Métabolisme général des acides gras 

Métabolisme général des acides gras 

Génotypage ou criblage des souris transgénique et vérification de l’intégrité du transgène

Le criblage est réalisé à partir d’ADN génomique. Un bout de queue des souriceaux âgés de 10 jours est digéré à la protéinase K (10 mg/ml, 50°C), centrifugé 10 minutes à 7800 g à température ambiante. Le surnageant est mis à incuber au bain sec 10 min à 95°C. L’ADN génomique ainsi obtenu est amplifié par PCR. Pour un volume final de 50 `L, 2 `L d’ADN sont mis en présence de 0,2 mM de dNTP, 2,5 mM de MgCl2, 0,3 mM d’amorces sens et antisens localisées dans la séquence du gène CAT et 0,04 U de Taq Polymérase (Promega, Charbonnières, France). Après une dénaturation préliminaire de 3 minutes à 94°C, l’amplification est réalisée sur 30 cycles (30 sec à 94°C, 45 sec à 55°C, 45 sec à 72°C) puis se termine par une élongation de 7 minutes à 72°C. La taille des amplicons (438 pb) est ensuite vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5%.
L’intégrité du transgène peut être vérifiée lorsqu’une nouvelle lignée de souris transgéniques n’exprime pas le gène rapporteur au niveau musculaire.
La construction d’ADN génomique présente ~3 kb de promoteur de hUCP3, l’exon 1, le gène rapporteur CAT et un fragment d’ADN génomique d’intérêt. Chacune des 4 parties de cette construction est amplifiée par PCR grâce à des couples d’amorces positionnés au sein de celle-ci comme figuré sur la Figure 18. L’intégrité du fragment de transgenèse comportant A5 par exemple est vérifiée chez un animal pour chacune des trois lignées obtenues. Un animal transgénique pour le fragment A1 (fragment d’ADN génomique contenant A5) est pris comme témoin positif. Un animal non transgénique pour hUCP3 est utilisé comme témoin négatif. Pour un volume final de 50 `l, 2 `l d’ADN génomique sont mis en présence de 10 mM de dNTP, 25 mM de MgCl2, 10 `M d’amorces sens et antisens et 0,03U de Taq Polymérase (Promega, Charbonnières, France). Après une dénaturation préliminaire de 3 minutes à 94°C, l’amplification est réalisée sur 30 cycles (30 sec à 94°C, 45 sec à 58°C, 45 sec à 72°C) puis se termine par une élongation de 7 minutes à 72°C. La taille des amplicons pour chaque partie du transgène est ensuite vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5%.

Table des matières

INTRODUCTION 
PREMIERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 
Chapitre 1 : Métabolisme général des acides gras 
1- Présentation des acides gras et leurs différentes formes
2- Synthèse des acides gras
3- Devenir des acides gras
3.1- Transport des acides gras
3.2- Stockage adipocytaire des acides gras et sécrétion
3.3- Catabolisme des acides gras
Chapitre 2 : Les protéines découplantes
1- Historique et phylogénie
2- Etude générale des protéines découplantes
2.1- Organisation génomique
2.2- UCP1 et UCP2 : données structurales
3- Cas particulier d’UCP3
3.1- Données structurales
3.2- Régulation de l’expression d’UCP3
3.2.1- Arguments expérimentaux
3.2.2- Etude du promoteur humain UCP3
3.3- Fonctions d’UCP3
3.3.1- Expression tissulaire
3.3.2- UCP3 et activité thermogénique
3.3.3- UCP3 et la production de ROS
3.3.4- UCP3 et le métabolisme des acides gras
3.3.5- UCP3, obésité et diabète sucré de type 2
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE 
CHAPITRE 1 : MATERIEL ET METHODES 
1- Souris
2- Transgenèse
2.1- Déroulement
2.2- Constructions de transgenèse
2.3- Génotypage ou criblage des souris transgénique et vérification de l’intégrité du transgène
2.4- Analyse de l’expression du transgène
2.4.1- Analyse des niveaux d’ARN messagers par RT PCT quantitative en temps réel
2.4.2- Mesure de l’activité enzymatique de la protéine reportrice CAT
3- Protocoles expérimentaux
Etude 1 : Caractérisation de l’expression d’UCP3 dans les muscles squelettiques
Etude 2 : Manipulations nutritionnelles de jeûne chez l’adulte
Etude 3 : Manipulations nutritionnelles de sevrage chez le souriceau et la femelle lactante
4- Autres dosages réalisés
4.1- Dosage de l’ARNm de mUCP3
4.2- Dosages biochimiques
5- Statistiques
CHAPITRE 2 : INFLUENCE DE LA PRISE ALIMENTAIRE SUR L’EXPRESSION MUSCULAIRE DE UCP3 
Etude 1 : Caractérisation de l’expression d’UCP3 dans les muscles squelettiques
1- Résultats
1.1- Expression musculaire des différents fragments de transgenèse
1.2- Analyse informatique assistée du fragment A6
2- Discussion
2.1- Expression musculaire spécifique des fragments A, A1 et A6
2.2- Absence d’expression tissulaire de A5
2.3- Expression musculaire du transgène portant le fragment A6
Etude 2 : Régulation de l’expression d’UCP3 (murin ou gène CAT en totalité, 16 kb, ou en partie, fragments A ou A1) après une période de jeûne de 48 heures chez les souris adultes.
1- Résultats
1.1- Expression de mUCP3
1.1.1- Chez les animaux contrôles négatifs (animaux nourris)
1.1.2- Chez les animaux mis à jeun pendant 48 heures
1.2- Expression de l’ARNm de hUCP3 (totale, fragment de 16 kb) ou de la CAT (fragments A et A1)
1.3- Variations des concentrations plasmatiques des acides gras
1.4- Recherche de corrélations entre les concentrations plasmatiques d’acides gras et l’expression des ARNm d’UCP3
2- Discussion
2.1- Cas de l’expression des ARNm de mUCP3
2.2- Cas de l’ARNm de hUCP3 ou du gène rapporteur CAT
Etude 3 : Influence du sevrage sur l’expression de l’ARNm d’UCP3 chez les femelles lactantes et les souriceaux
1- Résultats
1.1- Cas des mères en lactation
1.1.1- Expression de l’ARNm de mUCP3
1.1.2- Expression de l’ARNm de CAT
1.1.3- Expression de la protéine CAT
1.1.4- Concentrations plasmatiques d’acides gras
1.2-Cas des souriceaux
1.2.1- Evolution pondérale et paramètres biochimiques plasmatiques
1.2.2- Expression d’UCP3 après un sevrage à 15 jours
1.2.3- Cas d’un sevrage réalisé à 20 jours
2- Discussion
2.1- Effets métaboliques du sevrage chez les femelles allaitantes
2.2- Effets métaboliques du sevrage chez les souriceaux
DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION 
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXE

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