Méthode de réalisation de l’antibiogramme standard

METHODES

PRELEVEMENT

Conditions de réalisation des prélèvements

Le respect des règles d’asepsie de stérilité était de rigueur. La qualité des prélèvements conditionne la suite de l’analyse et lavaleur des résultats.
Après le prélèvement du premier jour (J1), un autre prélèvement bactériologique de contrôle a été réalisé à J10.

types de prélèvements

* Prélèvements d’otites :
*Sécrétions rhino – pharyngées
*Prélèvements de gorge
*Expectorations
*Crachats
*Liquide de ponction pleurale
*Liquide de lavage broncho alvéolaire

Transport des prélèvements

Les prélèvements ont été transportés au laboratoire dans une glacière contenant des réfrigérants.
Les prélèvements étaient acheminés au laboratoire et pris en charge dans un délai de quatre heures, car la flore commensale d’accompagnement se multiplie rapidement, ce qui peut fausser les résultats. De plus Streptococcus pneumoniae est extrêmement fragile.

Conservation des prélèvements

Les prélèvements ont été réalisés en double pour chaque patient.
L’échantillon non utilisé a été conservé à -70°C. Il nous est arrivé de revenir sur certains prélèvements, notamment pour confirmer ou infirmer un résultat douteux.
La décongélation est faite à la température ambiantedu laboratoire.

EXAMEN MACROSCOPIQUE

L’examen macroscopique a consisté à l’appréciation de l’aspect purulent ou non du prélèvement.

EXAMEN MICROSCOPIQUE APRES COLORATION AU GRAM ET AU BLEU DE METHYLENE

A partir du produit pathologique préalablement traité, deux frottis ont été réalisé, l’un coloré au Gram, l’autre coloréau bleu de méthylène pour la cytologie.
L’examen microscopique à l’objectif x100 permet d’apprécier :
– le nombre de polynucléaires,
– l’aspect de la flore,
– le nombre de cellules épithéliales.
Le rapport nombre de polynucléaires sur nombre de cellules épithéliales (2 pour un prélèvement acceptable) permet de distinguer différentes situations (schéma 1).
L’examen microscopique était une étape incontournable du diagnostic car, non seulement elle permettait de juger de l’acceptabilité du prélèvement, mais elle servait surtout à orienter les investigations grâce à l’aspect de la flore.

ISOLEMENT

Après la préparation des milieux de culture, ceux-ci ont été incubés à 37°c pendant 24 heures pour les besoins du contrôle de stérilité. Ce dernier été prouvée par une absence de culture. 10 µl d’échantillon ont été ensemencés sur une gélose au sang cuit additionnée de gentamycine à la concentration de 6mg/ml. Pour les expectorations qui sont potentiellement contaminées par la flore salivaire, de même que pour les sécrétions rhino – pharyngées, on n’a pu affirmer que la culture était positive, qu’après dénombrement du nombre de bactéries par ml. Car, au nombre de colonies observées sur les milieux de culture correspond la quantité de bactéries par ml de sécrétions.

La méthode en tube

Avec 1 ml d’une solution de NaCl à 0,85%, une suspension d’une turbidité égale à celle du tube 1.0 de la gamme de MacFarland a été préparé avec les colonies à tester. Puis la solution a été réparti en quantité égale dans deux tubes de verre que nous avons respectivement nommé « test » et « témoin ».
Dans le tube « test », 3 à 4 gouttes de désoxycholate de sodium à 10% ont été ajoutées, et dans le tube »témoin », 3 à 4 gouttes de NaCl à 0,85%. Après avoir mélangé, les deux tubes ont été incubés à 37°C pendant 2 heures. Nous avons ensuite examiné le tube « test »pour rechercher un éclaircissement en comparaison avec le tube « témoin ».

Le test de sensibilité à l’optochine

Principe

Les colonies de Streptococcus pneumoniaesont généralement sensibles à l’optochine (chlorhydrate d’éthylhydrocupréine), alors queles autres streptocoques et en particulier les streptocoques non groupables alpha hémolytiques ne le sont pas. Il s’agit d’un test très fiable et d’une grande valeur diagnostique.

Technique

Une boîte de gélose au sang est inoculée avec une culture pure présumée de Streptococcus pneumoniae. A la surface du premier et du second quadrant de la gélose, un disque d’optochine a été déposé et la boîte a été incubée à 37°C en atmosphère enrichie en CO2 (5 à 10 %) pendant 18 heures environ. La présence ou l’absence d’une zone d’inhibition autour du disque d’optochine a été recherché. En cas de réaction positive, nous avons mesuré le diamètre de la zoned’inhibition en partant du centre du disque.

Mise en évidencede l’antigène capsulaire par agglutination

Nous avons utilisé un coffret: le Slidexpneumo-Kit.

Principe

Le Slidex pneumo-Kit est un test d’identification rapide de S. pneumoniae par agglutination de particules de latex. Les antigènes capsulaires sont identifiés en utilisant des particules de latex sensibilisées par des groupes spécifiques d’anticorps anti-pneumocoque. On note la formation d’agrégats visibles lorsque les particules de latex réagissent avec les antigènes. Le latex reste en suspension en cas d’absence d’antigènes.

CONSERVATION DES SOUCHES BACTERIENNES

Streptococcus pneumoniaeest un germes exigeant, nous avons utilisé les méthodes de conservation de longuedurée (à -70°C) qui réduisent considérablement les risques deperte des souches gardées.

Technique

Utiliser une culture en phase de croissance (une souche de 24 heures).
Conserver dans 0,5 ml d’un bouillon nutritif adapté (tableau XVII) dans un cryotube avec un inoculum de 10 bactéries/ml apportées par un milieu solide ou un culot de bouillon enrichi.
Ranger les cryotubes dans un portoir et placer immédiatement à -70°C.
Les bactéries peuvent se conserver ainsi pendant plusieurs années. En cas de besoin, la décongélation a été faite au bain-marie à 37°C pendant quelques minutes.

APPROCHE METHODOLOGIQUE

PRELEVEMENTS

Les prélèvements ont été effectués dans de bonnes conditions afin d’éviter les contaminations. Pour cela un nettoyage préalable des orifices était fait lors des écouvillonnages des otites moyennes aiguës etdes rhino-sinusites. La ponction des sinus plus indiquée était rarement effectuée à cause de la délicatesse de l’opération.
Les difficultés rencontrées lors du prélèvement du pus d’origine auriculaire étaient dues à l’épaisseur de l’écouvillon. Les prélèvements étaient donc sujets à des contaminations. Certains auteurs préconisent l’utilisation d’écouvillon en alginate monté sur tige métallique [5].
Les prélèvements des voies respiratoires basses étaient plus difficiles à réaliser car désagréables pour le patient et source de contaminants salivaires. Ceci explique le nombre important de prélèvements inexploitables dans cette étude.
Le transport des prélèvements était réalisé dans des glacières à 4°C et le traitement de ces prélèvements était fait dansles deux heures à causede la fragilité de Streptococcus pneumoniaetrès sensibles à la prolifération des autres bactéries.
Ce transport n’a pas été des meilleurs car l’utilisation d’un milieu de transport aurait été nécessaire étant donné la fragilité des germes.

EXAMEN MICROSCOPIQUE APRES COLORATION

La coloration de Gram a permis d’exclure les germes qui ne faisaient pas partie de l’étude.
L’examen microscopique après coloration de Gram est très évocateur pour les Pneumocoques qui ont une morphologie bien spécifique.

ISOLEMENT

La GSC Gentamicine a été utilisée pour l’isolement de Streptococcus pneumoniae avec comme milieu de base la gélose de Müller Hinton. Le sang est d’origine équine.
La difficulté de l’étape d’isolement a résidé dans la distinction des différentes colonies car la primo culture était généralement poly microbienne.
Sur GSC, les colonies α-viridans plates, avec une dépression centrale sont spécifiques des Pneumocoques ; elles sont différentes de celle des Entérocoques qui ne sont pas hémolytiques etdes autres Stréptocoques α-viridans dont les colonies sont blanchâtres et bombées. Mais cette distinction n’était pas aisée vu la taille des colonies petites bombées blanchâtres et α-viridans, d’Entérocoques translucides nonhémolytiques.
La recherche des pneumocoques a été faiteen faisant l’examen microscopique sur une parcelle de colonie. Lorsque ce dernier révélait des diplocoques Gram positif lancéolés, on repiquait le reste de la colonie en vue des tests d’identification. Il était important de répéter ce procédé sur plusieurs colonies.
Les mêmes difficultés ont été rencontrées avec ce milieu d’isolement lors d’études précédentes [41].
Par contre, les cultures étaient excellentes sur la GSC Gentamicine en ce qui concerne les otorrhées et les prélèvements sinusiens qui, pour la plupart, étaient monobactériens ; ce qui confirme les résultatsde BATHILY avec la GSC Gentamicine
[12].

Antibiogramme standard

C’est la méthode de référence car plus facilement réalisable et moins onéreuse.
Cependant elle présente certaines limites notamment dans la mesure des diamètres d’inhibition qui est peu précise, dans ladiffusion des molécules de haut poids moléculaire tels que les Glycopeptides (Téicoplanine et Vancomycine).
Toutefois, il faut noter que le recours habituel à cette technique est à l’origine du non respect des conditions de réalisation selon les normes NCCLS à savoir l’épaisseur de la gélose, le nombre de disques par boîte, l’âge de l’inoculum, le tempsd’incubation…

Détermination de la CMI par E-test®

Contrairement à l’antibiogramme standard, la méthode par E-test est onéreuse et difficile à réaliser. Cette difficulté a souvent été la cause de contaminations et de résultats incohérents, ce qui nécessitait la reprise des tests. De plus la lecture des CMI n’a pas été aisée.
Il n’en demeure pas moins que cette technique est plus explicite quant à l’efficacité des antibiotiques.Elle permet d’établir une relation entre l’activité in vitro des molécules d’une même famille sur un germe donné.

Profil de sensibilité

La moitié des souches de Pneumocoques étudiées s’est montrée résistante à la Pénicilline avec 33,3% de Pneumocoques à sensibilité diminuée à la Pénicilline (PSDP) et 16,6% de Pneumocoques résistants à la Pénicilline (PRP). De fortes résistances ont été notées avec la Tétracycline, la Téicoplanine et l’association Sulphamétoxazole/ Trimotoprime. Par contre les Macrolides et apparentés et les Fluoroquinolones se sont montrés efficaces avec une sensibilité allant de 75 à 100%.

CONCLUSION

Les infections respiratoires à Stretococcus pneumoniae,aussi bénignes soient elles, peuvent revêtir un caractère létal lorsque la prise en charge est défectueuse surtout dans la petite enfance. C’est ainsi qu’elles sont la première cause de mortalité et de morbidité infantile.
L’inquiétude des parents et le désir de guérison spontanée des adultes poussent les médecins à une prescription excessive d’antibiotiques qui n’est pourtant pas justifiée, étant donné que70% des cas sont d’origine virale.
Face à cette consommation exagérée d’antibiotiques, les bactéries réagissent autant qu’elles peuvent, en déployant des mécanismes de résistance allant même jusqu’à la mutation.
La surveillance de la résistance de Streptococcus pneumoniaeest une préoccupation perpétuelle aussi bien dansles pays industrialisés que ceux en voie de développement.
Des études menées de part lemonde, permettent non seulement d’enregistrer des résistances aux antibiotiques habituellement prescrits notamment les β-lactamines, les Macrolides mais aussi de mettre en évidence les mécanismes de résistance etles gènes responsables.
L’étude réalisée entre Janvier 2005 etMai 2006 à l’unité de Bactériologie- Virologie du CHU Le Dantec s’inscrit dans ce cadre.
Elle a porté sur 30 souches de Pneumocoques isolées chez des enfants âgés de 3 mois à 14 ans etchez des adultes, atteintsd’infections respiratoires aiguës hautes et basses. Les prélèvements ont été réalisés dans quatre structures à savoir les services de Pédiatrie et d’ORL de l’HALD, le service de Pneumophtisiologie du CHU de Fann et un cabinet privé d’ORL.
Le choix des antibiotiques a porté sur plusieurs familles : les β-lactamines, les Macrolides, les Lincosamines, les Stréptogramines, les Kétolides, les Fluoroquinolones et les Glycopeptides.
Ces derniers ont été testés par deux techniques de détermination de la sensibilité à savoir l’antibiogramme standardet la détermination de la CMI.par Etest®.
Les souches de pneumocoques testées ont montré une résistance augmentée avec la pénicilline ; il en est de même avec l’Erythromycine. Cette résistance s’est étendue à la Clindamycine et à la Pristinamycine par le phénotype MLSBcodé par le gène erm (B).
Les Macrolides et apparentés ont eu une action considérable sur ces souches.
La Télithromycine et les Fluoroquinolones quant à elles, se sont montrées très actives vis-à-vis des souches depneumocoques. Elles constitueraient un traitement substitutif dans les infections respiratoires à pneumocoques.
Par contre la Tétracycline a montré une faible activité, elle devrait pour le moment être écartée de tout traitement d’IRA.
Certains auteurs parlent d’une nouvelleclasse d’antibiotiques, la classe des Oxazolidinones avec pour chef de file la Linézolide dont l’efficacité bactériologique et clinique a été démontrée dans le traitement des IRA causéespar les germes à Gram positifcomme le pneumocoque.
L’origine en majorité virale des IRA n’est pas à négliger. Le traitement symptomatique de ces infections pourrait contribuer à un meilleur contrôle de la résistance bactérienne.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I-L’APPAREIL RESPIRATOIRE
I-1 LES VOIES AERIENNES SUPERIEURES
I-2 LES VOIES RESPIRATOIRES BASSES
II- LES PRINICPALES INFECTIONS
III-GENERALITES SUR LE PNEUMOCOQUE
III-1 HISTORIQUE
III-2 TAXONOMIE ETNOMENCLATURE
III-3 CARACTERES BACTERIOLOGIQUES
III-3-1 Caractères morphologiques
III-3-2 Caractères culturaux
III-3-3 Caractères biochimiques
III-3-4 Identification formelle
III-4 POUVOIR PATHOGENE ET FACTEURS DE VURULENCE
III–4-1 Le portage asymptomatique des sujets sains
III–4-2 Pouvoir pathogène naturel
III–4-3 Facteurs de virulence
III-4-3-1 La capsule
III–4–3-2 Pneumolysine
III–4–3-3 La protéine A de surface
IV- PROFIL DE SENSIBILITE
IV-1 DEFINITION DE LA RESISTANCE
IV-2 LES DIFFERENTS TYPES DE RESISTANCE
IV–2-1 La résistance naturelle
IV–2-2 La résistance acquise
IV-2-3 La résistance clinique
IV-3 SUPPORT GENETIQUE
IV-3-1- Résistance chromosomique
IV-3-2- Résistance extra chromosomique
IV-4 PHENOTYPES DE RESISTANCE
IV-5 LES MECANISMES DE RESISTANCES
IV-6 RESISTANCE DU PNEUMOCOQUE PAR RAPPORT AUX DIFFERENTES FAMILLES D’ANTIBIOTIQUES
IV–6-1 Résistance aux bêta-lactamines
IV–6-2 Résistance aux MLSB
IV–6-3 Résistance aux Kétolides
IV–6-4 Résistance aux fluoroquinolones
IV–6-5 Résistance aux Tétracyclines
IV–6-6 Résistance aux Glycopeptides
V- PROPHYLAXIE (VACCINATION)
V-1 VACCIN POLYSACCHARIDIQUE
V-2 VACCINS CONJUGUESDEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES
I-MATERIEL
I-1 Cadre de l’étude
I-2 Origine des souches de pneumocoque
I-3 Matériel de prélèvement
I-4 Matériel pour isolement
I-5 Matériel pour identification
I-6 Matériel pour Antibiogramme
I-7 Matériel pour la détection de la CMI par E-Test
I-8 Matériel de conservation
I-9 Matériel d’exploitation des résultats
II- METHODES
II-1 Prélèvements
II-1-1 Conditions de réalisation des prélèvements
II-1-2 types de prélèvements
II-1-3 Transport des prélèvements
I-1-4 Conservation des prélèvements
II-2Examen macroscopique
II-3 Examen microscopique après coloration au GRAM et au bleu de méthylène
II-4 ISOLEMENT
II-5 IDENTIFICATION
II-5-1 Examen macroscopique des colonies
II-5-2 Examen microscopique
II-5-3 Testde la catalase
II-5-4 Test de solubilité dans la bile
II-5-5 Le test de sensibilité à l’optochine
II-5-6 Miseen évidence de l’antigène capsulaire par agglutination
II-5-7 Micro méthodes d’identification
II-6 DETERMINATION DELA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
II-6-1 Antibiogramme standard ou diffusion en milieu gélosé
II-6-1-1 Principe
II-6-1-2 Méthode de réalisation de l’antibiogramme standard
II-6-2 DETERMINATION DE LA CMI PAR E-TEST (EPSILLOMETER TEST)
II-6-2-1 Principe
II-6-2-2 Mode opératoire
II-6-2-3 Stockage des bandes E-test
II-6-2-4 Critères d’interprétation
II-7 CONTROLE DE QUALITE DES TESTS DE SENSIBILITE
II-8 ANALYSE DES RESULTATS DE LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
II-9 CONSERVATION DES SOUCHES BACTERIENNES
II-9-1 Technique
II-9-2Règle d’étiquetage
TROISIEME PARTIE : RESULTATS
I- PRELEVEMENTS
II- SOUCHES BACTERIENNES
III- RESULTATS DE LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES
III-1 RESULTATS DU CONTROLE DES METHODES D’ETUDE DE LA SENSIBILITE
III-2 SENSIBILITE DE Streptococcus pneumoniae
III-2-1 Antibiogrammestandard
III-2-2 Détermination de la CMI
III-2-3 Multi résistance
QUATRIEME PARTIE : DISCUSSION
IV- APPROCHE METHODOLOGIQUE
IV-1 PRELEVEMENTS
IV-2 EXAMEN MICROSCOPIQUE APRES COLORATION
IV-3 ISOLEMENT
IV-4 Identification
IV-5 CONSERVATION
IV-6 TESTS DE SENSIBILITE
IV-6-1- Techniques
IV-6-1-1 Antibiogramme standard
IV-6-1-2 Détermination de la CMI par E-testR
IV-6-2- Profil de sensibilité
IV-6-2-1- Sensibilité aux β-lactamines
IV-6-2-2- Sensibilité aux M.L.SB.K
IV-6-2-3- Sensibilité aux autres antibiotiques
IV-6-2-4- Multi résistance
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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