

Facteurs influençant la mycotoxinogénèse

Trois principaux facteurs interviennent dans la colonisation fongique et par suite dans la contamination des aliments par les mycotoxines. Ces facteurs sont d’ordres physiques, chimiques et biologiques (Mitchell et al., 2004).

Facteurs physiques

Ils constituent l’ensemble des conditions environnementales comme la température, la disponibilité en eau, l’infestation par les insectes et l’attaque par les rongeurs. En général, les conditions favorisant la toxinogénèse sont plus restrictives que celles permettant la croissance des moisissures.

Température

La température joue un rôle prépondérant sur la croissance et la physiologie des moisissures et, en outre, sur la compétition entre les espèces. Compte tenu des températures habituellement rencontrées dans les denrées alimentaires, comprises généralement entre 0 et 35ºC, et dans la mesure où les autres facteurs de l’environnement ne jouent pas de rôle limitant, des moisissures sont susceptibles de s’y développer. La plupart des champignons sont mésophiles avec des optima de croissance variant de 25 à 35ºC.
En général, la température optimale de croissance pour la plupart des champignons se situe vers 25ºC. C’est le cas des champignons du genre Aspergillus dont l’intervalle de croissance correspond à une température allant de 12 à 39 ºC avec un optimum se fixant à 24ºC. D’autre part, certaines espèces de champignons sont psychrophiles ou psychrotolérantes et sont capables de se développer à des températures relativement basses comme les champignons du genre Penicillium dont l’intervalle de température varie de 4 à 31ºC avec un optimum vers 12ºC (Pfohl-Leszkowicz et Castegnaro, 1999 ; Botton et al., 1990).
La température permettant une toxigénèse optimale est en général voisine de la température optimale de croissance, pour la plupart des mycotoxines tout en demeurant légèrement inférieure (Pfohl-Leszkowicz et Castegnaro, 1999 ; Botton et al., 1990).

Activité de l’eau (Aw)

Il s’agit d’un paramètre dont l’influence est déterminante sur le développement des moisissures ainsi que sur la production de mycotoxines. Dans un premier temps ce paramètre influence la germination des spores puis dans un second temps, le développement mycélien.
Quelle que soit la nature de l’aliment aucun micro-organisme ne peut se développer lorsque l’activité de l’eau (Aw) est inférieure à 0,65. Pour les Aspergilli, la croissance optimale selon les espèces se situe entre une activité de l’eau de 0,71 et 0,98 alors que la plupart des Penicillia se développent à des (Aw) comprises entre 0,78 et 0,88 (tableau II).

Facteurs chimiques

Composition gazeuse

La plupart des moisissures sont aérobies. La réduction de la pression partielle en oxygène et surtout l’accroissement de la teneur en CO2 a un effet dépresseur important sur la toxinogénèse (Devegowda et Murthy, 2005). La production d’aflatoxines dans l’arachide, est modérément réduite entre 21 et 5% d’O2. Elle est pratiquement inhibée lorsque la proportion en O2 est inférieure à 1%.
L’augmentation de la teneur en CO2 (20%), provoque une chute importante de la production d’aflatoxines. De même la production de la patuline et d’acide pénicillique est réduite par des basses concentrations d’oxygène tandis que la croissance des souches toxinogènes n’est pas affectée. Toutefois, après conservation dans une atmosphère confinée, dans laquelle les moisissures peuvent plus ou moins se développer, la remise à l’air libre ou la ventilation provoque rapidement une intense toxinogénèse (Bars, 1987).

Traitements agricoles

Plusieurs facteurs additionnels peuvent influencer la production des mycotoxines dans le champ. Il peut s’agir des pratiques agricoles comme le labourage et la rotation de récolte, les fongicides utilisés (le traitement des céréales par un fongicide réduit la croissance des moisissures tandis que le stress causé sur la moisissure par le traitement fongicide peut stimuler la synthèse des toxines), la variété de la plante et les différences géographiques (Langseth et Rundberget, 1998). En outre la culture biologique peut poser un risque pour la production accrue de mycotoxine comme cela a été proposé par Edwards (2003) (Khoury, 2007).

Nature du substrat

La toxinogénèse dépend beaucoup plus étroitement que la croissance de la composition chimique de la denrée sur laquelle les moisissures se développent. Sur une denrée alimentaire, on trouve souvent une espèce dominante et donc ses toxines. Par exemple, Penicillium verrucosum est le producteur principal d’OTA dans les céréales tandis que Penicillium nordicum contamine souvent les produits riches en protéines, produits fermentés à base de viande, ou de fromage. Cependant en général, la biogénèse des aflatoxines, de l’OTA, de la stérigmatocystine et de l’acide pénicillique, est favorisée tout d’abord par la présence de glucides dans le substrat, puis de lipides et enfin la présence de protides qui ont une moindre influence. Le raisin à maturité présentant le maximum de glucides (glucose et fructose) a été en effet décrit comme étant un substrat idéal pour le développement des champignons ochratoxinogènes et pour la production de l’OTA, comparé à ce même substrat à des stades antérieurs de maturité. L’acidité est aussi une des propriétés du substrat qui joue un rôle important dans le développement fongique et la toxinogénèse (Lund et Frisvad, 2003).

Facteurs biologiques

Ils sont fondés sur les interactions entre la colonisation de l’espèce fongique toxinogène et le substrat. Les facteurs biologiques peuvent être liés à l’espèce fongique, à la spécificité de la souche et à l’instabilité des propriétés toxiques. Une même toxine peut être élaborée par différentes espèces quelque fois appartenant à différents genres, par exemple l’OTA ou la patuline qui sont produites par différentes espèces d’Aspergillus et de Penicillium ; et une même espèce peut produire plusieurs mycotoxines (par exemple OTA et citrinine par Penicillium verrucosum ; OTA et acide pénicillique pour Aspergillus ochraceus ; citrinine et patuline pour Penicillium claviforme ou Aspergillus terreus).
D’autres facteurs d’ordre biologique s’avèrent aussi très importants, il s’agit des insectes et des acariens qui sont des vecteurs de spores de moisissures qu’ils introduisent à l’intérieur même du grain par les lésions qu’ils créent. La contamination de l’arachide, du coton, du maïs par Aspergillus flavus produisant l’AFB1 avant la récolte est souvent liée à l’attaque par les insectes.
Durant le stockage, les échantillons de grain hébergeant des charançons révèlent en général une population fongique importante et parfois des mycotoxines (AFB1, OTA, citrinine dans le maïs ou l’orge). Enfin, la présence de plusieurs espèces fongiques sur la même denrée a généralement un effet dépressif sur la production de toxine. Cela s’explique d’une part, par la compétition pour le substrat et d’autre part, par le fait que certaines souches peuvent dégrader la toxine. Bouraima et al. (1993) ont rapporté une compétition entre A.flavus et A. ochraceus, la présence de ces deux champignons conduit essentiellement vers la production de l’aflatoxine, les ochratoxines sont très peu produites ou totalement absentes. Ce phénomène peut s’expliquer par le fait que dans la biogénèse des aflatoxines, A.flavus utilise la phénylalanine du support sur lequel il se développe. Lorsqu’il est plus abondant, il détournerait à son profit toute la phénylalanine, l’OTA un analogue de la phénylalanine ne pourrait alors être produit.

PRESENTATION DES MYCOTOXINES

Aflatoxines

Définition

Les aflatoxines (AFs) sont des métabolites secondaires de différentes souches de moisissures du genre Aspergillus, contaminant naturel de l’alimentation humaine et animale.
Dans le mot aflatoxine, la première syllabe « a » a été dérivée du genre Aspergillus, le second «fla» à partir de l’espèce flavus et le terme « toxine ».
Par contre les aflatoxines M1 (AFM1) et M2 (AFM2) tiennent leur appellation du fait de leur détection dans le lait des vaches laitières nourries par une alimentation contaminée. Les autres aflatoxines (par exemple, P1, Q1, B2a, G2a) ont été décrites, particulièrement en tant que produits de biotransformation des métabolites principaux chez les mammifères (Guerre et al., 1996).

Structure chimique

Les aflatoxines constituent un groupe de 18 composés structurellement proches (un assemblage d’une coumarine et de 3 furannes). Les plus courantes sont l’AFB1, l’AFB2, l’AFM1, l’AFG1 et l’AFG2 (Figure 6). Le cycle lactone de l’AFB1 semble être responsable en majorité de sa toxicité.

Propriétés physico chimiques

Les AFs purifiées se présentent sous forme de poudre cristallisée jaune paille ou incolore (Dominguez et al., 1986). Elles sont extrêmement stables thermiquement et ne sont guère détruites par les conditions usuelles de cuisson ou de chauffage. Les AFs, en solution dans un solvant fortement polaire, sont relativement instables par exposition à la lumière surtout les ultra-violets (UV) et à l’air qui provoque leur oxydation. Elles sont très solubles dans les solvants modérément polaires comme le chloroforme, le méthanol, l’éthanol, l’acétone, l’acétonitrile. Elles sont insolubles dans l’hexane, l’éther de pétrole et l’éther éthylique (Filtenborg, 1983). Les noms des AFs B1, B2, G1, et G2 sont basés sur leur fluorescence sous la lumière UV (bleu « blue pour B1 et B2 » ou vert « Green pour G1 et G2 ») et sur la mobilité chromatographique relative à leur séparation (Bennett, 2003). Par contre les AFs (M1 et M2) ont tenu leur appellation du fait de leur détection dans le lait « milk » des vaches laitières nourries par une alimentation contaminée. Certaines propriétés physico-chimiques des AFs (poids moléculaire, point de fusion) sont représentées dans le tableau III.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES SUR LES MYCOTOXINES
I. ETYMOLOGIE ET DEFINITION
II. HISTORIQUE :
III. MOISISSURES PRODUCTRICES
III-1 Définition
III-2 Reproduction :
III-3 Utilisation industrielle
IV. MYCOTOXINOGENESE
IV-1 Voies de biosynthèse des mycotoxines
IV-2 Facteurs influençant la mycotoxinogénèse
IV-2-1 Facteurs physiques
IV-2-1-1 Température
IV-2-1-2 Activité de l’eau (Aw)
IV-2-2 Facteurs chimiques
IV-2-2-1 Composition gazeuse
IV-2-2-2 Traitements agricoles
IV-2-2-3 Nature du substrat
IV-2-3 Facteurs biologiques
V. PRESENTATION DES MYCOTOXINES
V-1 Aflatoxines
V-1-1 Définition
V-1-2 Structure chimique
V-1-3 Propriétés physico chimiques
V-1-4 Aliments concernés par la contamination des aflatoxines
V-1-5 Toxicité des aflatoxines
V-2 Ochratoxines
V-2-1 Définition
V-2-2 Structure chimique
V-2-3 Propriétés physico-chimiques
V-3 Fumonisines
V-3-1 Définition
V-3-2 Structure chimique
V-3-3 Propriétés physico-chimiques
V-4 Zéaralenone
V-4-1 Définition
V-4-2 Structure chimique
V-4-3 Propriétés physico chimiques
V-5 Trichothécènes
V-5-1 Définition
V-5-2 Structure chimique
V-5-3 Propriétés physico-chimiques
V-6 Patuline
V-6-1 Définition
V-6-2 Structure
V-6-3 Propriétés physico-chimiques
VI. REPARTITION GEOGRAPHIQUE
VII. LUTTE CONTRE LES MYCOTOXINES
VII-1 Prévention contre les moisissures
VII-2 Méthodes de décontamination des matières premières
VIII. REGLEMENTATION DES MYCOTOXINES
DEUXIEME PARTIE : METHODES D’ANALYSES DES AFLATOXINES DANS LES ALIMENTS
I. PROBLEMATIQUE
II. PRELIMINAIRES D’ANALYSES :
II-1 Echantillonnage
II-2 Extraction
II-2-1 Extraction liquide-liquide
II-2-2 Extraction sur phase solide (SPE)
II-3 Purification
II-3-1 colonnes d’immunoaffinité
II-3-2 Colonnes Mycosep® TM
III- TECHNIQUES DE DETECTION ET DE DOSAGE
III-1 Méthodes chromatographiques
III-1-1 Chromatographie sur couche mince (CCM)
III-1-2 Chromatographie sur couche mince haute performance (CCMHP)
III-1-3 Chromatographie liquide haute performance (CLHP)
III-1-3-1 Considérations générales
III-1-3-2 Application
III-1-4 Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (CLSM ou LC-MS)
III-2 Méthodes immunologiques
III-2-1 Dosage immuno-enzymatique ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
III-2-1-1 Description
III-2-1-2 Application : Détermination de l’aflatoxine M1 dans le fromage par ELISA
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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