Méthode d’analyse par électrophorèse capillaire du diclofenac

Mécanisme d’action

     Le diclofenac possède des propriétés anti-inflammatoires, antalgiques et antipyrétiques. Par ailleurs, il provoque une inhibition des fonctions plaquettaires. L’ensemble de ces propriétés est lié à une inhibition des fonctions de la cyclooxygénase et, par conséquent, de la biosynthèse des prostaglandines inflammatoires L’action des AINS sur la fièvre serait due à une inhibition de la synthèse des prostaglandines au sein du système nerveux central, au niveau du centre de la réaction hyper pyrétique situe dans l’hypothalamus antérieur Sous forme de gel, le diclofenac possède une activité locale anti-inflammatoire et antalgique.

Symptômes et traitement du surdosage

      Pour traiter une surdose présumée, communiquez avec le centre antipoison de votre région. En cas d’ingestion de diclofenac sodique, il n’y a pas d’antidote spécifique. L’absorption systémique devrait être évitée le plus tôt possible en provoquant le vomissement, un lavage gastrique ou un traitement avec du charbon activé. Un traitement d’appoint et symptomatique devrait être donné pour des complications comme l’hypotension, l’insuffisance rénale, les convulsions, l’irritation gastrointestinale et la dépression respiratoire. Des mesures visant à accélérer l’élimination (diurèse forcée, hémoperfusion, dialyse) peuvent être considérées, mais ces mesures sont d’emploi limité à cause de la forte liaison protéinique du diclofénac sodique et de l’étendue de son métabolisme.

Autorisation de Mise sur le Marché (AMM)

      Lorsqu’un fabricant s’est assuré de la maitrise de la qualité de son médicament, il adresse au Ministère en charge de la Santé Publique (MSP) un dossier prouvant cette maitrise : le dossier d’AMM. Le visa n’est accordé que lorsque le fabricant a apporté des justifications qu’il a fait procéder à la vérification de l’innocuité du produit dans les conditions normales d’utilisation et de son intérêt thérapeutique ainsi qu’à son analyse qualitative et quantitative, qu’il possède des conditions de fabrication et notamment des procédés de contrôle de nature à garantir la qualité de ces produits [14]. Pour obtenir le visa dans l’espace de l’Union Economique et Monétaire Ouest Africaine(UEMOA), le fabricant doit fournir un dossier de demande accompagné du récépissé de payement des redevances. Le dossier est composé de cinq modules :
• Module 1 ou dossier administratif, qui comprend :
– un formulaire de demande d’AMM;
– des renseignements sur le demandeur ;
– des renseignements sur le fabricant et/ou l’exploitant du produit ;
– l’état de commercialisation du produit ;
– l’AMM et/ou le certificat de produit pharmaceutique délivré par une autre autorité de règlementation ;
– le modèle-vente du produit pharmaceutique soumis à homologation ;
– autres documents jugés pertinents par l’autorité de réglementation pharmaceutique.
• Un dossier technique comprenant les modules suivants :
– Module 2 ou résumé du dossier technique ;
– Module 3 ou dossier qualité ;
– Module 4 ou dossier non clinique comprenant la documentation pharmacologique et toxicologique sur le produit pharmaceutique ;
– Module 5 ou dossier clinique comprenant la documentation clinique, les données de bioéquivalence ou des tests de dissolution lorsqu’il s’agit d’un médicament sous dénomination générique.
Les redevances accompagnant le dossier sont :
• La redevance due à l’autorité de réglementation : elle est versée à l’autorité de réglementation et le montant de base est fixé par arrêté ministériel. Elle participe au financement des actes administratifs et de l’expertise technique. Chaque Etat membre fixe le montant et les modalités de perception de ces redevances. La redevance de base est réduite de 50% pour les médicaments produits localement dans les états membres de l’UEMOA.
• Redevance de base d’un produit pharmaceutique à usage humain : elle est exigée pour chaque dosage, chaque forme pharmaceutique et chaque présentation.
• Redevance pour une demande de variation majeure : La redevance due au titre d’une demande de variation majeure d’une Autorisation de Mise sur le Marché correspond à la redevance de base.

Critères de Qualité d’un médicament

      Les critères de qualité d’un médicament sont la pureté, l’activité, l’uniformité de la forme pharmaceutique, la biodisponibilité et la stabilité [1,7]. Tous ces aspects peuvent être influencés par le procédé de fabrication, le conditionnement, le stockage et d’autres facteurs.
Ø Identité : Le principe actif correct doit être présent dans le produit. Cette caractéristique est généralement la plus facile à garantir. Dans la plupart des cas, quand les analyses révèlent la présence d’un principe actif différent de celui qui est associé au médicament, il s’agit d’une erreur de conditionnement ou d’étiquetage.
Ø Pureté : La majorité des médicaments contiennent des principes actifs et des adjuvants qui sont ajoutés pour améliorer une propriété telle que la consistance ou la couleur. Il est essentiel que ces adjuvants soient exempts de contaminants nocifs, de bactéries et d’autres micro-organismes qui peuvent nuire à la santé du malade.
Ø Sécurité : Le médicament pris dans les conditions normales est inoffensif. La sécurité, ou innocuité, d’un médicament est déterminé par des études de toxicité (carcinogenèse, tératogenèse) et de pharmacocinétique.
Ø Activité : Le médicament doit contenir la quantité exacte de principe actif indiquée. La majorité des pharmacopées acceptent qu’un médicament donné contienne entre 90 et 110% de la quantité de principe actif inscrite sur l’étiquette. Cette quantité doit être stable jusqu’à la date de péremption du médicament.
Ø Uniformité : La consistance, la couleur, la forme et la taille d’un médicament donné (qu’il soit sous la forme d’un comprimé, d’une crème ou d’un liquide) ne doivent pas varier d’une dose à la suivante. L’absence d’uniformité peut provenir de problèmes au niveau de l’identité, de la pureté ou de l’activité.
Ø Biodisponibilité : La biodisponibilité est la vitesse et l’intensité de mise à disposition du principe actif ou de sa fraction thérapeutique destinée à devenir disponible au niveau des sites d’action.
Ø Stabilité : C’est l’aptitude d’un médicament à conserver ses propriétés chimiques, physiques, bactériologiques et biopharmaceutiques dans les limites spécifiées ; pendant toute sa durée de validité. Cette stabilité dépend de paramètres extrinsèques (température, humidité, lumière etc.) et intrinsèques qui sont liés aux matières premières, à la forme pharmaceutique et au conditionnement. Elle peut être déterminée, selon les conditions de température et d’humidité choisies, par une étude de dégradation accélérée ou par une étude de stabilité en temps réel.
Ø Conditionnement et conservation des médicaments : Il s’agit des opérations complémentaires à la mise en forme. Le Conditionnement d’un médicament consiste à l’enfermer dans une enveloppe, qui peut être de forme et de matière très variées, donnant ainsi au produit son aspect définitif. Le conditionnement a pour objectif :
– de contenir la forme pharmaceutique et de la protéger contre les chocs, la déformation, les souillures et les facteurs d’altération externes (humidité, lumière, oxygène etc.) ;
– de faciliter la distribution et l’utilisation du médicament;
– de constituer un élément de sécurité grâce à un étiquetage adéquat ;
– d’être en harmonie avec le caractère noble du médicament et de ce fait d’inspirer confiance au malade.
Ces derniers peuvent être décelées par l’analyse des caractéristiques organoleptiques, la présence de précipités, etc., mais également par des contrôles physico-chimiques, physiologiques et microbiologiques.

Electrophorèse capillaire de zone (CZE)

      C’est le procédé d’électrophorèse le plus courant. Le capillaire est parcouru par l’électrolyte constitué soit par un milieu tampon qui, selon l’application, est acide (phosphate ou citrate) ou basique (borate), soit par un ampholyte (molécule possédant une fonction acide et une fonction basique). Le flux électroosmotique croit avec le pH de la phase liquide, Il peut être rendu nul. Ce procédé est encore appelé électrophorèse en solution libre par opposition à l’électrophorèse capillaire sur gel [16].

La validation d’une méthode analytique

      La validation d’une méthode consiste à déterminer certaines caractéristiques du dosage d’une substance dans un substrat. Elle a pour objectif principal de s’assurer qu’une méthode analytique donnera des résultats suffisamment fiables et reproductibles, compte tenu du but de l’analyse. La liste et la définition des caractéristiques qui peuvent être spécifiées pour une méthode analytique sont données par ICH (International Conférence on Harmonisation), il s’agit de :
− L’exactitude ou justesse exprime l’étroitesse de l’accord entre la valeur moyenne obtenue à partir d’une série de résultats et une valeur qui est acceptée comme « référence ». Elles permettent d’évaluer l’erreur systématique associée à la méthode ;
− La fidélité exprime l’étroitesse de l’accord entre une série de mesures provenant de plusieurs prises d’un même échantillon homogène dans des conditions définies. Elle est évaluée à trois niveaux :
• Répétabilité : elle est évaluée dans des conditions ou les résultats d’essai sont obtenus par la même méthode sur des échantillons identiques dans le même laboratoire, par le même opérateur, utilisant le même équipement et pendant un court intervalle de temps (essais réalisés la même journée) ;
• Fidélité intermédiaire : conditions où les résultats d’essais indépendants sont obtenus par la même méthode sur des échantillons d’essais identiques dans le même laboratoire, avec différents opérateurs et utilisant des équipements différents et pendant un intervalle de temps donné (plusieurs jours) ;
• Reproductibilité : conditions où les résultats sont obtenus par la même méthode sur des échantillons d’essais identiques dans laboratoires différents, avec différents opérateurs et utilisant des équipements différents.
− La sélectivité est l’aptitude d’une méthode à mesurer la concentration de l’analyte sans interférence de la part des autres constituants de l’échantillon. Lorsque tous les autres constituants sont connus et disponibles, la sélectivité peut être déterminée en comparant les résultats obtenus avec l’analyte seul et avec l’analyte additionné des substances soupçonnées de provoquer des interférences. Lorsque ces substances n’ont pu être identifiées ou ne sont pas disponibles, on peut souvent évaluer la sélectivité en ajoutant des quantités connues d’analyte pur à des échantillons dans lesquels la concentration des autres constituants est maintenue constante et en déterminant la quantité d’analyte retrouvée ;
− La sensibilité est l’aptitude de la méthode à détecter de petites variations de concentration. Une procédure est dite sensible si une faible variation de la concentration ou de la quantité d’analyte entraine une variation significative de la réponse ;
− La fonction de réponse correspond à la courbe d’étalonnage, cela traduit la relation entre la réponse correspondant au signal et la concentration en substance analysée ;
− La linéarité d’une procédure d’analyse est sa capacité à produire des résultats proportionnels à la quantité d’analyte dans l’échantillon ;
− La limite de détection (LOD) est la plus petite quantité de l’analyte dans un échantillon pouvant être détectée, mais non quantifiée comme une valeur exacte dans les conditions expérimentales de la procédure ;
− La limite de quantification (LOQ) est la plus petite quantité de l’analyte dans un échantillon pouvant être dosée avec exactitude dans les conditions expérimentales de la procédure.

CONCLUSION

        La douleur et l’inflammation sont des symptômes fréquents et quelle qu’en soit les causes, elles peuvent devenir insupportables et envahir l’univers affectif du patient qui cherchera à être soulagé. A cet effet, l’industrie pharmaceutique a mis à la disposition du patient et du personnel de santé, une large gamme d’antalgiques et d’anti inflammatoires non stéroïdiens comme le diclofenac et l’ibuprofène. Il est donc primordial de s’assurer de la qualité de ces médicaments afin de permettre une prise en charge adéquate du malade. En effet, le contrôle de la qualité des médicaments est devenu indispensable au vu de l’ampleur de la contrefaçon des produits pharmaceutiques. C’est dans ce cadre, que s’inscrit cette thèse d’exercice qui a consisté à :
• développer le profil d’exactitude du diclofenac
• développer et valider une méthode d’analyse du diclofenac par électrophorèse capillaire, puis à l’appliquer au contrôle de la qualité de médicaments à base de diclofenac commercialisé au Sénégal.
La mise au point des protocoles de dosage des molécules nécessite la détermination d’un certain nombre de paramètres. Le diclofenac a un pKa de 4,15. A pH=9,3 il peut être élué par électrophorèse capillaire de zone. Le tampon utilisé est un tampon borate. A ce pH le temps d’élution du diclofenac est d’environ 6 minutes. Le diclofenac est soluble dans l’eau, nous avons donc fait l’extraction des échantillons avec de l’eau ultra pure. L’influence de la tension et du courant a également été étudiée et on obtient une meilleure allure des pics électrophorétiques avec :
• une tension de séparation de 20kV ;
• une pression de 50 mbar ;
• une fréquence d’acquisition de 33,3Hz.
Notre choix s’est porté sur la procaïne comme étalon interne car elle a fait ses preuves pour plusieurs molécules en milieu acide et basique. De plus elle s’adapte bien aux conditions de travail et on obtient une bonne séparation entre les 2pics. La validation de la méthode de dosage passe par l’évaluation de :
• la linéarité : la méthode s’est révélée linéaire avec un coefficient de corrélation R² = 0,996 (>0,99);
• l’exactitude avec un taux de recouvrement de 93-106% ;
• la fidélité : la méthode est répétable avec un CV de répétabilité de 2,07% et une bonne fidélité intermédiaire avec un coefficient de variation CV qui varie entre 1,8% et 4,8%
• la sélectivité : on a obtenu une bonne séparation des pics de l’échantillon et de l’étalon interne sans interférences des excipients ;
• La limite de détection (LOD) : elle est faible et estimée à 2,5mg/l ;
• La limite de quantification (LOQ) : elle est aussi faible et estimée à 7,5mg/l.
Ces paramètres de validation ont été vérifiés, satisfaisants et intéressants. Il est donc possible d’utiliser de cette méthode à des fins d’analyse qualitative et quantitative. Ainsi, cette méthode validée a été appliquée à l’analyse de trente (30) échantillons de diclofenac prélevés sur cinq régions du Sénégal dans les 2 secteurs (privé et illicite). Les résultats obtenus ont montré que tous les échantillons analysés contenaient du diclofenac à des doses correctes. La méthode que nous avons développée et validée utilise seulement de l’eau ultra pure comme solvant d’analyse. En outre elle est simple, écologique, économique et les résultats obtenus sont comparables à ceux des méthodes officielles. L’électrophorèse capillaire présente ainsi un intérêt majeur pour les laboratoires pharmaceutiques, les structures publiques et universitaires du fait de sa facilité de mise en œuvre, son caractère écologique et bon marché.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE
I PRESENTATION GENERALE DU DICLOFENAC
I.1 Structure
I.2 Propriétés physico-chimiques
I.3 Synthèse du diclofenac
I.4 Mécanisme d’action
I.5 Propriétés pharmacocinétiques
I.5.1 Absorption
I.5.2 Distribution
I.5.3 Métabolisme
I.5.4 Excrétion
I.5.5 Variations physiopathologiques
I.6 Indications
I.7 Posologie
I.8 Contre-indications
I.9 Effets indésirables
I.10 Symptômes et traitement du surdosage [11]
II NOTIONS DE QUALITE DES MEDICAMENTS
II.1 Médicament
II.1.1 Définition
II.1.2 Spécialité pharmaceutique
II.1.3 Médicament générique
II.1.4 Autorisation de Mise sur le Marché (AMM)
II.2 Qualité
II.2.1 Définition
II.2.2 Assurance Qualité
II.2.3 Critères de Qualité d’un médicament
II.2.4 Evaluation de la Qualité
II.3 Importance du contrôle
III METHODES D’ANALYSE DU DICLOFENAC
III.1 Electrophorèse capillaire(EC)
III.1.1 Principe et fonctionnement
III.1.2 Appareillage
III.1.3 Migration électrophorétique
III.1.4 Flux électroosmotique (feo)
III.1.5 Mobilité apparente
III.2 Les différents modes de séparation en EC
III.2.1 Electrophorèse capillaire de zone (CZE)
III.2.2 Electrophorèse capillaire électrocinétique micellaire (MEKC)
III.2.3 Electrophorèse capillaire sur gel
III.2.4 Electrophorèse à focalisation isoélectrique
III.3 Caractéristique de la méthode
III.3.1 Avantages
III.3.2 Les limites
IV La validation d’une méthode analytique
DEUXIEME PARTIE: TRAVAIL EXPREMENTAL
I Objectif général de l’étude
II Cadre de l’étude
III Matériel et méthodes
III.1 Matériel
III.1.1 Appareil d’électrophorèse capillaire
III.1.2 Petits matériels
III.1.3 Réactifs utilisés
III.1.4 Instrumentation
III.2 Méthodes
III.2.1 Préparation des échantillons et solutions
III.2.2 Validation des méthodes
III.2.3 Analyse des médicaments
III.2.4 Conditions d’analyse du diclofenac
III.2.5 Méthode de dosage du diclofenac par spectrophotométrie UV-visible
IV RESULTATS
IV.1.1 La sélectivité
IV.1.2 La linéarité
IV.1.3 La fidélité
IV.1.3.1 La répétabilité
IV.1.3.2 La fidélité intermédiaire
IV.1.4 Le profil d’exactitude
IV.1.5 La limite de détection
IV.1.6 La limite de quantification
IV.2 Méthode de calcul du pourcentage en diclofenac des échantillons
V Discussion
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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