Soutenance mémoire
L’électrophorèse capillaire (EC) est définie comme le mouvement d’ions chargés se déplaçant dans une solution d’électrolytes, sous l’influence d’un champ électrique, à l’intérieur d’un tube capillaire. Les premiers travaux sur cette technique furent entrepris par Hjerten, en 1967, qui utilisa des capillaires en quartz de 1 à 3 mm de diamètre pour séparer en différentes zones des mélanges de divers composés (protéines, peptides, ions organiques et inorganiques). Dès lors, l’EC prit le nom d’électrophorèse capillaire de zone (ECZ) et ne devint populaire que dans les années 80 grâce aux travaux de Jorgensen et Lukacs qui améliorèrent la technique en utilisant des capillaires de 75 µm en silice vierge fondue. D’autre part, ils furent les premiers à clarifier la théorie en décrivant les relations reliant les paramètres opérationnels à la qualité de la séparation. De nos jours, la séparation des analytes (sous forme ionisée) en ECZ est entreprise à l’intérieur d‘un capillaire en silice vierge fondue revêtue d’une couche protectrice externe de polyimide. Ce capillaire est rempli d’un tampon de séparation (BGE) dont la composition est très variable (aqueux, organique, hydro-organique), mais qui contient toujours un ou plusieurs sels, lui conférant à la fois une certaine force ionique et un pH donné. Chacune des extrémités du capillaire est alors placée dans deux flacons remplis du même tampon, puis connectée à des électrodes reliées à une source de haute tension (≤30kV). La dimension du capillaire varie en fonction des performances et du temps d’analyse désiré, mais également du type de détecteur utilisé. De manière générale, le diamètre interne (d.i) d’un capillaire se situe entre 25 et 150 µm et sa longueur varie entre 30 et 100 cm. L’injection se fait à partir du flacon contenant l’échantillon par l’application soit d’une pression (injection hydrodynamique), soit d’une tension ou d’un courant (injection électrocinétique). Bien que l’injection électrocinétique permette un gain notoire au niveau de la sensibilité, elle reste moins populaire que l’injection hydrodynamique à raison de son manque de répétabilité, de la discrimination vis-à-vis des analytes injectés et du phénomène de déplétion sur l’échantillon [1]. Notre objectif consistera à montrer les différents modes d’électrophorèse capillaire que nous avons utilisé pour faire la mise au point du développement d’une méthode d’analyse de médicaments contenant de la nifédipine, antihypertenseur appartenant à la famille des inhibiteurs calciques, par électrophorèse capillaire.
Pharmacocinétique
Les dihydropyridines exercent l’effet vasodilatateur le plus puissant. Aux doses thérapeutiques habituelles, ces agents n’ont pratiquement pas d’influence sur la fonction des cellules myocardiaques et le système de conduction du coeur. L’effet hypotenseur de ces médicaments est souvent contrecarré par une augmentation réflexe de l’activité nerveuse symphatique, cette dernière se traduisant au niveau du coeur par une accélération de la fréquence et un accroissement de la contractilité, ceci particulièrement lors de l’instauration du traitement [6]. Actuellement, cinq dihydropyridines inhibiteurs de flux calcique sont commercialisées en France, dont quatre existent sous une forme à libération prolongée pour leur indication dans l’hypertension.
Absorption
La nifédipine est résorbée à plus de 90% par l’organisme. L’absorption est rapide, la molécule marquée au Carbone 14 apparaît dans le sérum 3 minutes après administration sublinguale et 20 minutes après administration orale. Pour les deux voies, la concentration sérique maximale est obtenue une à deux heures après la prise [8]. La nifédipine subit un intense métabolisme de premier passage hépatique après administration orale. C’est pourquoi sa biodisponibilité après administration par voie orale est comprise entre 30 et 77 % .
Biotransformation
La demi-vie d’élimination de la nifédipine est relativement brève, de 30 minutes à 2,8 heures après administration par voie orale, et il n’a jamais été observé de phénomène d’accumulation au cours d’un traitement continu [12-13]. La nifédipine et ses métabolites sont liés environ à 90 % aux protéines sériques. La nifédipine non liée aux protéines diffuse rapidement dans les organes et les tissus. A une concentration de nifédipine de 20 µg/ml, environ 92 % de la substance est liée aux protéines sériques chez l’homme et à une concentration de 0,2 µg/ml, la liaison est d’environ 98 % après administration orale de 20 mg sous forme de capsule. Il a été trouvé une relation entre les taux plasmatiques et la réduction de la résistance vasculaire [8]. La nifédipine est presque totalement métabolisée dans l’organisme puisqu’on ne retrouve que des traces de la substance inchangée dans l’urine. Le système cytochrome P-450 est probablement responsable de son métabolisme [17]. La nifédipine se transforme en un premier métabolite dont une des deux fonctions ester se trouve Hydrolysée pour donner un acide carboxylique (figure 5). Le deuxième métabolite est obtenu par oxydation de la fonction méthyl en ortho par rapport à la fonction acide pour donner un groupement hydroxyméthyl, ce deuxième métabolite est en équilibre avec son dérivé lactonique dont les proportions dépendent du pH. On peut détecter deux métabolites dans les urines. Ce sont des dérivés de la pyridine, contrairement à la nifédipine qui est un dérivé de la dihydropyridine. Ces deux métabolites sont pharmacologiquement inactifs. L’effet de premier passage hépatique est important .
Elimination
Après administration d’une dose sublinguale ou orale de 10 mg de nifédipine, 80% de la substance est éliminée sous forme de métabolites par le rein. La part non excrétée par le rein est éliminée par voie hépatobiliaire puis dans les fèces [16 19].
Indications thérapeutiques
Traitement symptomatique de l’angor stable chronique en monothérapie ou en association avec un traitement bêtabloquant. Traitement de tous les niveaux d’hypertension artérielle.
Posologie et mode d’administration
Voie orale
Pour des effets optimaux, la posologie doit être adaptée en fonction des besoins individuels. La dose initiale doit être augmentée progressivement selon les signes cliniques. La posologie recommandée chez l’adulte est la suivante :
– Angor stable chronique (angor d’effort) :
La posologie initiale recommandée est d’un comprimé de 30 mg une fois par jour. La dose peut être augmentée en fonction des besoins individuels jusqu’à un maximum de 90 mg une fois par jour.
– Hypertension artérielle :
La posologie initiale recommandée est d’un comprimé de 30 mg une fois par jour. Si nécessaire, la dose peut être augmentée en fonction des besoins individuels jusqu’à un maximum de 90 mg une fois par jour. Les comprimés doivent être avalés entiers sans être croqués, mâchés ou écrasés. Les comprimés sont de préférence administrés le matin avec un verre d’eau (pas de jus de pamplemousse ; voir également la rubrique 4.5). La durée du traitement est fixée par le médecin traitant.
Contre-indications
– Hypersensibilité connue à la nifédipine ou à d’autres dihydropyridines, ou à l’un des excipients.
– Grossesse.
– Choc cardiogénique, sténose aortique cliniquement prouvée, angor instable ou en cas d’infarctus du myocarde datant de moins d’un mois.
– traitement concomitant par la rifampicine.
Mises en garde spéciales et précautions d’emploi
Dans certains cas exceptionnels, l’utilisation de nifédipine peut entraîner de graves symptômes d’angine de poitrine, probablement en raison d’une résorption rapide et d’une chute trop soudaine de la pression artérielle. Dans ce cas, le médecin traitant doit en être immédiatement informé et le traitement par nifédipine doit être arrêté. La nifédipine doit être utilisée avec précaution chez les patients présentant une ischémie (menaçante) des doigts et/ou orteils, étant donné que ce phénomène peut s’aggraver en raison d’une diminution de la perfusion tissulaire due à une pression de perfusion diminuée. Chez les patients souffrant de diarrhée, le temps de séjour du comprimé dans le tractus gastrointestinal, et de ce fait, la durée d’action, sont réduits. Des symptômes d’obstruction pouvant se manifester chez les patients présentant une sténose gastro-intestinale sévère préexistante, Nifedipine Pharmamatch retard ne doit pas être administré à ces patients. Des symptômes d’obstruction ont également été observés chez les patients ne présentant aucune sténose gastro-intestinale diagnostiquée. Nifedipine Pharmamatch retard ne doit pas non plus être prescrit aux patients présentant une poche de Kock (iléostomie suivant une proctocolectomie).
Interaction avec d’autres médicaments et autres formes d’interaction
La nifédipine est métabolisée par le système cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), qui est présent dans la muqueuse intestinale et le foie. Les médicaments connus pour inhiber ou induire cette enzyme peuvent ainsi altérer l’absorption (après une administration orale) ou l’élimination de la nifédipine.
– Substances induisant le CYP3A4
*Rifampicine :
La rifampicine induit fortement le système CYP3A4. En cas de coadministration avec la rifampicine, la biodisponibilité de la nifédipine est considérablement réduite (baisse de 95 % de l’AUC) et de ce fait, son efficacité affaiblie. La co-administration de nifédipine avec la rifampicine est par conséquent contre-indiquée.
*Phénytoïne :
La phénytoïne induit le système CYP3A4. En cas de co-administration avec la phénytoïne, la biodisponibilité de la nifédipine est réduite (baisse de 70 % de l’AUC) et de ce fait, son efficacité affaiblie. Lorsque les deux médicaments sont administrés simultanément, la réponse clinique à la nifédipine doit être surveillée et, si nécessaire, une augmentation de la dose de nifédipine envisagée. Si la dose de nifédipine est augmentée pendant la co-administration des deux médicaments, une réduction de la dose de nifédipine doit être envisagée lorsque le traitement par phénytoïne est interrompu.
– Substances inhibant le CYP3A4 :
*Jus de pamplemousse :
Le jus de pamplemousse inhibe le système CYP3A4. La co-administration de jus de pamplemousse avec la nifédipine accroît les concentrations plasmatiques de nifédipine, en raison d’une diminution du métabolisme de premier passage. Par conséquent, l’effet de la nifédipine sur la diminution de la pression artérielle peut augmenter. Après une prise régulière de jus de pamplemousse, cet effet peut durer au moins trois jours après la dernière ingestion de jus de pamplemousse. La prise de jus de pamplemousse pendant un traitement par nifédipine est déconseillée (voir également la rubrique 5.2).
Grossesse et allaitement
Aucune donnée pertinente n’existe quant à l’utilisation de la nifédipine chez les femmes enceintes. Les études sur les animaux ont démontré une toxicité de la reproduction, à savoir une embryo-toxicité et des effets tératogènes à des doses toxiques pour la mère. La nifédipine est contre-indiquée pendant la grossesse.
Effets indésirables
Les réactions secondaires sont souvent liées à la dose et surviennent dans la majeure partie des cas au cours des deux premières semaines suivant le début du traitement.
– Troubles cardiovasculaires : œdème périphérique, bouffée congestive (érythrose faciale).
– Troubles gastro-intestinaux : constipation, nausées, etc.
– Troubles des organes de reproduction et des seins : énurésie nocturne, détérioration aiguë réversible de la fonction rénale.
– Troubles généraux et accidents liés au site d’administration : céphalée, vertige, sensations ébrieuses, sensation de pression dans la tête.
– Fréquents : étourdissement, fatigue.
GENERALITES SUR L’ELECTROPHORESE CAPILLAIRE
L’électrophorèse capillaire (EC) est une technique analytique relativement récente qui permet la séparation des espèces chargées ou non à travers un capillaire, en se fondant sur les différences de migration de ces composés soumis à un champ électrique. Les premières applications ont été effectuées en électrophorèse capillaire de zone (ECZ), mode permettant de séparer les composés ionisés. Par la suite, d’autres modes d’EC se développèrent, dont par exemple, la chromatographie micellaire électrocinétique (MEKC) qui permet aussi la séparation de composés neutres. Bien que d’autres modes soient utilisés et aient chacun leur intérêt, seul le mode d’ECZ couplé à un détecteur UV-Vis est abordé au cours de ce travail. L’électrophorèse capillaire présente un grand intérêt de par sa grande éfficacité qui se traduit par un nombre de plateaux théoriques très élevé ( 10⁵ -10⁶ ),des manipulations et un appareillage simples et souvent automatisés, de faibles volumes d’échantillon (1-20 nl) [20] et une faible consommation de solvants organiques. De plus, du fait de son mécanisme de séparation différent, l’EC se révèle une méthode complémentaire (orthogonale) aux techniques chromatographiques (CPG, CLHP,…). Actuellement, l’EC trouve de nombreuses applications dans le domaine pharmaceutique [21].
Electrophorèse capillaire de zone
Principe
Dans un capillaire de silice fondue non traité et en présence d’un tampon de pH > 3 les groupements silanol de la paroi du capillaire ont une charge négative qui attire les cations du tampon créant une double couche électrique, dite double couche de Stern. Sous l’effet du champ électrique, les cations excédentaires de la double couche se mettent en mouvement en direction de la cathode et, en entraînant l’ensemble des molécules du solvant, donnent naissance à un flux électro-osmotique (FEO) caractérisé par une mobilité électrophorétique µeo. D’autre part, les molécules chargées présentes dans l’échantillon ont une mobilité électrophorétique propre µep déterminée par leur rapport charge/taille. Une molécule chargée positivement aura une mobilité apparente égale à la somme de µep et µeo et se déplacera plus vite que le FEO. Au contraire, pour une molécule chargée négativement µep tendra à s’opposer µeo. La vitesse de déplacement de cette molécule sera donc inférieure à celle du FEO. En ce qui concerne les molécules neutres, elles ont une valeur de µep nulle et se déplaceront toutes à la vitesse du FEO sans être séparées.
Mode opératoire
L’appareillage est constitué de deux récipients, remplis d’une solution d’électrolyte tamponnée, dans laquelle trempent les extrémités d’un tube capillaire (diamètre interne entre 25 et 75 µm) ainsi que deux électrodes de platine. Il compte aussi un générateur de tension capable de délivrer une différence de potentiel compris entre 10 et 30 kV, un système d’injection hydrodynamique en général (application d’une différence de pression entre les deux électrodes pendant un temps ∆t) et un détecteur UV.
Migration électrophorétique
Elle correspond au déplacement des ions sous l’influence d’un champ électrique (E). Comme en électrophorèse traditionnelle, tout ion ou particule chargée se déplace, avec une vitesse vep, qui dépend des conditions de l’expérience et de sa mobilité électrophorétique propre (µep).Cette vitesse vep est donnée par l’équation de Huckel:
vep= qE /6πηr= µepE (µep : mobilité électrophorétique en cm².V-1.s-1)
vep est fonction de la charge de l’ion q, de son rayon r, du champ électrique appliqué E et de la viscosité du milieu η. La vitesse de migration est directement proportionnelle au rapport charge /taille de l’ion. µep= vep/E= vepL/V où L désigne la longueur totale du capillaire et V la ddp appliquée à ses extrémités. On affecte à la mobilité électrophorétique un signe (+ ou -) selon la nature cationique ou anionique de l’espèce. Elle est nulle pour une espèce globalement neutre.
Flux electro-osmotique (feo)
Le second facteur qui contrôle la migration des solutés est l’écoulement de l’électrolyte encore appelé flux électro-osmotique qui se caractérise par sa mobilité électro-osmotique. La vitesse de l’écoulement électro osmotique (vfeo) (m.s-1) est reliée à la densité de charge porter par le capillaire £i (m3 .kg2 .C-3.S-4), au champ électrique applique E (V.m-1), à la viscosité de la solution tampon (Pa.s-1) et à la constante diélectrique du tampon £` (C2 .N-1.m-2):
vfeo= εξ E /4 πη= µfeo E.
Ce flux résulte de la présence de charges négatives portées par la matrice. Ces charges négatives proviennent de l’ionisation des groupements silanol (Si-OH) qui tapissent l’intérieur du capillaire en silanoates (Si-O- ) à pH superieur à 3. Ces sites anioniques fixes attirent des cations présents dans la solution et les ordonnent en double couche dont l’une est collée à la paroi et l’autre quelque peu mobile. Entre ces deux couches nait une différence de potentiel .
(Le potentiel Zeta), dont la valeur dépend de la concentration de l’électrolyte et du pH, les cations migrent vers la cathode. Ces ions étant solvatés par des molécules d’eau, il apparait un flux d’électrolyte qui se dirige dans le même sens [55]. L’écoulement électro-osmotique dépend de la force ionique et du pH de l’électrolyte qui conditionne le degré d’ionisation des groupements silanols et la densité de la double couche. L’ajout de certains tensioactifs comme le tétraakylammonium dans l’électrolyte peut inverser la polarité de la paroi, le flux électro osmotique se dirige vers l’anode.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE: RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
1. GENERALITES SUR LA NIFEDIPINE
1.1. Propriétés physico-chimiques
1.2. Méthode d’obtention, pharmacocinétique et utilisation thérapeutiques de la nifedipine
1.2.1. Méthode d’obtention de la nifedipine
1.2.2. Pharmacocinétique
1.2.2.1. Absorption
1.2.2.2. Biotransformation
1.2.2.3. Elimination
1.2.3. Indications thérapeutiques
1.2.3.1. Posologie et mode d’administration
1.2.3.2. Contre-indications
1.2.3.3. Mises en garde spéciales et précautions d’emploi
1.2.3.4. Interaction avec d’autres médicaments et autres formes d’interaction
1.2.3.5. Grossesse et allaitement
1.2.3.6. Effets indésirables
2. GENERALITES SUR L’ELECTROPHORESE CAPILLAIRE
2.1. Electrophorèse capillaire de zone
2.1.1. Principe
2.1.2. Mode opératoire
2.1.2.1. Migration électrophorétique
2.1.2.2. Flux electro-osmotique (feo)
2.1.2.3. Mobilité apparente
2.1.3. Avantages et inconvénients
2.1.4. Applications
2.2. Chromatographie micellaire électrocinétique capillaire : « MEKC »
2.2.1. Principe
2.2.2. Mode opératoire
2.2.3. Avantages et inconvénients
2.2.4. Applications
2.3. Electrophorèse capillaire non aqueuse : « NACE »
2.3.1. Principe
2.3.2. Mode opératoire
2.3.3. Avantages et inconvénients
2.3.4. Applications
2.4. Chromatographie électrocinétique en microémulsion (MEEKC)
2.4.1. Principe
2.4.2. Mode opératoire
2.4.3. Avantages et inconvénients
2.4.4. Applications
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPÉRIMENTAL
1. OBJECTIFS
1.1. Objectif général
1.2. Objectifs spécifiques
2. CADRE D’ETUDE ET METHODOLOGIE
2.1. Cadre et durée de l’étude
2.2. Méthodologie
2.2.1. Appareil d’électrophorèse capillaire
2.2.2. Petit matériel
2.2.3. Verrerie
2.2.4. Réactifs utilisés
3. RESULTATS
3.1. Electrophorèse capillaire de zone
3.2. Electrophorèse capillaire non aqueuse : « NACE »
3.3. La chromatographie électrocinétique en Microémulsion : « MEEKC »
3.4. Chromatographie micellaire électrocinétique capillaire : (MEKC)
4. COMMENTAIRES
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
