Métabolisme de la levure Saccharomyces cerevisiae

Les levures sont des organismes unicellulaires appartenant au règne Fungi et à la division des Ascomycètes. A ce titre les levures sont donc des organismes eucaryotes, chimio-hétérotrophes et capables de se reproduire de façon asexuée (par bourgeonnement d’une forme haploïde) et sexuée (par conjugaison de deux génomes haploïdes pour former un organisme diploïde). Dans certaines conditions de carence l’organisme diploïde peut former des spores haploïdes susceptibles de germer.

La souche diploïde prototrophe CEN.PK 122 a été sélectionnée comme la souche de référence dans les études de génie génétique, de physiologie et de génie microbiologique lors du programme « Yeast as Cell Factory » (van Dijken et al., 2000). Les performances de cette souche en matière de croissance, d’efficacité de transformation, de capacité de sporulation et de production de protéines hétérologues ont en effet été jugées supérieures à celles des souches CBS8066, BAY.17 et X2180 utilisées auparavant. La souche CEN.PK 113-7D est une souche haploïde dérivée de CEN.PK 122.

Métabolisme de la levure Saccharomyces cerevisiae

Le comportement de la levure S. cerevisiae dépend des voies cataboliques empruntées et il est possible de distinguer trois types de métabolisme en fonction des conditions de mise en œuvre du micro-organisme : oxydatif, fermentaire et oxydo-réductif.

Métabolisme oxydatif

Le métabolisme oxydatif est mis en place en aérobiose et si la valeur du flux glycolytique n’excède pas une valeur seuil (correspondant à une vitesse spécifique de consommation de glucose d’environ 3 g glucose.gX-1.h-1) (Féria-Gervasio, 2008). Un métabolisme oxydatif peut donc être obtenu en culture aérobie de type fed-batch ou chemostat si le taux de croissance imposé n’excède pas une valeur seuil de l’ordre de 0.25-0.30 h-1. En métabolisme oxydatif l’oxygène est l’unique accepteur final d’électrons. La production d’énergie provient donc de la partie basse de la glycolyse, du cycle de Krebs et de la phosphorylation oxydative. Le bilan énergétique de la dégradation du glucose en métabolisme oxydatif est donné par l’Equation 1.

C6H12O6+ 6 O2 + P/O Pi + P/O ADP → 6 CO2 + P/O ATP + 6 H2O Equation 1

La balance redox est assurée par une ré -oxydation des co-facteurs NADH, H+ et FADH, H+ au niveau de la chaîne respiratoire. La biomasse, le CO2 et l’eau sont les seuls produits issus de la consommation de glucose et d’oxygène. Le rendement en biomasse est maximal et atteint 0.5 gX .gglucose-1 et le coefficient respiratoire est proche de 1 pour une croissance sur glucose (Verduyn et al., 1991).

Métabolisme fermentaire

Le métabolisme fermentaire pur est atteint en conditions d’anaérobiose. L’oxygène est absent et ne peut jouer le rôle d’accepteur final d’électrons. La production d’énergie provient donc de la partie basse de la glycolyse, du cycle de Krebs et de la production d’éthanol. Le bilan énergétique de la dégradation du glucose en métabolisme fermentaire est donné par l’Equation 2 (la contribution du cycle de Krebs à la production d’énergie est négligée).

C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP → 2 C2H6O + 2 CO2 + 2 ATP Equation 2

La production d’éthanol à partir de glucose est un procédé neutre du point de vue de la balance redox. La ré-oxydation des co-facteurs NADH,H+ et FADH,H+ générés par l’anabolisme est donc assurée par la synthèse de glycérol afin d’éviter un déséquilibre de la balance redox. Le flux de carbone à travers le TCA est nettement diminué par rapport au métabolisme oxydatif (Jouhten et al., 2008; Nissen et al., 1997; Pagliardini, 2010) mais tout de même présent pour des contraintes anaboliques. Les co-facteurs mitochondriaux NADH, H+ ne peuvent être ré-oxydés dans la mitochondrie et doivent emprunter des navettes de transport du pouvoir réducteur pour être oxydés dans le cytosol. En anaérobiose le cycle de Krebs est divisé en deux branches : une branche oxydative du citrate au succinyl CoA, une branche réductive de l’oxalo-acétate au succinate. Les co-facteurs FADH2 ne sont théoriquement pas générés par le cycle de Krebs dans cette configuration mais au contraire ré-oxydés par l’action de l’enzyme fumarate reductase (Camarasa, 2003) Le rendement en biomasse est diminué à environ 0.1 gX .gglucose-1 et des co-métabolites comme l’éthanol, le glycérol, l’acétate, le pyruvate et du succinate sont produits avec la biomasse et le CO2 (Verduyn et al., 1990) L’oxygène est également impliqué dans les réactions de synthèse d’acides gras et des stérols. En anaérobiose il faut donc apporter de l’ergostérol ou du tween pour que la synthèse de certaines de ces molécules puisse se produire (Visser et al., 1990) .

Métabolisme oxydo-réductif

Un métabolisme dit oxydo-réductif est caractérisé par la production d’éthanol en aérobiose, c’està-dire par un fonctionnement simultanée de la chaîne respiratoire et de la réaction de production d’éthanol. Un métabolisme oxydo-réductif est mis en place en aérobiose si la valeur du flux glycolytique dépasse une valeur seuil. L’oxygène et l’acétaldéhyde sont utilisés simultanément comme accepteurs d’électrons . La production d’énergie provient de la partie basse de la glycolyse, du cycle de Krebs et de la phosphorylation oxydative. Les cofacteurs réduits NADH, H+ et FADH, H+ sont ré-oxydés simultanément par la chaîne respiratoire et la production d’éthanol et éventuellement de glycérol. Le flux de carbone à travers le TCA est plus faible que celui observé en métabolisme oxydatif pur mais plus élevé que celui observé en métabolisme fermentaire (Frick and Wittmann, 2005; Gombert et al., 2001). La valeur du coefficient respiratoire est supérieure à l’unité. La valeur du rendement en biomasse est inférieure à celle observée en métabolisme oxydatif et comprise entre 0.10 et 0.16 gX.gglucose-1 pour des valeurs de coefficient respiratoire comprises entre 12 et 6 respectivement (Franzén, 2003). Le rendement de production de glycérol est plus faible que celui observé en anaérobie (Franzén, 2003).

Effet Crabtree

Répression catabolique
En 1929 Herbert Crabtree remarque que l’addition de glucose à une suspension de cellules tumorales de rat décroit leur activité respiratoire et augmente la production d’acide lactique (Crabtree, 1929). Par la suite l’effet Crabtree a été transposé à l’apparition de la fermentation alcoolique chez la levure et a été défini de deux façons (Alexander and Jeffries, 1990). Une définition phénoménologique de l’effet Crabtree est l’existence d’une production d’alcool en aérobiose. De façon mécanistique l’effet Crabtree est défini comme l’inhibition de la respiration cellulaire par l’activité glycolytique et de production d’éthanol. Ces deux définitions ne sont pas forcément équivalentes : une levure peut produire de l’éthanol en conditions aérobie sans que son activité de respiration soit inhibée par la fermentation (Alexander and Jeffries, 1990). La définition mécanistique de l’effet Crabtree recoupe donc partiellement la définition de l’effet glucose (Carlson, 1999; Gancedo, 1998). Le glucose est le substrat préférentiel de la levure S. cerevisiae et la présence d’une concentration non nulle en glucose a un impact négatif sur l’assimilation d’autres sucres et un impact positif sur l’assimilation du glucose, ce qui est défini comme l’effet glucose (Klein et al., 1998; Meijer et al., 1998). Cet effet glucose comprend i) un effet négatif ou positif du glucose sur la transcription de certains gènes cibles ii) une diminution / augmentation du turn-over des ARN de gènes cibles iii) une diminution / augmentation de l’efficacité de traduction de ces ARN iv) une diminution / augmentation du turn-over des peptides issus de la traduction de ces ARN v) une inhibition / stimulation ciblée de l’activité de ces peptides (Klein et al., 1998). La répression catabolique par le glucose correspond à un impact négatif du glucose sur l’expression de certains gènes et s’exerce via les trois premiers points. La répression catabolique par le glucose est donc comprise dans l’effet glucose (Klein et al., 1998). Les gènes dont l’expression est affectée négativement codent pour des peptides impliqués dans l’utilisation de sources de carbone alternatives au glucose (enzyme invertase codé par SUC2, gènes MALT codant pour un transporteur du maltose et MALS codant pour une enzyme d’hydrolyse du maltose), dans le cycle TCA (gène codant CIT1 pour l’enzyme citrate synthase) ou encore dans la chaîne respiratoire (gène QCR8 codant pour une sous-unité du cytochrome c) (Carlson, 1999; Gancedo, 1998; Klein et al., 1999; Van Maris et al., 2001).

La répression catabolique par le glucose est assurée par le biais de la protéine kinase Snf1 qui contrôle l’activation du répresseur Mig1p. En présence de glucose l’activité kinase de Snf1 n’est pas présente en raison de l’interaction entre les deux domaines RD et KD. Le facteur Mig1 est alors localisé dans le noyau et peut se fixer au niveau d’une séquence consensus sur le promoteur de certains gènes cibles de la répression catabolique par le glucose (Gancedo, 1998) et y recruter le complexe Ss16- Tup1 empêchant ainsi la transcription de ce gène (Carlson, 1999). Au contraire en absence de glucose le facteur Mig1 est phosphorylé par l’activité de Snf1 et passe alors dans le cytosol où il ne peut influer sur l’expression des gènes. Le signal à l’origine de l’activité kinase de Snf1 n’est toujours pas connu même si le rôle du ratio AMP : ATP (donc de la charge énergétique cellulaire) et de l’hexokinase PII (codée par HXK2) ont été souligné (Carlson, 1999). Le rôle de la protéine Mig1 peut être assuré également par la protéine Mig2p (Klein et al., 1999). Il est intéressant de noter que la protéine Mig1p peut exercer un double effet inhibiteur sur l’expression de gènes cibles : fixation sur le promoteur de ce gène et fixation sur le promoteur d’un gène codant pour un activateur de la transcription du gène cible (par exemple HAP4) (Klein et al., 1999).

Table des matières

Introduction
Contexte
Objectifs et stratégie
Présentation du manuscrit
1. Etat de l’art
1.1 Métabolisme de la levure Saccharomyces cerevisiae
1.1.1 Métabolisme oxydatif
1.1.2 Métabolisme fermentaire
1.1.3 Métabolisme oxydo-réductif
1.2 Effet Crabtree
1.2.1 Répression catabolique
1.2.2 Notion de capacité respiratoire limite
1.2.3 Essais d’identification d’une étape limitant la capacité oxydative
1.2.3.1 Chaîne respiratoire
1.2.3.2 Nœud du pyruvate et by-pass de la Pyruvate Déshydrogénase
1.2.4 Modulateurs globaux
1.2.4.1 Mig1 / Mig2
1.2.4.2 Hap4p
1.2.4.3 Modification de la balance redox cytosolique
1.2.4.4 Autres effecteurs de la transition respiro-fermentaire
1.2.5 Identification des paramètres caractéristiques du shift oxydo-fermentaire
1.3 Impact du dioxyde de carbone sur la physiologie de S. cerevisiae
1.3.1 Implication du dioxyde de carbone dans le métabolisme de S. cerevisiae
1.3.1.1 Anabolisme et catabolisme
1.3.1.2 Cas de l’enzyme Anhydrase carbonique
1.3.2 Effet inhibiteur du dioxyde de carbone
1.3.2.1 Métabolisme fermentaire
1.3.2.2 Métabolisme oxydo-fermentaire
1.3.2.3 Métabolisme oxydatif
1.3.2.4 Analyse transcriptomique de l’effet inhibiteur du dioxyde de carbone
1.3.3 Mécanismes d’action du dioxyde de carbone
1.3.3.1 Action sur le pH intracellulaire
1.3.3.2 Action sur la membrane plasmique
1.3.3.3 Action sur la synthèse ou l’activité d’enzymes
1.3.3.4 Effet d’action de masse
1.3 Transfert interphasiques du dioxyde de carbone en bioréacteur
1.3.2 Solubilité du dioxyde de carbone et de l’oxygène
1.3.3 Equilibres dynamiques du CO2 en phase liquide
1.3.4 Transfert biomasse / liquide
1.3.5 Nucléation
1.3.6 Transfert liquide / gaz
1.3.6.1 Cas général
1.3.6.2 Facteurs influençant le KLa
1.3.6.3 Analyse de l’impact de la puissance dissipée
1.3.6.3.1 Sur le coefficient de transfert dans le film liquide kl
1.3.6.3.2 Sur l’aire interfaciale / sur la dispersion gaz liquide
1.3.6.4 Influence de l’accélération : chimique ou biologique
1.3.7 Transfert liquide / gaz du CO2
1.3.7.1 Analogie avec le transfert gaz / liquide de l’oxygène
1.3.7.2 Etude du transfert interphasique du CO2 en l’absence de réaction biologique
1.3.7.3 Etude du transfert interphasique du CO2 lors de cultures microbiennes
1.3.7.4 Accélération du transfert interphasique du dioxyde de carbone
1.3.7.4.1 Accélération chimique
1.3.7.4.2 Accélération biologique
1.4 Détermination du cadre de l’étude et de la problématique scientifique
2. Matériel et méthodes
2.1 Souche et milieux de culture
2.1.1 Souche utilisée
2.1.2 Milieux de culture
2.1.2.1 Milieux riches
2.1.2.2 Milieux synthétiques
2.1.2.2.1 Culture discontinue alimentée
2.1.2.2.1.1 Milieu salin initial
2.1.2.2.1.2 Milieu salin d’alimentation
2.1.2.2.1.3 Solution de vitamines
2.1.2.2.2 Culture continue
2.1.2.2.2.1 Définition du milieu de culture
2.1.2.2.2.2 Assemblage des milieux
2.2 Mise en œuvre des cultures
2.2.1 Conservation des souches
2.2.2 Chaîne de propagation
2.2.2.1 Culture discontinue alimentée
2.2.2.2 Culture continue
2.2.3 Cultures en fermenteurs
2.2.3.1 Culture discontinue alimentée
2.2.3.1.1 Description du dispositif expérimental
2.2.3.1.2 Conduite de culture
2.2.3.1.3 Description du dispositif expérimental
2.2.3.1.4 Conduite de culture
2.3 Techniques analytiques
2.3.1 Stratégie d’échantillonnage
2.3.2 Analyse de la phase biomasse
2.3.2.1 Détermination de la concentration en biomasse
2.3.2.1.1 Méthode turbidimétrique
2.3.2.1.2 Méthode gravimétrique
2.3.2.2 Détermination de la composition élémentaire en biomasse
2.3.2.3 Détermination de la teneur intracellulaire en sucres de réserve
2.3.2.4 Thermogravimétrie
2.3.3 Analyse de la phase liquide
2.3.3.1 H.P.L.C
2.3.3.2 G.C
2.3.3.3 Y.S.I
2.3.3.4 Kits enzymatiques
2.3.3.4.1 Glucose
2.3.3.4.2 Acétate
2.3.3.4.3 Ethanol
2.3.3.5 ICP-MS
2.3.4 Paramètres physico-chimiques et rhéologiques
2.3.4.1 Viscosité dynamique
2.3.4.2 Tension de surface
2.3.4.3 Masse volumique
2.3.5 Mesure de la puissance dissipée
2.3.6 Capteurs à CO2 dissous
2.3.7 Analyse des gaz
2.4 Traitement des résultats
2.4.1 Traitement
2.4.1.1 Définition du système considéré
2.4.1.2 Calcul du débit gazeux de sortie
2.4.1.3 Calcul de la vitesse de consommation d’oxygène
2.4.1.4 Calcul de la vitesse de production de dioxyde de carbone
2.4.1.5 Calcul du coefficient respiratoire
2.4.2 Calcul des vitesses pour les composés en solution
2.4.3 Lissage et réconciliation des données
2.4.4 Bilans molaires et élémentaires
2.4.4.1 Généralités
2.4.4.2 Bilan carbone
2.4.4.3 Bilan redox
2.4.5 Modélisation métabolique
3. Etude du transfert croisé O2 / CO2 en conditions de culture microbienne intensive
3.1 Introduction
3.2 Développement des modèles
3.2.1 O2 and CO2 mass transfer model
3.2.2 Bubble Size Distribution (BSD) model
3.3 Publication
3.3.1 Abstract
3.3.2 Introduction
3.3.3 Material and methods
3.3.3.1 Reactor setup
3.3.3.2 On-line measurements
3.3.3.3 Analytical methods
3.3.3.4 Micro-organism and media
3.3.3.5 Culture strategy
3.3.3.6 Calculation of O2 gas / liquide volumetric transfer coefficient
3.3.4 Results
3.3.4.1 Mass transfer model
3.3.4.2 S. cerevisiae fed-batch culture
3.3.4.3 O2 gas / liquid and CO2 liquid / gas transfer
3.3.5 Discussion
3.3.5.1 Bubble size distribution
3.3.5.2 Bubble Size Distribution parameter estimation during the culture
3.3.6 Conclusion
3.4 Récapitulatif des résultats
4. Etude de la réponse à court-terme et à long-terme de S. cerevisiae à des incréments de la concentration en dioxyde de carbone dissous
4.1 Introduction
4.2 Publication
4.2.1 Abstract
4.2.2 Introduction
4.2.3 Material and methods
4.2.3.1 Reactor setup
4.2.3.2 On-line measurements
4.2.3.3 Analytical procedures
4.2.3.4 Microorganism and media
4.2.3.5 Rate calculation, mass balances and metabolic model
4.2.3.6 Chemostat and CO2 step-increases experiments
4.2.4 Results
4.2.4.1 Steady-state characteristics
4.2.4.2 Short-term response to a single step-increase of the CO2, l concentration
4.2.4.3 Short-term responses to repeated step-increases of CO2, l concentration
4.2.5 Discussion
4.2.5.1 Long-term response to a CO2 shift-up
4.2.5.2 Short-term responses to step-increases of CO2,l concentration
4.2.5.3 Acquisition of resistance to high CO2 concentration
4.2.6 Conclusion
4.3 Impact of CO2 on the intracellular pH
4.4 Oscillatory behavior of the yeast transient response to CO2
4.6 Récapitulatif des résultats
5. Etude de l’impact du dioxyde de carbone sur la transition respiro-fermentaire chez S. cerevisiae
5.1 Introduction
5.2 Publication
5.2.1 Abstract
5.2.2 Introduction
5.2.3 Material and methods
5.2.3.1 Reactor setup
5.2.3.2 On-line measurements
5.2.3.3 Analytical procedures
5.2.3.4 Micro-organism and media
5.2.3.5 Rate calculation, mass balances and metabolic model
5.2.3.6 Chemostat and accelerostat
5.2.4 Results
5.2.4.1 Steady-states
5.2.4.2 Accelerostat without CO2 enrichment
5.2.4.3 Accelerostat with CO2 enrichment
5.2.5 Discussion
5.2.5.1 High dissolved CO2 concentration impacted the cellular adaptability
5.2.5.2 CO2 impacted the yeast energetics
5.2.5.3 CO2 created an osmotic stress
5.2.5.4 impacted the critical dilution rate
5.2.6 Conclusion
5.3 Récapitulatif des résultats
6. Discussion générale
Conclusion

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