Méthode d’analyse des paramètres physico-chimiques

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Matériels et méthodes.

Présentation de la région d’étude:

Le golfe d’Annaba se situe à l’extrême Nord Est de l’Algérie, entre le cap Rosa (8°15 E et 36°58 N) et le cap de garde (7°16 E et 36°58 N) (fig. 12). Les eaux de ce golfe reçoivent dans la zone Est les déversements des oueds Seybouse et Mafragh transportant des régions de Guelma, El Taref, et Annaba eaux terrigène, agricole, domestique et industrielle.
Le fond du plateau continental est débuté par du sable fin au voisinage du secteur Ouest, au large on rencontre de la vase terrigène molle mélangée à des sables et à des débris de coquilles.
Dans le golfe d’Annaba, les fonds sont en général meubles à sédiments vaseux et sablo-vaseux, avec par endroit un tapis très réduit d’herbier à posidonie installé sur des substrats rocheux en bordure des caps et sur substrats meubles tout le long de la côte.
Cette phanérogame marine montre actuellement des signes de dégradation surtout à l’ouest des 2 oueds probablement en raison de l’effet entre autres des polluants chimiques rejetés par les 2 complexes industriels d’El-Hadjar (complexe sidérurgique) et ASMIDAL (complexe d’engrais phosphatés).

Choix et localisation des stations:

Nous avons choisi 2 stations dans le secteur Ouest du golfe d’Annaba, elles ont été retenues pour leur abondance en posidonie. Les 2 sites sont soumis à une pollution directe par les rejets d’agglomérations, la turbidité des eaux et par le faible hydrodynamisme qui caractérise cette zone.
Matériels et méthodes

La caroube (station A):

Cette station (fig. 13) se situe au centre ouest de la baie d’Annaba au niveau de l’étage infra littoral accessible en plongée sous-marine, les photographies prises sur les 2 sites montrent que l’herbier prolifère sur un substrat rocheux et meuble. Les herbiers de cette région sont influencés d’une part par les rejets des eaux usées des agglomérations et d’autre part par les barques à moteur qui ont pris cette plage pour port. L’herbier s’étend sur environ 2 hectares et ses rhizomes sont en grande majorité plagiotropes.

Le Club de la mer (station B) :

Cette plage (fig. 14) se trouve de la baie d’Annaba à l’ouest de la station la caroube. Vu la présence de 2 complexes touristiques, l’herbier de cette plage, sont moins important que celui de la 1ère, (1 hectare) ils prolifère sur un substrat rocheux.

Méthodes d’analyse des paramètres physico-chimiques:

Nous avons utilisé lors de nos sorties, un multi paramètre de terrain «Consort C 535» qui nous a permis de mesurer, la température et la salinité (voir annexe 1).
Chaque plage a été découpée en plusieurs stations à partir desquelles, nous avons prélevé des échantillons d’1/2 litre d’eau de mer à une profondeur moyenne de 1m depuis Octobre 2004 jusqu’à Août 2005 (automne, hiver, printemps et été 2005).

Densité de l’herbier de posidonie:

Méthodologie de mesure:

La densité correspond au nombre de faisceaux de P. oceanica par unité de surface (m²). Elle est déterminée par comptage in situ, à l’intérieur d’un quadra de 40 cm de coté (Boudouresque et al., (1980). Les mesures sont effectuées au hasard à l’intérieur de l’herbier homogène selon la méthode de (Panayotidis, (1980).
Du fait de la structure agrégative des herbiers (répartition en taches), Panayotidis et al., (1981), préconisent, dans l’évaluation de la densité moyenne, la réalisation des réplicats. Aussi, 10 réplicats sont effectués dans chaque station (voir annexe 2).
Les faisceaux foliaires en division sont comptabilisés comme séparés (Giraud, (1977b). Chaque valeur de densité est ramenée au m²; la densité moyenne est ainsi estimée. En fonction de la densité moyenne, représenté dans le (Tableau 1), le type d’herbier est défini selon la classification proposée par (Giraud, (1977b).

Analyse phénologique:

Les caractéristiques morphologiques et l’âge des feuilles différent selon la position de la feuille dans le faisceau. Au sein de chaque faisceau, les feuilles se forment au centre et sont d’autant plus âgées qu’elles sont situées vers la périphérie. Ces dernières acquièrent un pétiole lorsque leur allongement est presque terminé (Giraud, (1977a).
Pour l’étude phénologique, nous avons exploité la méthode de Caye (1980) seul les faisceaux orthotropes sont pris en compte. En effet, P. oceanica peut présenter au cours de son développement 2 types de croissances: une croissance verticale ou orthotrope et une croissance horizontale ou plagiotrope. Ce dimorphisme lié au mode de croissance présente une diversité de fonction des rhizomes. Les axes plagiotropes assurent la multiplication végétative et les axes orthotropes sont responsables du maintient en place et de la multiplication sexuelle.
Du fait de cette diversité de fonction, les rhizomes plagiotropes et orthotropes ne présentent pas un rythme de développement similaire (nombre de feuilles produites, vitesse de croissance), et ne peuvent donc être directement comparés. La phénologie des faisceaux: nombre de feuilles et biométrie foliaire est étudiée selon la méthode de Giraud (1977a).

Echantillonnage:

Les paramètres phénologiques fluctuent en fonction des saisons, aussi les prélèvements sont effectués, pour les 2 stations, à la même période pour pouvoir être comparés dans chaque station «Caroube» et «Club de la mer». Vingt faisceaux sont prélevés en plongée 1 fois par saison pour chaque station. Les rhizomes sont orthotropes et comme le prédit Pergent (1987) ils sont distants de 0,5 à 1 m les uns des autres pour éviter de récolter des individus rattachés à un même rhizome plagiotrope encore vivant.
Ces critères phénologiques peuvent apparaître comme de bons indicateurs de la vitalité de P.

Analyse biométrique:

Les faisceaux sont décortiqués feuille par feuille en respectant l’ordre distique de leur insertion. En fonction de la maturité des feuilles, celles-ci sont classées en 3 catégorie comme le préconise Giraud, (1977a):
– Les feuilles adultes, de plus de 50 mm de long et pourvues d’un pétiole.
– Les feuilles intermédiaires, de plus de 50 mm de long dépourvues de pétiole.
– Les feuilles juvéniles, de longueur inférieure ou égale à 50 mm et dépourvues de pétiole. Les mesures pour chaque faisceau sont réalisées et consignées dans des tableaux (voir annexe 3):
– Longueur totale de la feuille (L.O).
– Longueur du pétiole (L.P).
– Largeur du limbe (L.A).
Lorsque les mesures portant sur l’ensemble des faisceaux sont terminées les différents paramètres relatifs à la phénologie sont calculés, à savoir:
– Le nombre moyen de feuilles adultes, intermédiaires et juvéniles par faisceau.
– La longueur moyenne des feuilles adultes, intermédiaires et juvéniles.
– La largeur moyenne des feuilles adultes, intermédiaires et juvéniles.
– La longueur moyenne des pétioles.
Le coefficient A a été calculé selon Giraud (1977a), il correspond au pourcentage de feuilles ayant perdues leur apex. En effet, l’extrémité des feuilles ou apex peut être entière ou brisée, ce qui correspond soit à une consommation par les herbivores (Nedelec, (1982); Velimirov, (1984); Zupo et Fresi, (1984), soit à l’action de l’hydrodynamisme favorisée par la présence des épiphytes (Eugene, (1978); Mazzella et al., (1981); Wittmann et al., (1981); Mazzella et al., (1991).
L’état des apex, paramètre purement descriptif, permet d’apprécier, pour un site donné, le taux de bouturage et par conséquent l’importance des populations herbivores.
Pour faciliter l’identification des feuilles entières nous les avons représenté (voir annexe 3) sur un fond de couleur grise.
La surface foliaire moyenne (SF) exprimée en cm²/ faisceau (Drew et Jupp, (1976) est calculée à partir de l’équation suivante pour chaque catégorie de feuilles:
– SF moyen des feuilles Adultes = ((∑ long. FA x ∑ larg. FA) par faisceau) / nr. de faisceaux.
– SF moyen des feuilles Intermédiaires =∑ ((long. FI x ∑ larg.FI) par faisceau) / nr. de faisceaux.
– SF moyen des feuilles Totales = ((∑ long. (FA+FI) x ∑ larg. (FA+FI) par faisceau) / nr. de faisceaux. Connaissant la densité, l’indice foliaire est calculé en m² / m², en multipliant la surface foliaire par la densité.

Méthode de calcul:

Le calcul des paramètres biométriques et indices phénologiques est effectué comme suit :
1. Regrouper les données obtenues sur 20 rhizomes pour intégrer la variabilité liée à la plante.
2. Calculer les paramètres biométriques moyens pour chaque catégorie de feuilles: nombre de feuilles, longueur et largeur totales de la feuille et longueur des pétioles.
3. Calculer les indices phénologiques moyens pour les feuilles adultes, intermédiaires, juvéniles et globales (adultes + intermédiaires) : Leaf Area Index et coefficient A.

La chlorophylle:

La quantification des pigments chlorophylliens se fait par plusieurs méthodes, dont la plus ancienne est celle de MC-Kinney-Arnon (in Arnon, (1949) qui extrait les chlorophylles après macération du végétal dans le solvant acétone à 80%. D’autres techniques plus rapides telle que la méthode de Hiscox et Israelsiam (1978), qui remplace l’acétone par le dimethyl sulfoxyde (D.M.S.O) et réalise l’extraction sans macération des feuilles [8].

Techniques de dosage de la chlorophylle:

La posidonie utilisée est celle qui a été récoltée pour l’étude phénologique et histologique. Nous avons préféré extraire la chlorophylle sans la mettre en présence de polluants, vue que les 2 stations d’étude sont considérées comme polluées. Cette extraction est faite sur 10 échantillons pour chacune des 2 plages: la caroube et la club de la mer.

Matériels:

Spectrophotomètre, cuve pour spectrophotomètre, balance, mortier, éprouvette graduée, pipette graduée 5ml, entonnoir, boites noires, papier filtrant et feuilles fraîches de posidonie. 2.5.1.2. Réactifs: Acétone à 80% et quelques mg de bicarbonate de sodium et de l’eau distillée.

Mode opératoire:

L’extraction de la chlorophylle des tissus foliaire a été exécutée selon la méthode de Mc Kinney Arnon (in Arnon, 1949).
Des échantillons de 1g (1/3 médian de feuille) sont prélevés sur les feuilles de Posidonie à raison de 10 répartitions; pour chaque variété, on ajoute 25 ml d’acétone à 80% et quelques mg de bicarbonate de sodium. Le tout broyé dans un mortier jusqu’à dissolution totale du végétal. La solution obtenue est filtrée dans des boites noires pour éviter l’oxydation de la chlorophylle par la lumière.
Les densités optiques des échantillons biologiques sont ensuite déterminées à l’aide d’un spectrophotomètre à 2 longueurs d’onde (645 et 663 nm).
Le zéro de l’appareil est réglé à l’aide d’un blanc qui n’est autre que le solvant (acétone 80%). la teneur en chlorophylle est alors calculée par la formule relative au solvant, établie par Arnon (1949):
Ch a = 12, 7 x DO.663 – 2, 96 x DO.645.
Ch b = 22, 5 x DO.645 – 4, 68 x DO.663.
Ch a + Ch b = 8, 02 x DO.663 + 20, 20 x DO.645.
DO: densité optique (Valeur donnée par le spectrophotomètre aux longueurs d’ondes 645nm pour Ch a et et 663 nm pour Ch b).
Matériels et méthodes

Traitements statistiques utilisés :

Analyse statistique uni variée:

Les statistiques de base: (Minitab, 10147 p).

La moyenne (x) ; L’écart type (δ) ; Les valeurs maximales (x max) ; Les valeurs minimales (x min).

Test (t) de Student:

L’étude comparative entre les 2 posidonies pour chacun des 2 sites d’études a été effectuée grâce au test (t) de Student pour des échantillons indépendants selon Dagnellie, (1973).
Le test en question consiste à calculer, une quantité appelée tobs tout en la comparant avec une valeur théorique appelée t1-α/2 qu’on trouve à partir des tables statistiques de Student. Selon ce même auteur, si la valeur de tobs est supérieure ou égale à la valeur t1-α/2 des différences significatives se révèlent entre les 2 sites pour la variable en question de la posidonie étudiée. Inversement, si tobs est strictement inférieure à t1-α/2 on conclue l’absence de différences significatives entre les Posidonies des 2 sites.
Ainsi nous pouvons étudier d’une autre façon la signification et la comparer avec la valeur de la probabilité p tout en mettant l’existence des différences significatives avec leur niveau de signification. A cet effet, nous considérons les 4 situations suivantes:
– Si P > 0,05 ⇒ Il n’existe pas de différences significatives entre les 2 sites pour le même paramètre du même herbier.
– Si P ≤ 0,05⇒ Des différences significatives apparaissent entre les 2 sites (*).
– Si P ≤ 0,005⇒ On constate des différences hautement significatives entre les 2 sites (**).
– Si P ≤ 0,001⇒ On signale des différences très hautement significatives entre les 2 sites (***).

L’histologie:

Matériels:

Microscope optique, lames porte-objet, lamelles couvre-objet, lames de rasoir, boites de Pétri, pince fine, bouchons de liège, feuilles, écailles, rhizomes et èpiphyte de posidonie.

Réactifs:

Eau distillée, eau de Javel, acide acétique, vert d’iode et bleu de Toluidine.

Mode opératoire :

L’étude histologique de p. oceanica. a été faite suivant la méthode de Gorenflot (1980) en réalisant des coupes transversales fines dans l’organe à étudier (feuilles, écailles) en utilisant une lame de rasoir neuve. Les échantillons sont alors placés entre lame et lamelle et observés au microscope avec une goutte d’eau distillée.
Double coloration des parois ou coloration vitale: l’étude histologique de p. oceanica. a été réalisée selon les étapes suivantes :
Réalisation de coupes transversales fines dans l’organe à étudier (rhizome), en utilisant une lame de rasoir neuve.
Coloration des parois : les coupes sont immergées dans les réactifs suivants:
– l’eau de Javel pendant 15 min pour vider les cellules de leur contenu cytoplasmique; il ne reste que les parois squelettiques.
– l’acide acétique pendant 10 min pour neutraliser l’excès d’eau de Javel.
– Le vert d’iode pendant 10 min pour colorer les parois lignifiées ou suberifiées en vert.
– Le rouge congo pendant 10 min pour colorer les parois cellulosiques en rose.
Il est important de rincer abondement les coupes à l’eau distillée avant chacune des étapes de coloration. Les échantillons sont enfin placés entre lame et lamelle pour l’observation microscopique photonique « Motic » et la prise des photographies.

Table des matières

1. Introduction
1.1. La photosynthèse
1.1.1. Les chloroplastes
2. Matériels et méthodes
2.1.Présentation de la région d’étude
2.1.1. Choix et localisation des stations
2.1.1.1. La caroube: St (A)
2.1.1.2. Le club de la mer: St (B)
2.2. Méthode d’analyse des paramètres physico-chimiques
2.3. Densité de l’herbier de posidonie
2.3.1. Méthodologie de mesure
2.4. L’analyse phénologique
2.4.1. Echantillonnages
2.4.2. Analyse biométrique
2.4.2.1. Méthode de calcule
2.5. Quantification de la chlorophylle
2.5.1. Techniques de dosage de la chlorophylle
2.5.1.1. Matériels
2.5.1.2. Réactifs
2.5.1.3. Mode opératoire
2.6. Traitements statistiques utilises
2.6.1. Analyse statistique uni variée
2.6.1.1. Les statistiques de base: (Minitab)
2.6.2. Test (t) de Student
2.7. Histologie
2.7.1. Matériels
2.7.2. Réactifs
2.7.3. Mode opératoire
3. Résultats et interprétations
3.1. Résultats des paramètres physico-chimiques
3.1.1. Concernant les températures
3.1.2. Concernant les salinités
3.2. Densité des faisceaux
3.3. Evolution saisonnière des paramètres phénologiques
3.3.1. Nombre de feuilles par faisceau:
3.3.1.1. Nombre de feuilles globales F.A.I./ faisceau
3.3.1.2. Nombre de feuilles adultes F.A. /faisceau
3.3.1.3. Nombre de feuilles intermédiaires F.I. /faisceau
3.3.1.4. Nombre de feuilles juvéniles F.J. /faisceau
3.3.2. Longueur des feuilles
3.3.2.1. Longueur des feuilles globales F.A.I
3.3.2.2. Longueur des feuilles adultes F.A
3.3.2.3. Longueur des feuilles intermédiaires F.I
3.3.2.4. Longueur des feuilles juvéniles F.J
3.3.3. Largeur des feuilles
3.3.3.1. Largeur des feuilles globales F.A.I
3.3.3.2. Largeur des feuilles adultes F.A
3.3.3.3. Largeur des feuilles intermédiaires F.I
3.3.3.4. Largeur des feuilles juvéniles F.J
3.3.4. Longueur des pétioles L.P
3.3.5. Coefficient A
3.3.5.1. Coefficient A des feuilles globales F.A.I
3.3.5.2. Coefficient A des feuilles adultes F.A
3.3.5.3. Coefficient A des feuilles intermédiaires F.I
3.3.6. Résultas de Indice (Leaf Area Index) et la surface foliaire
3.3.6.1. Surface foliaire et indice foliaire des F.A.I
3.3.6.2. Surface foliaire et indice foliaire des F.A
3.3.6.3. Surface foliaire et indice foliaire des F.I
3.3.6.4. Surface foliaire et indice foliaire des F.J
3.4. Résultats du dosage de la chlorophylle
3.4.1. La chlorophylle a
3.4.2. La chlorophylle b
3.4.3. La chlorophylle a+b
3.4.3. La chlorophylle a/b
3.5. Résultats histologiques
3.5.1. Sans coloration
3.5.2 Avec coloration : Structure secondaire
4. Discussion
5. Conclusion
6. Perspectives
7. Références bibliographiques

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