Méthode d’évaluation de la chimiorésistance de P.falciparum

Les amino-4 quinoléines

Ce sont des antipaludiques de synthèse et constituent le groupe le plus utilisé. Ils sont composés de :

La chloroquine

Elle est d’action rapide, bien tolérée et defaible coût. La chloroquine est utilisée en prophylaxie et en traitementcuratif et existe en comprimés dosés à 0,1 et 0,3 g ou en ampoule injectable. La chloroquine est le chef de file des amino-4-quinoléines nées entre les deux guerres, de recherches allemandes menées à partir du cycle de base de la mépacrine, dans le but de trouver des substituts à la quinine, et qui ont abouti à la préparation de la Resochin (1934), puis de la Sontochin. Pendant la seconde guerre mondiale, l’armée américaineentreprit un programme de recherche en vue de synthétiser des molécules dontl’activité et la tolérance seraient supérieures à celles de la mépacrine. Ces chercheurs redécouvrirent les qualités de la chloroquine et synthétisèrent l’amodiaquine. D’autres dérivés ont été décrits, comme l’amopyroquine, l’hydroxychloroquine, la dabéquine, la tébuquine, la bispyroquine. Le mécanisme exact de l’action antipaludique n’est pas totalement élucidé.

L’amodiaquine

L’amodiaquine qui a été rendue responsable d’agranulocytose et d’hépatites graves est contre indiquée en prophylaxie. Elle est présentée sous forme de comprimés dosés à 0,2 g et est moins utilisée en traitement curatif. Son mécanisme d’action est proche de la chloroquine.
Le principal inconvénient pour ces deux molécules est la fréquence des résistances.

La méfloquine

C’est une quinoléine méthanol proche de la quinine. Elle est utilisée en prophylaxie et en traitement curatif. Elle est très efficace sur la quasi-totalité des souches y compris celles qui résistent à la chloroquine. Son élimination est lente et son efficacité dure 15 à 30 jours. L’usage de laméfloquine doit être réservé aux régions du monde où sévissent des souches de Plasmodium falciparum chloroquinorésistantes, surtout en traitement curatif ou en prophylaxie, pour les voyageurs mais pour des séjours de moins de trois mois.

L’halofantrine

C’est un phénanthrène méthanol proche de la méfloquine. Elle est active sur P. falciparumsensible ou résistant à la chloroquine. Sa demi-vie est courte. Elle est présentée sous forme de comprimés dosésà 0,250 g ou en suspension buvable à 2%. L’halofantrine est proposée en traitement curatif des accès palustres en particulier en zone de chloroquinorésistance. Des résistances croisées méfloquinehalofantrine ont été observées.

La sulfadoxine/Pyriméthamine (SP)

C’est une association schizonticide utilisée depuis 1965. Sa demi-vie est de 4 jours, les sujets « acétyleurs rapides » élimineront rapidement la molécule. Son action est lente. Pour se développer,le parasite doit synthétiser son ADN, et utiliser les folinates, dérivés des folates. La dihydroptéroate synthétase et la dihydrofolate réductase permettent lasynthèse d’acide folique à partir, entre autres, d’acide paraamino-benzoïque puisé chez l’hôte. Utilisée avant uniquement en traitement préventif, elle est devenue le médicament de choix pourla prophylaxie chez la femme enceinte en zone de chloroquinorésistance. Elle est administrée en traitement préventif intermittent chez la femme enceinte en raison d’une cure au 2 eme et 3 eme trimestre. Elle est présentée en comprimés dosés à 500 mg de sulfadoxine et 25 mg de pyriméthamineou en ampoules injectables par voie intramusculaire de 2 ml (400 mg de sulfadoxine et 20 mg de pyriméthamine). Les cas de résistance à cette association sont de plus en plus fréquents et ceci constitue un facteur limitant pour ce médicament.
La sulfadoxine inhibe l’action de la dihydroptéroate synthase alors que la pyriméthamine inhibe celle de la dihydrofolate réductase.

Le proguanil

C’est un antifolinique d’action lente à faiblepouvoir gamétocytocide, bien toléré et utilisé uniquement en traitement préventif toujours en association avec la chloroquine.

L’artémisinine et ses dérivés

L’ artémisinine dérive d’un extrait d’une herbe chinoise, artemisia annua : l’armoise, « qinghaosu » en chinois. La plante, qui appartient à la familledes Asteraceae, est utilisée en médecine traditionnelle chinoisedepuis plus de 2000 ans, sa présence figurant dans une formulation datant de 168 avant Jésus Christ.
Prou ce qui est de son mécanisme d’action, l’artémisinine possède un pont endopéroxyde dont l’ouverture entraîne la production deradicaux libres. Il en résulte des perturbations cellulaires pourle parasite avec entre autres des modifications de la membrane nucléaire, du réticulum endoplasmique, des cassures des membranes mitochondriales, des agrégations des ribosomes dont la conséquence est une diminution de lasynthèse protéique (authentifiée expérimentalement par la baisse de l’incorporation de l’hypoxanthine tritié). C’est un schizonticide, mais également un gamétocytocide.
L’isolement de l’ artémisinine et ses actions antipaludiques sont étudiés depuis 1973.C’est une lactone sesquiterpénique dérivée de l’Artemisia annua (Quinghaosu). Sa principale utilité est le traitement de souches de Plasmodium falciparummultirésistantes.

L’atovaquone

C’est un hydroxynaphthoquinone (1982), large spectre d’activité antiprotozoaire; sa biodisponibilité 22 %, clairance plus lente dans les populations africaines (t1/2 : 73 h), que dans les populations asiatiques (t1/2 31 h), action schizonticide lente; sélection de mutants résistants très rapide chez Plasmodium falciparum: 30 % de rechutes, d’autant plus fréquente que la charge parasitaire était élevée. On note une potentialisation avec le proguanil (indépendamment de l’action de son métabolite).

La luméfantrine

Benflumétol (1993). Pas absorbée chez le sujet à jeun (t1/2 : 72-120 h). La débutylluméfantrine, 5 à 8 fois plusactive que la molécule parente, est produite par la CYP3A4 des microsomes hépatiques. La cinétique du métaboliten’est pas connue. Son action est similaire à la méfloquine à et l’halofantrine. L’association artémether-luméfantrine est utilisée en traitement 80 mg + 480 mg.

Les gamétocytocides

Les gamétocytocides agissent en détruisant les gamétocytes du sang humain. Ils entravent ainsi le cycle sporogonique etbloquent la transmission de l’espèce plasmodiale. Les gamétocytocides actuellement connus sont tous des amino-8-quinoléines, tous toxiques, peu employés. Découverte en 1924, la plasmochin (ou plasmoquine) allemande fut reconstituée en France sous le nom de Praequine® en 1931. La rhodoquine, synthétisée peu après, lui était proche parente. Toutes deux sont abandonnées. La primaquine qui fut ensuite proposée se révéla également toxique. Elle est méthémoglobinisante et hémolytique, notamment chez le sujet déficitaire enzymatique en glucose 6-phosphate déshydrogénase.

La chimiorésistance de P .falciparum

Définition et aperçu général

La chimiorésistance est définie par l’OMS comme étant : « la capacité d’une souche parasitaire à survivre ou à se reproduire malgré l’administration d’un médicament antipaludique employé à des doses égales ou supérieures aux doses ordinairement recommandées mais dans les limites de tolérance du sujet » (43).
La chimiorésistance de P. falciparum à la chloroquine est apparue dans les années 60 en Asie du Sud-est et en Amérique du Sud, au Cambodge en 1963 (37),et en Afrique de l’Est en 1978 (4).De l’Afrique de l’Est, elles’est étendue vers le sudOuest, puis le centre et l’Ouest.
Cette évolution Africaine avait d’abord concerné la chloroquine, ensuite d’autres antipaludiques et actuellement, dans plusieurs régions, on parle de polychimiorésistance.
Pour ce qui est de l’Afrique de l’Ouest, la résistance in vivo fut confirmée en janvier 1987, par une enquêtedu centre de référence dela chimiorésistance du paludisme des états de l’organisation de coordination et de coopération pour la lutte contre les grandes endémies(OCCGE) au Bénin puis au Togo en février de la même année (21).
La diminution de la sensibilité in vitrode la quinine et de lachloroquine décrite au Sénégal en 1984 n’a pas été confirmée in vivoà cette époque.
L’évolution de la chimiorésistance enAfrique suscite un certain nombre de remarques dont :
9 Une résistance in vitroqui s’établit d’abords, suivie de celle in vivo.
9 Une évolution qui se fait de proche en proche, selon l’importance des communications territoriales.
9 Une apparition notifiée de la chimiorésistance sur de nombreux cas d’expatriés, de touristes pour la plupart.
Ainsi ceci va aider à résoudre la problématique sur la question des facteurs favorisant l’apparition et l’évolution de cette chimiorésistance.
La résistance de P. falciparum à la chloroquine est présente aujourd’hui dans presque toutes les zones d’endémie d’une manière toute fois hétérogène dans une même région sauf dans le Sud-est asiatique où la résistance est totale. Dans ses foyers originaux, la résistance à lachloroquine se double d’une résistancefréquente à d’autres antipaludiques (figure 2).
L’étude clinique sur le terrain définit lasensibilité des souches aux antipaludiques.
Le résultat obtenu permet aux Centres Nationaux de Référence de la chimiosensibilité du Paludisme de surveiller l’extension des résistances et de classer annuellement les pays en trois groupes :
9 Groupe 1 : absence de P. falciparum ou pas de chloroquinorésistance rapportée.
9 Groupe 2 : chloroquinorésistance présente.
9 Groupe 3 : prévalence élevée de chloroquinorésistance et multi résistance.

Facteurs d’apparition et d’extension

Les circonstances épidémiologiques de l’apparition, du maintien et de la diffusion de la chimiorésistance semblent dépendre de plusieurs facteurs.
En effet l’apparition de la chimiorésistance de P. falciparum nécessite l’intervention de trois principaux facteurs : le parasite, l’antipaludique et l’hôte humain.
Des études génétiques effectuées sur des isolats de P. falciparum(formes asexuées sanguines) de différentes origines géographiques ont montré que l’infestation par P. falciparumchez l’homme est généralement mixte, comportant des parasites génétiquement distincts. En particulier, ces parasites présentent une grande hétérogénéité dans la réponse à un antipaludique donné ; des parasites sensibles coexistant avec des parasites résistants à des degrés différents.
Ainsi, l’utilisation de faibles doses d’antipaludique (doses prophylactiques ou infra thérapeutiques lors d’automédication ou de traitement dans les dispensaires), va sélectionner, chez le malade, des parasites asexués résistants. « La rapidité de cette sélection est directement proportionnelle à la pression médicamenteuse, au nombre de parasites exposés, au taux de mutation chez les parasite ». Elle augmente également avec la longueur de la demi-vie de l’antipaludique utilisé.
D’autre part, l’apparition de la résistance peut être due à l’existence d’une résistance croisée entre des antipaludiques présentant une parenté structurale ou un mécanisme d’action semblable. En zone d’endémie palustre, cette sélection va être dépendante ou non de l’apparition de la résistance de P. falciparumà l’antipaludique, cela dépendant de l’état de l’immunité antipalustre du sujet vis-àvis de cette espèce.
L’apparition de la résistance de P. falciparumà un antipaludique dans une zone endémique donnée est « inéluctablement » suivie par sa propagation (augmentation de sa fréquence et du niveau de résistance), si aucune mesure de lutte n’est entreprise. Cette propagation est en effet, avant tout liée à des facteurs biologiques : au cycle évolutif du parasite ; et aux fondements génétiques de la chimiorésistance de plasmodium à l’aptitude des gènes chimiorésistants à se recombiner. Mais la rapidité de cette propagation est liée à d’autres facteurs, essentiellement épidémiologiques, qui sont intimement liés. Ils sont relatifs à l’hôte humain, à l’anophèle vecteur et à la manière d’utilisation des antipaludiques.
9 La pression médicamenteuse est l’un des pires facteurs de l’apparition de cette chimiorésistance.
9 La présence d’une population non immune ou faiblement immune, donc le groupe cible pour le traitement et la prophylaxie contre cettemaladie ; constitue la population principale sur laquelle vas’exercer la pression sélective d’antipaludique. Cette dernière va conduire à des cas de paludisme à P. falciparum chimiorésistants, avec la contamination des anophèles vecteurs. Sa composition varie avec le niveau del’endémie palustre.
Dans les zones de forte transmission où l’immunité de prémunition s’acquiert très tôt, elle est représentée par les nourrissons et les jeunes enfants. En zone de faible transmission où l’immunité s’acquiert très lentement, ou pas du tout, elle est plus importante, concernant en outre les grands enfants et les adultes.
9 La densité anophélienne vectrice : la transmission des parasites chimiorésistants dans la population humaine étant assurée par les anophèles, la propagation de la résistance va augmenter avec la fréquence des contacts hommeanophèle. C’est ainsi qu’en Afrique centrale, « région où la transmission du paludisme est la plus intense au monde », une prévalence élevée de chloroquinorésistance avait été observée l’année même de son apparition.
9 Les mouvements de populations (professionnels, touristiques, ou suite à des catastrophes et révoltes dans les pays tropicaux) vers les zones d’endémie palustre : ils jouent un important rôle dans la propagation géographique de la chimiorésistance de P. falciparum.

Méthode d’évaluation dela chimiorésistance de Plasmodium falciparum

L’étude de la chimiosensibilité de P. falciparumchez l’homme, qui concerne principalement les schizontocides sanguins à l’heure actuelle, peut être effectuée par des méthodes in vivo, in vitroet par l’étude des marqueurs génétiques.

Les Tests in vivo

Le principe consiste à administrer au sujet parasité par des trophozoïtes de P. falciparum, à l’exception de toute autre espèceplasmodiale, unedose curative du schizonticide à tester, puis à évaluer dans le temps, l’effet du médicament sur la réduction et la disparition de la parasitémie.
Les méthodes OMS constituent les méthodes de référence et sont de loin les plus utilisées.

Les Tests in vitro

Les méthodesin vitro permettent une détermination objective dela sensibilité de P. falciparumà tous les schizonticides sanguins agissant directement. Elles sont en effet peu ou pas influencées par l’immunité contrairement aux méthodes in vivo.
En zone d’endémie, elles permettent donc de détecter la chimiorésistance de P. falciparumà son émergence. On distingue les anciennes et les nouvelles méthodes.

Anciennes méthodes

Ce sont des méthodes qui utilisent du glucose comme milieu d’incubation. Le sang total prélevé chez le sujet présentant des trophozoïtes de P. falciparumest additionné de glucose à la concentration finale de 5 0 /00puis incubé en présence de concentrations croissantes de l’antipaludique à tester, comparativement à un témoinsans antipaludique. On évalue ensuite au microscope sur goutte épaisse, l’effet inhibiteur des différentes concentrations sur la maturation des trophozoïtes en schizontes car les parasites sont synchrones dans le prélèvement de sang.
L’interprétation des résultats est basée sur la concentration minimale d’antipaludique inhibant complètement la maturation en schizontes (CMI).
Deux macrotests ont été décrits : Le Macrotest de Rieckmann et Le Macrotest OMS.

Macrotest de Rieckmann

C’est la première technique à être utiliser sur le terrain.
Elle emploie 1 ml de sang défibriné par concentration.L’incubation est faite à l’étuve à 38°5-40°C pendant 24 heures. Les chizontes ne sont comptés sur goutte épaisse comparativement à 100 parasites asexués.

Macrotest OMS

C’est le macrotest de Rieckmann standardisé pour tester la chloroquine et la méfloquine. Il a été largement utilisé et emploie des flacons prédosés en antipaludiques. L’incubation est faite à 38°5 pendant 24 à 28 heures. Ces macrométhodes ont l’inconvénient d’utiliser une grande quantité de sang. Il faut au moins 10ml de sang par antipaludiquepour tester une souche .En outre le sang doit contenir une prédominance de trophozoites âgés de P.falciparum (38).
En effet ce sont ces formes qui sont capables d’évoluer en schizontes à trois noyaux ou plus en 24 heuresd’incubation. C’est pour ces raisons que ces méthodes ont été remplacées par de nouvelles méthodes.

Nouvelles méthodes

Elles sont basées sur le principe de la culture continue de P. falciparum(formes érythrocytaires) qui a été mise au point par Trager et Jensen et par Haynes et collaborateurs (1976). Brièvement cette culture est réalisée dans un milieu liquide synthétique (RPMI tamponné) qui est enrichi en sérum humain non immun (10 % environ). L’incubation est faite à l’étuve à 37° dans une atmosphère enrichie en gaz carbonique (95 % air et 5 % CO2) qui est obtenue dans un dessiccateur avec bougie ou dans un incubateur à CO2.
Selon le mode d’évaluation utilisé, on distingue des méthodes microscopiques, isotopiques et fluorométriques.Cette dernière constitue une innovation de taille dans l’évaluation de la sensibilité in vitrode P. falciparumaux différents antipaludiques. Elle sera la seule et principale méthode utilisée dans notre étude et plus particulièrement sous le nom de « DAPI Test ». Ce faisant, cette technique ne sera entièrement décrite que dans le cadre de notre travaille personnel retrouvé dans la deuxième partie de cette thèse.
Par ailleurs, il faut noter queles méthodes isotopiques et fluorométriques sont très sensibles mais se limitent à des laboratoires spécialisés car nécessitant tout un arsenal de matériel coûteux.
A ces méthodes s’ajoute les techniques debiologie moléculaire utilisées surtout dans l’étude des marqueurs génétiques de la résistance qui occupe aujourd’hui une place très importante dans lecadre de la recherche.

Méthodes microscopiques

Les méthodes microscopiques comportentles méthodes à court terme et celles à long terme.

Méthodes à court terme

Elles évaluent l’effet inhibiteur de différentes concentrations de l’antipaludique sur la maturation des trophozoites en schizontes, comme dans les macrométhodes.
Elles dérivent toutes de la micro méthodede 24 heures décrite par Rieckman et collaborateurs (34), pour tester la sensibilité de P.falciparum provenant de singe Aotus.

Méthodes à long terme

Elles utilisent des souches de P.falciparumaprès adaptation en culture .Les parasites de culture étant asynchrones c’est-à-dire contenant des trophozoites, des schizontes et des mérozoites. Ces méthodes apprécient, sur frottis, l’effet de différentes concentrations d’antipaludiques sur la disparition des parasites, comparativement à un témoin (RPMI) sans antipaludique.
Ces méthodes sont surtout indiquées pour les antibiotiques à action lente tels que les macrolides et les cyclines et aussi pour les inhibiteurs de la dihydropholate réductase. Ces derniers n’empêchent en effet pas la maturation des trophozoites en schizontes, mais empêchent la réinvasion des hématies par les mérozoites.
Ces méthodes présentent un certain nombre d’inconvénients car utilisant une culture continue de P.faciparum. Elles sont limitées à des laboratoires spécialisés.
De plus, la plupart d’entre elles nécessitent le changement du milieu de culture et de l’antipaludique toutes les 24 heures.
D’autre part, les résultats obtenus avec ces méthodes doivent être interprétés avec précaution car l’adaptation en culture peutéliminer sélectivement des parasites de la population originelle (39) et modifier ainsi la chimiosensibilité in vitrodes isolats de Plasmodium falciparum.(23).

Méthodes isotopiques

Elles mesurent l’effet inhibiteur de concentrations croissantes d’antipaludiques, sur l’incorporation par les parasites d’un précurseur métabolique radiomarqué, comparativement à un témoin (RPMI) et à des globules rouges sains .C’est généralement l’hypoxantine tritiée (3H hypoxantine) qui est utilisée.
Parmi les méthodes isotopiques, on pourra cité : la méthode de Desjardins et collaborateur, le microtest de Druilhe et collaborateurs, le microtest de Brandicourt et collaborateurs et le semi-microtest isotopique.

Table des matières
INTRODUCTION 
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I- LE PALUDISME
1-Définition
2-Epidémiologie
2.1-Agent pathogène
2.1.1-Classification
2.1.2-Biologie
2.1.3-Culture du Plasmodium
II-LES MEDICAMENTS ANTIPALUDIQUES
1-Classification des antipaludiques
1.2- Les schizonticides
1.2.4-Les amino-4 quinoléines
1.3-Les gamétocytocides
1.4-Les Associations
2-La chimiorésistance de P. falciparum
2.1-Définition et aperçu général
2.2-Facteurs d’apparition et d’extension
2.3- Méthode d’évaluation de la chimiorésistance de P.falciparum
2.3.1- Les Tests In Vivo
2.3.2-Les Tests In Vitro
2.4-Problèmes posés par la chimiorésistance
3-Directives nationales pour le traitement du paludisme au Sénégal
3.1-Contexte de justification
3.2-Principes directeurs sur le traitement antipaludique
3.3-Buts
3.4-Instructions pour l’application des protocoles de traitement
3.5-Directives relatives au traitement du paludisme simple
3.6-Directives relatives au traitement du paludisme grave
DEUXIEME PARTIE :TRAVAIL PERSONNEL
CADRE BIOGEOGRAPHIQUE
1- Caractères géo-climatiques
2- Population
3- Aspects sanitaires
4- Quelques éléments sur le paludisme dans le département de Thiès
MATERIEL ET METHODE
I- CADRE D’ETUDE
II- MATERIELS
III- METHODES
1-Les patients
2-Les prélèvements
3-Les méthodes proprement dites
3.1-Techniques parasitologiques
3.1.1- Technique du frottis sanguin
3.1.2-Technique de la goutteépaisse
3.2-Technique du « DAPI TEST »
3.2.1-Définition
3.2.2-Principe
3.3.3-Mode opératoire
RESULTATS
I- Les échantillons
1- Répartition des patients selon l’âge et le sexe
2-Répartition des patients selon la parasitémie et l’âge
3-Répartition des patients selon la parasitémie et le sexe
II- Répartition globale des souches sensibles et résistantes selon l’antipaludique étudié
1- Chloroquine
2- Pyriméthamine
3- Artémisinine
4- Quinine
5- Amodiaquine
III- Répartition des souches sensibles et résistantes de P. falciparumselon les cinq antipaludiques étudiés
DISCUSSION 
CONCLUSION 
BIBLIOGRAPHIE

Lire le rapport complet