METHODES CHROMATOGRAPHIQUES ET ELECTROPHORETIQUES

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PHYSIOPATHOLOGIE

Cycle cellulaire et sa régulation

Cycle cellulaire :

Le cycle cellulaire correspond au processus par lequel une cellule aboutit à la génération de deux cellules filles, identiques à la cellule d’origine. Il représente donc l’ensemble des phases (Figure 1) par lesquelles une cellule passe entre deux divisions successives [27].
L’étude de la division et du cycle cellulaire permet de comprendre un certain nombre de dérèglements constatés au cours du cancer, la maladie cancéreuse étant associée à une prolifération cellulaire incontrôlée. La progression du cycle cellulaire est finement régulée par des « points de contrôle », qui permettent notamment une régulation de la vitesse de prolifération et un maintien de l’intégrité du génome cellulaire. Dans beaucoup de tumeurs, ces points de contrôle sont altérés [35].
Les phases du cycle cellulaire se répartissent en moyenne de la façon suivante [3 ; 34] : Phase M: la mitose est la division d’une cellule en 2 cellules filles, elle est considérée arbitrairement comme la première phase du cycle. Elle dure moins de 2 heures
Phase G1: elle correspond à la phase de croissance cellulaire et d’activités métaboliques normales. Tous les métabolismes cellulaires (à part la synthèse de l’Acide désoxyribonucléique (ADN)) s’effectuent pendant cette phase tels que la synthèse protéique ; elle est la plus longue et la plus variable (de 3 à 184 h !). Les cellules peuvent :
– continuer le cycle et se diviser,
– ou s’orienter vers la différenciation,
– ou sortir du cycle et entrer en phase G0
Phase S:correspond à la phase de la réplication de l’ADN ou la quantité d’ADN est doublée en vue de la mitose, ce qui permettra d’offrir à chaque cellule fille, lors de la division mitotique, un exemplaire de matériel génétique de la cellule mère. Elle dure 8 à 12 heures.
Phase G2: c’est la phase de repos prémitotique, elle permet la constitution de l’appareil mitotique et dure quelques heures.
Phase G0:durant cette phase les cellules sont au repos, autrement dit, elles ne se divisent plus mais peuvent facilement réintégrer le cycle suite à divers stimuli. C’est une phase très variable, plus une tumeur est différenciée, plus le temps de doublement est long.

Régulation

Les régulateurs du cycle cellulaire, en particulier ceux qui contrôlent le passage de la phase G1 à la phase S, sont à l’origine d’évènements oncogéniques dans de nombreux cancers. Un des régulateurs essentiel de ce contrôle est la protéine Rb dont le gène est situé en 13q14 (Figure 2). La protéine Rb est considérée comme le verrou du cycle cellulaire. La forme active (hypophosphorylée) de Rb est capable de bloquer le passage de la phase G0 vers la phase S. La phosphorylation de Rb entraîne la dissociation de Rb du facteur de transcription E2F et l’initiation de la réplication. Cette phosphorylation est sous la dépendance de kinases cycline-dépendantes (cdk) dont l’activation est sous le contrôle de cyclines: couples ckd/cyclines [14].
Ces différents points de contrôle sont illustrés dans la figure 2 :

Cancérogenèse

Etapes de la cancérogenèse [15 ; 27 ; 36] :

La cancérogénèse comprend trois étapes (Figure 3).
– La première étape appelée initiation correspond à une atteinte de l’ADN par un cancérogène génotoxique dit initiateur. Les cellules initiées échappent au contrôle normal de division cellulaire. Les agents initiateurs (génotoxiques) peuvent être des agents chimiques, biologiques (virus,…) ou physiques (radiations ionisantes, Ultra-violet(UV),…). C’est un phénomène irréversible.
– La deuxième étape appelée promotion est un processus épigénitique (non génotoxique) induit par un promoteur entrainant la stimulation de la sélection des cellules initiées. Cette étape est marquée par deux mécanismes :
 sélection positive : stimulation directe des cellules initiées par des promoteurs mitogènes;
 sélection négative : destruction des cellules normales par des promoteurs cytotoxiques et entraine une meilleure croissance des cellules initiées. C’est un phénomène réversible.
– La troisième étape appelée progression est une phase complexe qui consiste en la vascularisation de la tumeur (angiogenèse) et en l’acquisition de la capacité d’invasion (métastases).Elle résulte d’interaction entre le stroma et l’épithélium.

Gènes concernés par la cancérogenèse

Proto-oncogènes

Un proto-oncogène est un gène indispensable au bon fonctionnement de toutes les cellules. Les proto-oncogènes interviennent à chacune des étapes qui jalonnent les processus complexes de la prolifération cellulaire des eucaryotes et de la différenciation des tissus. Les protéines produites par les proto-oncogènes ont des rôles variés [27] :
– des facteurs de croissance pour stimuler la prolifération de leurs cellules cibles;
– des récepteurs de ces facteurs de croissance présents dans la membrane cytoplasmique (par exemple c-erbB1 qui produit le récepteur du facteur de croissance épidermique EGF);
– des transducteurs, ou interviennent de nombreux proto-oncogènes (par exemple c-ras ou c-src), sont nécessaires pour acheminer ce signal jusqu’à l’ADN du noyau ou se prennent les décisions de prolifération ou de différenciation.
– des molécules impliquées dans l’adhésion des cellules.
Ce sont des gènes susceptibles d’acquérir, après activation, les propriétés cancérogènes d’un oncogène et, à ce titre, de participer au processus de dégénérescence maligne.

Oncogènes

On nomme oncogène cellulaire toute séquence d’ADN dont la modification qualitative ou quantitative conduit à la transformation cellulaire. Les oncoprotéines sont actives en l’absence de toute stimulation physiologique.
En général, on considère qu’il existe trois grands types de modifications génétiques qui peuvent altérer un proto-oncogène [27] :
– les mutations;
– les translocations;
– les amplifications géniques.
Dans tous les cas, on obtient un produit hyperactif qui stimule la division cellulaire de sorte qu’elle échappe à la régulation normale.
Parmi les rôles des protéines codées par les oncogènes (oncoproteines), on peut citer [27] :
– Les facteurs de croissance : qui stimulent les cellules productrices, ce qui entraine une croissance cellulaire anarchique qui aboutira à une tumeur.
– Les récepteurs de facteurs de croissance : qui mutés, deviennent actifs en permanence, et stimulent la présence des facteurs de croissance, ce qui aboutit à une croissance cellulaire anarchique.
– Les protéines activatrices des facteurs de transcription : gène myc par exemple.
– Les facteurs de régulation du cycle cellulaire contrôlant le passage de la phase G1 à la phase S.
– Les inhibiteurs de la différenciation, les cellules restent dans un état indifférencié et continuent de se multiplier au lieu d’entrée en phase de spécialisation.
– Les protéines contrecarrant l’apoptose.

Anti-oncogènes

Ce sont des gènes suppresseurs de tumeurs. Ils contrôlent la croissance et la différenciation des cellules en s’opposant aux oncogènes.
Dans l’ensemble, ces gènes codent pour des protéines qui freinent la prolifération cellulaire.
– Gène NF1 : la protéine NF1 (neurofibromatose de type1) inhibe l’activité de la protéine Ras/gène H-ras.
– Gène Rb : la protéine pRb est une protéine qui bloque la cellule au point de contrôle de G1, empêchant la cellule d’entrée en phase S.
– Gène p53 : la protéine p53 (facteur de transcription) qui régule des fonctions cellulaires en provoquant l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à tout dommage sur l’ADN [14 ; 27].

Croissance et mode de dissémination

Dans l’évolution du cancer on distingue deux étapes: l’extension locale et l’extension à distance.
– L’extension locale
Au niveau des épithéliums, la cancérisation passe par différentes séquences pour passer de l’épithélium normal à un épithélium hyperplasique puis dysplasique qui aboutit au cancer in situ puis invasif.
Dans le stade in situ, les cellules cancéreuses restent encore confinées dans l’épithélium. Il se caractérise en théorie par une absence de risque métastatique.
Dans le stade invasif, les cellules cancéreuses atteignent les tissus voisins du fait de la pression exercée par la population cellulaire croissante, des capacités des cellules tumorales à franchir les barrières cellulaires et des réactions de l’hôte. Le cancer est avant tout une tumeur qui se développe d’une façon autonome et envahit progressivement l’organisme [31].
– L’extension « à distance »
L’extension métastatique est la caractéristique essentielle de la malignité d’une tumeur. Plus de 50% des cancers ont pour cause de décès non pas la croissance locale de la tumeur mais le développement de métastases.
Les cellules cancéreuses peuvent à tout moment quitter la tumeur principale, ces départs étant possibles dès le début de la croissance tumorale.
Par voie lymphatique, les cellules doivent aborder les ganglions qui peuvent les éliminer ou les accepter. Par voie sanguine, les cellules doivent traverser l’adventice pour se fixer dans un tissu péri vasculaire; elles peuvent être détruites ou entreprendre un développement [31].

Facteurs cancérogènes

Facteurs exogènes

Ce sont les plus intéressants en pratique car ils prêtent à des interventions médicales ou de santé publique beaucoup plus que les facteurs endogènes [26]. Parmi les facteurs exogènes on peut citer: les agents chimiques, physiques ou biologiques et autres facteurs socio-éducatifs
– Agents chimiques: On peut citer dans ce groupe les dérivés de benzopyrène, le tabac, les aflatoxines, les hydrocarbures, l’alcool…
– Agents physiques: ils sont représentés par les radiations ionisantes qui favorisent les mutations et les cassures chromosomiques, les ultraviolets qui entrainent des cassures de l’ADN,
– Agents biologiques : les infections chroniques et les microtraumatismes répétés peuvent être à l’origine de dégénérescence néoplasique se produisant sur des zones cicatricielles,
– Facteurs socio-éducatifs : les habitudes alimentaires et les modes de vie comme la consommation abusive de tabac et d’alcool, une alimentation déséquilibrée, une exposition solaire prolongée, la sexualité sont également des facteurs de risque [14 ; 27].

Facteurs endogènes [26]

– Terrain génétique: son influence est certaine mais son importance est difficile à préciser. Les variations observées selon les pays peuvent être rattachées à des conditions socio-économiques et à un environnement très différent.
– Facteurs immunitaires : qu’ils soient congénitaux ou acquis, les déficits immunitaires exposent à un risque important d’affections néoplasiques, essentiellement des leucémies et des hémato-sarcomes.
– Facteurs endocriniens : certains dérèglements endocriniens constituent un terrain favorable à l’apparition de tumeurs, soit au niveau des organes endocriniens, soit au niveau des organes cibles. C’est le cas :
▪ des transformations de goitre en cancer thyroïdien;
 de l’augmentation de l’incidence
 des cancers de l’endomètre après prescription d’œstrogènes ou encore;
 de l’apparition d’adénocarcinomes vaginaux chez les filles exposées in utéro
aux œstrogènes administrés à leur mère.
La figure 4 illustre la contribution des différents facteurs cités ci-dessus.
UV : ultraviolet ; % : pourcentage

DIAGNOSTIC

Signes généraux

– Altération de l’état général: asthénie, anorexie, amaigrissement.
– fièvre: suspecte si d’installation progressive, prolongée, plutôt bien tolérée, parfois intermittente.
-Sueurs nocturnes (hepnopathie maligne, surtout lymphoïde)
-Prurit (tumeurs cérébrales →prurit du nez, cancer gastrique, hémopathie)
Leur origine est souvent multifactorielle impliquant l’intervention des médiateurs de l’inflammation libérée au cours des cancers, mais de nombreux mécanismes restent incompris [23].

Examen clinique

Le diagnostic clinique se définit comme la découverte d’une tumeur chez un patient venu consulter pour un symptôme. Dans ce cas le médecin procédera à :
– Un interrogatoire orienté
– Un examen clinique soigneux
– La prescription d’examens para cliniques orientés par le contexte [31].

Examen anatomopathologique

L’examen anatomopathologique sera la preuve histologique, recherchée dans tous les cas et aucun traitement ne sera instauré sans la confirmation anatomopathologique. Ainsi, les tumeurs accessibles feront l’objet (par voie percutanée ou endoscopique) de prélèvements qui seront analysés. Les tumeurs plus profondes feront l’objet de résection chirurgicale plus ou moins étendue [31]. On peut distinguer :
– Biopsie : prélèvement
– Cytologie : ponction guidée (pince ou aiguille)
– Tumorectomie : intervention chirurgicale.

Examen para-clinique

Les examens para-cliniques permettront aux médecins de faire une classification objective de la maladie avec la double connotation : diagnostic et pronostic, puis en conséquence de faire des choix thérapeutiques adaptés. Ces examens s’inscrivent d’abord dans le cadre du bilan d’extension locale, ganglionnaire, puis métastatique. Ils comportent différents examens qui seront prescrits avec pertinence [31] :
– Chirurgie : temps capital du bilan d’extension couplé à un temps thérapeutique
– Imagerie médicale : radiographies, examens contrastés, écographies, scanner, Imagerie par résonance magnétique (IRM), scintigraphies
– Biologie : Numération Formule Sanguine (NFS), marqueurs, récepteurs hormonaux…

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE: GENERALITES SUR LE CANCER ET SA PRISE EN CHARGE
I. DEFINITION ET CLASSIFICATION
I.1.Définition
I.2.Classification [15 ; 26] :
II.EPIDEMIOLOGIE
II.1.Au niveau mondial
II.2. Au Sénégal
III.PHYSIOPATHOLOGIE
III.1.Cycle cellulaire et sa régulation
III.1.1. Cycle cellulaire :
III.1.2.Régulation
III.2.Cancérogenèse
III.2.1.Etapes de la cancérogenèse :
III.2.2. Gènes concernés par la cancérogenèse
III.2.2.1. Proto-oncogènes
III.2.2.2. Oncogènes
III.2.2.3.Anti-oncogènes
III.2.3.Croissance et mode de dissémination
III.3. Facteurs cancérogènes
III.3.1.Facteurs exogènes
III.3.2.Facteurs endogènes
IV.DIAGNOSTIC
IV.1.Signes généraux
IV.2.Examen clinique
IV.3.Examen anatomopathologique
IV.4.Examen para-clinique
V. PRISE EN CHARGE
V.1.Dépistage
V.2. Prévention
V.2.1.Prévention primaire
V.2.2.Prévention secondaire
V.2.3.Prévention tertiaire
V.3.Traitements
V.3.1.Chirurgie :
V.3.2.Hormonothérapie
V.3.3.Immunothérapie :
V.3.4.Chimiothérapie
V.3.4.1.Définition
V.3.4.2.Historique
V.3.4.3.Classification
V.3.4.3.1.Selon la cible
V.3.4.3.2.Selon le mécanisme d’action
I. PROBLEMATIQUE
II. METHODES CHROMATOGRAPHIQUES ET ELECTROPHORETIQUES
II.1.Principe général
II.2. Chromatographie Liquide Haute Performance(CLHP)
II.2.1.Principe
II.2.2.Appareillage
II.2.3.Application à l’analyse de la doxorubicine
II.2.3.1.Structure chimique
II.2.3.2.Propriétés physico-chimiques
II.2.3.3.Préparation de l’échantillon
II.2.3.4. Identification et dosage
II.3.Chromatographie Electrocinétique Micellaire(MECC)
II.3.1.Principe
II.3.2.Appareillage
II.3.3. Application à l’analyse des complexes de platine
II.3.3.1.Structures chimiques
II.3.3.2.Propriétés physico-chimiques
II.3.3.3.Préparation de l’échantillon
II.3.3.4.Identification et dosage
III.METHODES SPECTRALES
III.1.Spectrophotométrie UV-Visible
III.1.1.Principe
III.1.2.Appareillage
III.2.Spectrophotométrie infrarouge (IR)
III.2.1.Principe
III.2.2.Appareillage
III.3.Application de la spectrophotométrie UV-visible couplée à la spectrophotométrie Infrarouge à Transformer de Fourier (UV-Visible-IRTF) à l’analyse des anthracyclines (doxorubicine et épirubicine):
III.3.1.Structures chimiques
III.3.2. Propriétés physico-chimiques
III.3.3. Préparation des échantillons de doxorubicine et d’épirubicine
III.3.4.Identification et dosage
CONCLUSION
REFERENCES

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