Mesure de solubilité du β-carotène dans le Labrafac par dosage spectroscopique

Intérêt des nanomédecines pour une administration orale

C’est dans le but de compenser ces limites que les nanoformulations sont développées. En effet, les nanoformulations ont des propriétés physicochimiques différentes des médicaments conventionnels, leurs conférant de nombreux avantages.(29) Premièrement, une encapsulation du principe actif le protège de la dégradation prématurée due d’une part à l’acidité du milieu gastro-intestinal et d’autre part à son activité enzymatique.(23) Si les principales limites à une administration orale d’un principe actif sont un défaut de solubilité ou de perméabilité, les nanoformulations, en présentant ce dernier sous forme finement dispersé, améliorent grandement sa cinétique de dissolution et favorisent son absorption par la muqueuse intestinale.
De plus le principe actif peut ensuite être libéré de manière contrôlée aussi bien sur un plan spatial (par ciblage) que temporel (action prolongée).(23) En effet, les nanovecteurs permettent un transport efficace à travers les capillaires et l’endothélium lymphatique, une durée de circulation plus longue ainsi qu’une plus haute concentration. Ils sont également capables de se lier aux composés endogènes, comme les protéines. Ils peuvent entrainer une plus forte accumulation dans les tissus cibles, tout en réduisant le risque d’inflammation, de réponse immunitaire et le stress oxydatif dans les tissus. Les nanoformulations impactent positivement les propriétés pharmacocinétiques des principes actifs. Ils permettent également une meilleure biodisponibilité ainsi qu’une demi-vie plus longue, permettant une diminution de la fréquence d’administration et/ou de la dose. Ils offrent une meilleure biocompatibilité ainsi qu’une meilleure sécurité. Il en découle alors une diminution de la toxicité. Les nanovecteurs peuvent permettre un développement plus rapide de nouveaux médicaments, avec de larges gammes thérapeutiques.
La classification BCS (Biopharmaceutics Classification Systems), créée en 1995, range les molécules dans 4 catégories selon leur solubilité aqueuse et leur perméabilité membranaire (Figure 1). Une molécule à la fois hautement perméable (dont la fraction absorbée est ≥ à 90%) et hautement soluble appartient à la classe I, en revanche elle appartient à la classe II si elle n’est que faiblement soluble. Une molécule peu perméable (dont la fraction absorbée est inférieure à 90%) fait partie de la classe III si sa solubilité est élevée ou de la classe IV si cette dernière est faible. (30)
Les nanoformulations pour une administration orale trouvent un intérêt essentiellement pour les principes actifs de classe II et IV de la classification BCS. Ces nanoformulations améliorent la solubilité apparente du principe actif, le protège en cas de fragilité et augmente l’internalisation dans les entérocytes.

Les milieux biomimétiques

Pour la continuité du développement des nanomédecines, il est nécessaire de s’assurer de leur stabilité. Pour cela, des milieux biomimétiques sont utilisés, avec pour objectif de reproduire les conditions que le nanomédicament rencontrera lors de son administration.(22) Ces études de stabilité consistent en la mise en contact de la nanoformulation avec des milieux reproduisant le plus fidèlement possible la physiologie des états à jeun et nourri. Ainsi, pour affirmer d’une bonne stabilité, la taille moyenne ainsi que l’indice de polydispersité ne doivent pas évoluer de manière significative sur des cinétiques pouvant aller jusqu’à 6 heures. L’analyse de la taille et de l’indice de polydispersité peut se faire par diffusion dynamique de la lumière (DLS pour Dynamic Light Scattering). Il est également nécessaire de vérifier la charge en principe actif qui doit rester de l’ordre de 90% de la charge initiale.(22) La principale difficulté de ces analyses réside dans le fait que les milieux biomimétiques utilisés contiennent des nano-objets de types micelles. Les micelles sont le produit de l’autoassemblage de molécules amphiphiles en des agrégats sphériques pour former une dispersion colloïdale.(36) Il est nécessaire d’être capable de différencier les NCLs des autres nano-objets présents afin d’en assurer le suivi. C’est pourquoi les parties suivantes consistent en une analyse bibliographique de la composition des milieux choisis ainsi qu’à leur caractérisation.
Il existe plusieurs catégories de milieux biomimétiques : le niveau 0 tient compte uniquement du pH ; le niveau 1 considère la capacité tampon et distingue les états à jeun et nourri ; le niveau 2 prend également en compte les composants biliaires et lipidiques et certains produits de digestion ; enfin, le niveau 3 prend en compte la présence de protéines et d’enzymes ainsi que la viscosité.(37),(38) Les niveaux 0 et 1 sont surtout utiles pour les produits hydrophiles, avec une forte solubilité et essentiellement pour des essais de dissolution. Cela s’explique par le fait que les sels biliaires n’ont qu’un faible impact sur la dissolution des composés hydrophiles. Les milieux de niveau 2 sont pertinents pour les composés faiblement solubles, et pour des modélisations de pharmacocinétique basées sur la physiologie. Ils sont utiles essentiellement pour les molécules lipophiles et pour les administrations en postprandial. Les milieux de niveau 3 trouvent un intérêt dans les formulations à base de lipides pouvant subir une digestion même à l’état à jeun.(38)
Le choix du milieu est essentiel car il impact la lipolyse. Les formulations lipidiques sont particulièrement sensibles aux sels biliaires et à la pancréatine (aux enzymes pancréatiques).(37)
A l’heure actuelle, il existe 4 milieux disposant d’une bonne représentativité des liquides gastriques et intestinaux : le milieu gastrique à jeun ou FaSSGF (fasted state simulated gastric fluid), le milieu gastrique nourri ou FeSSGF (fed state simulated gastric fluid), le milieu intestinal à jeun ou FaSSIF (fasted state simulated intestinal fluid) ainsi que le milieu intestinal nourri ou FeSSIF (fed state simulated intestinal fluid).
Si ces milieux sont continuellement mis à jour en fonction des données physiologiques, ils restent toutefois simplifiés. En effet, ils ne comportent qu’un seul sel biliaire, le taurocholate de sodium, et de la lécithine représentant l’ensemble des phospholipides.
Ces composants sont présents dans le FaSSIF et le FeSSIF à faible ou forte concentration respectivement pour un meilleur reflet des conditions à jeun ou nourri.

Le FaSSGF

Le milieu le plus simple utilisé est le SGF (pour simulated gastric fluid). Il s’agit d’une solution chlorhydrique, dont le pH est de 1,2 (inférieure à la valeur physiologique). Il peut contenir de la pepsine à hauteur de 3,2 mg/mL. Par la suite, ce milieu a été amélioré par l’ajout de tensioactifs synthétiques, notamment du lauryl sulfate de sodium(44) ou du Triton-X(45). Cela a permis de réduire la tension interfaciale du milieu et de se rapprocher des valeurs physiologiques.
Cependant, le SGF n’est pas assez représentatif des conditions physiologiques, par manque de certaines substances présentes en conditions physiologiques ou présentes à des concentrations non cohérentes comme la pepsine, impactant la dissolution, présente à 3,2 mg/mL dans le SGF et réduite à 0,1 mg/mL dans le FaSSGF. De plus, ils contiennent des tensioactifs artificiels, non physiologique s.(25)
Ce milieu est donc considéré comme surévaluant la solubilisation du milieu gastrique.(40) Il y a donc un objectif de créer un milieu reflétant plus fidèlement la physiologie.
Le FaSSGF a été développé par Vertzoni et al.(25) en 2005, en se basant sur des données physiologiques. Il en résulte un milieu de pH 1,6 avec des concentrationsphysiologiques de pepsine, de sels biliaires et de lécithine.(20)

Le FeSSGF

Pour simuler l’état nourri de l’estomac, le lait est utilisé comme milieu de dissolution.
La principale limite dans la simulation du milieu gastrique postprandial est son évolution tout au long du processus de digestion. L’une des solutions est d’ajouter périodiquement une solution acide de pepsine dans le lait. Il est également possible de développer plusieurs milieux, chacun correspondant à une période de la digestion, en l’occurrence tôt, intermédiaire et tardif. Il existe cependant un milieu , le FeSSGF, correspondant à l’étape intermédiaire, considéré comme le plus représentatif.(40) Le FeSSGF consiste en du lait avec un tampon blanc. Le pH est de 5,0, ajusté grâce à une solution de HCl 0,1N. Pour mimer plus précisément la digestion, il faut y ajouter, toutes les 15 minutes, une solution d’acide chlorhydrique contenant de la pepsine.

Le FaSSIF

Le premier milieu mimant l’intestin est le SIF (simulated intestinal fluid) dont le pH est de 6,8. Néanmoins il ne convient pas aux études de corrélation in vitro / in vivo notamment par l’absence de distinction entre l’état nourri et l’état à jeun et par conséquent l’absence de prise en compte de l’effet de l’alimentation sur le mécanisme d’absorption.
Le milieu FaSSIF, pour fasted state simulated intestinal fluid, est un milieu intestinal à jeun.(40) Son pH est de 6,5, il contient du taurocholate de sodium ainsi que des phospholipides. Par la suite, Jantratid et al.(40) ont mis à jour ce milieu en diminuant la lécithine de 0,75 mM à 0,2 mM et en remplaçant le tampon phosphate par un tampon maléate. L’osmolalité est également inférieure, en accord avec les données in vivo.
C’est de cette manière qu’est apparu le FaSSIF-V2.(20),(40)

Le FeSSIF

Tout comme les fluides gastriques, les fluides intestinaux changent de composition au fil de la digestion. Le FeSSIF a un pH de 5. Si la quantité de taurocholate de sodium et de phospholipides est supérieure dans le FeSSIF comparée au FaSSIF, leur ratio est identique (4:1).(20) Le milieu FeSSIF peut contenir de la pancréatine, de manière facultative, en association avec du CaCl2 (5 mM) afin de favoriser la lipolyse. Le processus de solubilisation est influencé par la présence de micelles mixtes et également par les produits de la lipolyse, à l’état nourri.(40) Le milieu FeSSIF contient des quantités de sels biliaires moindre qu’en in vivo. De plus il ne contient pas de produits de lipolyse, impliqués dans l’amélioration de la solubilité des molécules faiblement solubles.(40) Le milieu FeSSIF a été actualisé par Jantratid et al.(40) (FeSSIF-V2) avec notamment la présence de produits de lipolyse : le glyceryl monooléate et l’oléate de sodium, afin de complexifier le milieu et prendre en compte la digestion lipidique.Il est également possible d’ajouter de la lipase pancréatique afin de mimer la digestion lipidique.
Les fluides intestinaux ont une plus grande capacité de solubilisation du fait de la présence de tensioactif endogène. En effet, les fluides intestinaux sont constitués en majeur partie d’eau mais également de sels biliaires, de phospholipides, de cholestérol qui font d’eux des solutions colloïdales, structures optimisant l’absorption. Il y a plusieurs types d’agrégats formés par les sels biliaires : des structures colloïdales contenant uniquement des sels biliaires, des micelles mixtes avec des phospholipides ou encore leur intégration dans des vésicules. Ces différentes structures augmentent la solubilité des composés hydrophobes. Plusieurs auteurs se sont intéressés à la caractérisation de ces nano-objets.
Elvang et al.(28) se sont intéressés aux fluides intestinaux humains. Des analyses en diffusion de lumière laser à angle multiple (MALLS) ont montré la présence de 4 populations de nano-objets. Les populations les plus volumineuses sont de l’ordre de 50 et 200 nm. La plus petite fraction est, quant à elle, inférieure à 20 nm. Les analyses MALLS, couplées à des analyses par fractionnement d’écoulement de champ par écoulement asymétrique (A4F) sur le FaHIF (fasted human intestinal fluid) ont permis de repérer différentes conformations : des micelles de cholate, des micelles mixtes cholate et phospholipides et des vésicules de phospholipides.
En ce qui concerne le milieu FaSSIF, Elvang et al.(28) détectent des nanoparticules d’une taille entre 15 et 40 nm. Elles sont considérées comme étant probablement des micelles mixtes, c’est-à-dire composées de phospholipides et de taurocholate. Grâce à des analyses au microscope électronique, Clulow et al.(39) retrouvent également des micelles d’une quarantaine de nanomètres au sein du FaSSIF. Des analyses complémentaires en cryo-microscopie électronique à transmission (Cryo-TEM) et en SAXS (diffusion de rayons X aux petits angles) ont permis de confirmer la nature lipidique de ces particules. Enfin, les analyses DLS de Nielsen et al.(46) montrent des micelles au sein du FaSSIF d’une taille de l’ordre de 57,2 ± 2,2 nm. À la suite d’une variation du pH de ce milieu, dans un intervalle de 5 à 6,5, il n’en résulte aucune modification significative des tailles des micelles, avec une mesure de 54,7 ± 2,7 nm pour le milieu FaSSIF. Ces résultats indiquent que la taille moyenne des particules n’est pas affectée par une variation du pH.
Enfin, dans le cas du milieu FeSSIF, les fractogrammes obtenus en A4F réalisés par Elvang et al.(28) montrent la présence de 2 pics correspondant à 2 populations de particules, l’une autour de 30 à 70 nm et l’autre vers 90-210 nm. Le premier pic représenterait des micelles mixtes alors que le deuxième serait soit des micelles mixtes d’une plus grande taille, soit des vésicules de phospholipides. Cependant, ce même milieu analysé en Cryo-TEM ne laissait supposer la présence que d’une seule population de particules au sein du FeSSIF, en l’occurrence des micelles. Le groupe de particules plus larges, représentant les vésicules doit être présent en quantité significativement plus faible.
Les analyses DLS de Nielsen et al.(46) montrent que les micelles mixtes ont une taille de 5,8 nm (3 mesures) dans le milieu FeSSIF, soit près de 10 fois plus petites que dans le milieu FaSSIF. Cette différence de taille est liée à la concentration en monomère libre des sels biliaires, plus élevée dans le milieu FaSSIF. À la suite d’une variation du pH du milieu FeSSIF (entre 5 et 6,5), la taille des micelles est mesurée à 5,4 ± 0,5 nm. Tout comme pour le FaSSIF, la taille moyenne des particules est indépendante du pH et n’est liée qu’à la concentration en phospholipides et sels biliaires du milieu. Des analyses en SAXS sur le FeSSIF ont montré que des micelles sont formées ainsi que des agrégats plus larges, probablement des vésicules bicouches. Au sein du FeSSIF-V2, la lécithine ayant été remplacée par de l’oléate de glycéryl et de l’oléate de sodium, mimant la digestion des lipides. Cela aboutit au gonflement des micelles.(39)

Les nanoémulsions et les nanocapsules lipidiques

Les nanoémulsions : généralités

Les émulsions sont des systèmes liquide/liquide composés d’au moins deux fluides non miscibles dont l’un, appelé la phase dispersée ou phase interne, est dispersé dans l’autre, qualifié de phase dispersante, continue ou externe. Plus précisément, Mc Clements et al.(47) définit une nanoémulsion (NE) huile dans eau comme « une dispersion colloïdale thermodynamiquement instable consistant en deux liquides immiscibles, avec un liquide dispersé en petites gouttelettes sphériques (rayon < 100 nm) dans l’autre liquide ». Les NEs sont d’aspect translucide.(48) Ce sont des systèmes instables. Toutefois, elles peuvent être stabilisées par des molécules dites amphiphiles, c’est-à-dire ayant à la fois une affinité pour l’eau et pour l’huile. Ces molécules vont pouvoir se placer aux interfaces entre les différentes phases dans le but de diminuer la tension interfaciale, et donc de réduire la quantité d’énergie à fournir pour la fragmentation de la phase dispersée.(13) C’est de ce rôle que provient leur nom de tensioactif.(49) Les tensioactifs auront aussi pour rôle de stabiliser les émulsions grâce à différents types de répulsions (électrostatiques ou stériques) entre les gouttelettes de phase dispersée.
Il convient de distinguer deux cas de figures, selon la nature de la phase dispersante : s’il s’agit de la phase aqueuse, alors nous parlerons d’émulsion directe ou émulsion huile dans eau, notée H/E(50). Dans le cas contraire, c’est une émulsion inverse ou émulsion eau dans huile, notée E/H.(49) Ces deux cas (E/H ou H/E) sont des émulsions dites simples, mais il existe également des émulsions dites multiples (par exemple H/E/H ou E/H/E), comme illustré dans la Figure 2.

Les nanocapsules lipidiques (NCLs)

Les NCLs sont des nanocapsules lipidiques. Elles possèdent un cœur huileux liquide et une coque de tensioactifs dynamiquement « bloquée ». Elles sont formulées selon un procédé d’inversion de phase.(60) Le cœur lipophile des NCLs formulées dans cette thèse contient du Labrafac WL1349 (mélange de triglycérides à chaines moyennes, acide caprique (C8) et caprylique (C10)). Elles comportent également deux tensioactifs non ioniques formant la coque : le Kolliphor HS15 tout d’abord, tensioactif hydrophile issu du mélange d’hydroxystéarate de macrogol 15 (70%) et de PEG 660 libre (30%) ; ainsi que du Span 80 (monooléate de sorbitane). Après formulation par inversion de phase en composition ou en température (procédés décrits dans le chapitre suivant), des NCLs dispersées en phase aqueuse composée d’eau ultra-pure sont obtenues. Dans le cas de l’inversion de phase en température, cette eau est enrichie en NaCl afin de permettre l’ajustement de la zone d’inversion de phase (notéeZIP, détaillée ultérieurement).(60) Ces NCLs sont représentées en Figure 3.

Inversion de phase en composition (PIC)

La PIC est l’inversion de phase en composition(51), aussi appelée inversion de phase catastrophique, terme introduit par Salager. Il s’agit d’un procédé d’émulsification basé sur le changement du ratio huile/eau du système.(80) Ce procédé peut être qualifié de catastrophique car il est explicable par la théorie des catastrophes de Dickinson.(51) Dans ce procédé, l’ajout de la phase aqueuse entraine une augmentation progressive de la phase interne, se traduisant au premier abord par une augmentation du nombre de gouttelettes, qui vont finalement coalescer et devenir la phase externe.
Plus en détails, le système passe par différents états au fur et à mesure de l’ajout d’eau. Lorsque la phase organique est faiblement enrichie en eau, alors une émulsion E/H se forme.
L’inversion de phase en composition passe par la formation d’une structure intermédiaire en phase éponge dont les courbures des monocouches de tensioactifs sont plus faibles que la ME surgonflée intermédiaire du procédé PIT. Par conséquent, dans le procédé PIC, une part plus importante des tensioactifs ne rentre pas dans la composition de la NE et forme des micelles.Il en résulte une NE ou des NCLs plus volumineuses et également plus polydisperses qu’avec le procédé PIT, malgré des ratios de co-tensioactif/tensioactif/huile équivalent. C’est toutefois un procédé facilement adaptable à l’échelle industrielle.
Le protocole PIC semble avoir un fort potentiel d’application industrielle. En effet, à grande échelle il est plus facile de réaliser une trempe d’eau que de varier la température. De plus, la méthode PIC peut être appliquée à divers type de tensioactifs, là où la PIT nécessite des tensioactifs non ioniques.

Table des matières
I. Introduction
II. Nanomédicaments : généralités
III. La voie orale 
1) Avantages et inconvénients de la voie orale
2) Composition et barrières du tractus gastro-intestinal
3) Intérêt des nanomédecines pour une administration orale
4) Les milieux biomimétiques
IV. Les nanoémulsions et les nanocapsules lipidiques 
1) Les nanoémulsions : généralités
2) Méthodes de formulation
3) Les nanocapsules lipidiques (NCLs)
V. Procédés basse énergie : les inversions de phase 
1) Inversions de phase
2) Généralités sur les microémulsions
3) Inversion de phase en température (PIT)
4) Inversion de phase en composition (PIC)
5) Approche Sub-PIT et Sup-PIC
VI. Méthodes de caractérisation
1) Diffusion dynamique de la lumière
2) Cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-TEM)
3) Diffusion des rayons X aux petits angles
4) Fractionnement d’écoulement de champ
5) Conductimétrie
6) Tensiométrie
7) Rhéologie
VII. Le bêta-carotène 
VIII. Matériels et méthodes 
1) Matériels
2) Mesure de solubilité du β-carotène dans le Labrafac ® par dosage spectroscopique
3) Mesure de fluorescence du β-carotène
4) Formulation des nanocapsules lipidiques
5) Mesure de taille par diffusion dynamique de la lumière (DLS)
6) Tensiométrie
7) Rhéologie
8) Conductimétrie
9) Préparation du milieu simulé FeSSIF
10) Séparation des NCLs du milieu FeSSIF
IX. Résultat 
1) Mesure de solubilité du β-carotène dans le Labrafac®
par dosage spectroscopique
2) Mesure de fluorescence
3) Formulation de nanocapsules lipidiques
4) Tensiométrie
5) Rhéologie
6) Conductimétrie
7) Séparation des NCLs du milieu FeSSIF
X. Discussion 
XI. Conclusion
Bibliographie
Table des Annexes

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