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Radical hydroxyle (OH⦁)
Selon Kunwar et al. (2011), ce radical est produit par la réaction du radical O2ꜙ avec le peroxyde d’hydrogène en présence du fer ou du cuivre.
Ainsi il est à l’origine de la majorité des phénomènes d’oxydation intermoléculaire observés dans l’organisme. En effet il est à l’origine de l’oxydation des lipides mono et poly insaturés membranaires. De même il peut se fixer de façon covalente soit aux bases azotées, soit sur le dèsoxyribose, sur les liaisons hydrogènes entre les brins d’ADN.
Radical nitroxyde ou monoxyde d’azote (NO)
Le NO est, tout comme le radical superoxyde, le point de départ d’une longue cascade de réactions oxydatives dans l’organisme (figure 1). Le NO est formé à partir de l’arginine (Arg) sous l’action de la Nitroxyde synthase (NOS). Il interagit avec l’anion superoxyde (O2ꜙ ) pour donner le peroxynitrite (ONOO-), composé extrêmement réactif et toxique.
CHOLESTEROL ET SES DERIVES, LES OXYSTEROLS
Définitions et structures
Cholestérol
Le cholestérol est un corps gras appartenant à la famille des stérols. C’est un métabolite essentiel pour la structure des membranes cellulaires où il forme avec les molécules de phospholipides, la partie intégrante de la bicouche lipidique (Spector et Yorek , 1985). Il représente 20 – 25 % des molécules lipidiques de la membrane des eucaryotes (Ikonen, 2008).
La molécule du cholestérol compte 27 atomes de carbone comprenant un noyau cyclopentanoperhydrophénanthrène constitué de 4 cycles désignés par les lettres A, B, C et D (voir figure 2).
Oxysterols
Les oxystérols ou hydroxyoxystérols sont des molécules d’origine biologique ou chimique, produites par oxydation ou hydroxylation du cholestérol. Ce sont des dérivés oxydés du cholestérol possédant comme lui 27 atomes de carbones et un noyau stérol. Certains d’entre eux sont cytotoxiques, mutagènes, athérogènes et éventuellement cancérogènes (Valenzuela et al., 2003 ; Souidi et al., 2004).
L’oxydation peut avoir lieu sur différents carbones (4, 5, 6, 7, 24, 25, 27) conduisant à une diversité de molécules (Figure 3). En plus de la fonction alcool en 3b, les oxystérols peuvent contenir des fonctions céto, époxy, alcool, hydroperoxy.
Ils sont le plus souvent issus d’une oxydation (Grandgirard et Cordelet, 1998) :
• en position 7 du stérol
• de la double liaison
• de la chaîne latérale
Ces oxystérols peuvent être formés au cours du traitement ou de stockage d’aliments contenant initialement du cholestérol (Bösinger et al., 1993).
Formation des oxysterols (Souidi et al. 2004)
Dans les conditions physiologiques normales, la majorité des oxystérols sont formés à partir du cholestérol sous l’action d’enzymes de type cytochrome P450. C’est le cas du 27- hydroxy-cholestérol, l’acide 3β-Oh-5-cholesténoique, 7α-hydroxycholestérol et 4β-hydrocholestérol (figure 4).
Cependant certains comme le 25 –hydroxycholestérol, peuvent être produits à la fois par voie enzymatique et par auto-oxydation du cholestérol. D’autres comme le 7-céto-cholestérol et le 7β-hydroxycholestérol ont une origine chimique presque exclusive.
Métabolisme des Oxystérols
Les Oxystérols circulant sont liés aux lipoprotéines ou à l’albumine. Ils sont rapidement épurés par le foie pour être transformés en acides biliaires, contribuant ainsi au maintien de l’homéostasie du cholestérol dans l’organisme (figure 5).
Oxydation du Cholestérol et des Oxystérols par la Cholestérol-Oxydase
Cholestérol oxydase (Heras et al., 2013)
C’est une enzyme isolée à partir de bactéries saprophytes du sol, Streptomyces sp, qui utilisent le cholestérol comme source nutritionnelle. Elle est aussi retrouvée chez certaines bactéries pathogènes comme le Rhodococcus equi, où elle semble jouer un rôle important concernant leur virulence. Les Cholestérol-oxydases encore appelées Alcool-oxydases existent sous 2 formes :
• Classe I : l’enzyme est étroitement liée mais de manière non covalente, au cofacteur FAD
• Classe II : l’enzyme est liée de manière covalente au cofacteur
Mode d’action de la cholestérol-oxydase
Comme nous l’avions évoqué plus haut, les cholestérol-oxydases (ChOx) sont des alcool-oxydases ayant comme cibles le groupement hydroxyle (OH) en position 3β. Elles sont donc capables d’oxyder aussi bien les oxystérols que le cholestérol car ayant en commun une fonction alcool en 3β. La ChOx catalyse la transformation de la fonction OH en position 3 du cholestérol et les oxystérols en fonction cétone (Neuvonen et al., 2014).
Cette réaction d’oxydation du cholestérol et des ces dérivés s’accompagne d’une production de peroxyde d’hydrogène en plus de la cétone produite. La quantité de peroxyde d’hydrogène ainsi formée, quantifiable en routine par la réaction de Trinder. Cette dernière produit une coloration rose dont l’intensité est proportionnelle au taux de cholestérol ou des oxystérols de départ.
Mesure de l’absorbance de l’oxydation du cholestérol sans la Vitamine C (A0 )
Le protocole du kit de cholestérol a été utilisé (Voir annexe 1). A 20 μl d’une solution standard de Cholestérol dosé à 2 mg/ml, on ajoute 2 ml de réactif de cholestérol oxydase. Le tout est incubé pendant 10 mn à la température ambiante avant de mesurer l’absorbance à 505 nm. Trois essais ont été effectués (n = 3).
Mesure de l’absorbance de l’oxydation du cholestérol en présence de la Vitamine C (A1 )
Recherche d’activité de la vitamine C en fonction de la concentration
Pour déterminer la dose maximale efficace, l’activité antioxydante de la Vitamine C sur le cholestérol a été évaluée à différentes concentrations (2 mg/ml ; 1 mg/ml ; 0,5 mg/ml ; 0,250 mg/ml). Le protocole utilisé est mentionné dans le tableau I. Pour chaque concentration, trois essais ont été réalisés.
Evaluation de l’effet de dilution de la solution de Vitamine C
Un test visant à évaluer si l’ajout de la solution de la Vitamine C pourrait entrainer un effet de dilution du milieu réactif a été par la suite réalisé. Pour cela deux types d’essais ont été effectués.
Essai 1 : 20 μl de cholestérol + 20 μl d’une solution de 2 mg/ml de Vit C. Apres 10 mn d’incubation à la température ambiante, on ajoute 1980 μl de réactif de Cholestérol oxydase puis on incube à nouveau le tout pendant 10 mn avant de mesurer les absorbances.
Essai 2 : 20 μl de cholestérol standard + 20 μl d’une solution de 2 mg/ml de Vit C. Apres 10 mn d’incubation à la température ambiante, on ajoute 2 ml de réactif de Cholestérol oxydase puis on incube pendant 10 mn avant de mesurer les absorbances. Chaque essai a été répété trois fois (n =3).
Détermination des temps d’incubation de la vitamine C et de stabilité de la coloration
Quatre types d’essais ont été effectués
Tube 1 : 20 μl de la solution de cholestérol à 2 mg/ml + 20 μl d’une solution de 2mg/ml de Vitamine C. On ajoute par la suite immédiatement 1980 μl de réactif de Cholestérol oxydase puis on incube le tout pendant 10 mn à la température ambiante avant de mesurer les absorbances à 505 nm.
Tube 2 : Cette fois ci on incube d’abord pendant 10 mn les solutions de cholestérol et la Vitamine C. Puis on ajoute le réactif et le tout incubé à nouveau pendant 10 mn.
Tube 3 : idem que le Tube 2, mais la deuxième incubation va être allongée à 25 mn avant la lecture.
Tube 4 : cette fois ci on allonge la deuxième incubation à 40 mn avant la lecture.
DISCUSSION
L’objectif de cette étude était de mettre en place une méthode simple d’évaluation de l’activité antioxydante réelle d’un produit naturel en utilisant le cholestérol comme substrat.
Le cholestérol est actuellement dosé dans la totalité des laboratoires d’analyses médicales par des méthodes enzymatiques, parmi lesquelles celles utilisant une estérase et une oxydase reste les plus fréquentes avec 99,6% des techniques employées (Durand et Beaudeux, 2008). Le kit de réactif utilisé, du laboratoire BioSystem, contient une solution standard de cholestérol prés à l’emploi. Cette dernière dosée à 2 mg/ml a été utilisée comme solution mère, ce qui pourrait limiter les marges d’erreur liées à la préparation d’une solution de cholestérol. En outre l’étalon est également sous forme de solution aqueuse, ce qui contribuerait à faciliter la dilution de cette dernière avec de l’eau physiologique afin d’obtenir les concentrations souhaitées. Car selon certains auteurs deux solutions ont tendance à mieux se dissoudre si elles ont la même polarité (Bassene, 2012 ; Akanni et al., 2014 ; Fall et al., 2015 ; Sarr et al., 2015).
Comparée à la moyenne de l’absorbance A0 , (0,357 ±0,023), les tests d’incubation montre que le tube 1, où il y’a pas eu de temps d’incubation entre le cholestérol et la vitamine C, donne une valeur environ égale A0 . Alors que dans le tube 2 ou y’a eu d’abord 10 mn d’incubation entre les deux, on note une forte diminution statistiquement significative de l’absorbance (0,047) par rapport à A0. Ces deux essais montrent que l’action de la Vitamine C sur le cholestérol n’est pas immédiate, au contraire cela nécessite un certain temps de contact avant de faire réagir la cholestérol-oxydase.
Concernant la stabilité de l’intensité de la coloration, on a constaté qu’après 25 mn d’incubation on a une faible diminution de l’absorbance qui passe de 0,047 à 0,043.
Par contre après 40 mn d’incubation, la diminution est plus forte (de 0,047 à 0,035) avec une différence significative. Ce qui laisse supposer que la coloration est stable entre 10 et 20 mn à la température ambiante.
Donc une lecture des absorbances après 25 mn d’incubation pourrait conduire à des valeurs faussement diminuées non liées l’activité du produit testé. Ceci est bien conforme aux protocoles du catalogue français (2014) et Scalabrini (2015) qui fixent le temps de stabilité de la coloration entre 10-30 mn.
Une différence des moyennes des absorbances a été notée lors des essais de dilutions. En effet ces tests avaient pour but de vérifier si la modification du rapport volume échantillon / milieu réactionnel du protocole original du kit, par ajout du volume de la vitamine C, provoquerait un effet de dilution du milieu.
Ainsi les résultats obtenus ont montré qu’il y’a une légère diminution de l’absorbance mais statistiquement significative entre les deux essais avec respectivement 0,042 ± 0,001 pour l’essai 1 contre 0,039 ± 0,001 pour l’essai 2. Ce qui laisse supposer qu’il y aura un effet dilution, même si c’est faible, si on ne respecte pas le rapport volume échantillon / milieu réactionnel défini dans le protocole du kit qui est d’environ 1/100.
La capacité de l’antiradicalaire naturel à inhiber l’oxydation du cholestérol en fonction de la concentration a été aussi recherchée.
Les résultats obtenus montrent que la vitamine C inhibe de façon concentration dépendante l’oxydation du cholestérol. Ainsi à la plus faible concentration 0,250 mg/ml on note une PI égale à 42,11 % ± 0,98 contre 88,24 % ± 0,28 pour la plus forte concentration testée.
Par rapport à A0, elle inhibe de façon significative à toutes les concentrations testées avec p < 0,001. De même, la différence est également significative (p < 0,001) en comparant les valeurs des pourcentages d’inhibitions entre elles à toutes les concentrations testées (voir annexe 3). Ceci confirme que l’activité de la vitamine C sur le Cholestérol est concentration dépendante.
Comparer au test de blanchissement de β-carotène ou d’oxydation de l’acide linoléique de Tepe et al. (2006) et au test d’inhibition de la peroxydation de l’acide linoléique de Bidie et al. (2011), ce test d’inhibition de l’oxydation du cholestérol reste le plus simple, le plus rapide à réaliser, le moins couteux et demande moins de réactifs. Vu le comportement prometteux de la référence utilisée, nous penssons que cette méthode pourrait être une alternative des méthodes usuelles citées ci-dessus, pour la recherche in vitro d’activité antioxydante des produits naturels ayant une activité antiradicalaire.
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Table des matières
PREMIERE PARTIE : RAPPELS SUR STRESS OXYDATIF ET OXYDATION DU CHOLESTEROL ET sES DERIVES
CHAPITRE I : GENERALITES SUR LE STRESS OXYDATIF
I. Radicaux libres
I.1. Définition
I.2. Radical superoxyde (O2ꜙ)
I.3. Radical hydroxyle (OH⦁)
I.4. Radical nitroxyde ou monoxyde d’azote (NO)
II. Conséquences
CHAPITRE II : CHOLESTEROL ET SES DERIVES, LES OXYSTEROLS
I. Définitions et structures
I.1. Cholestérol
I.2. Oxysterols
II. Formation des oxysterols (Souidi et al. 2004)
III. Métabolisme des Oxystérols
IV. Oxydation du Cholestérol et des Oxystérols par la Cholestérol-Oxydase
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
CHAPITRE I : MATERIEL ET METHODES
I. Matériel
I.1. Matériel de laboratoire
I.2. Réactifs
II. Méthode d’étude
II.1. Principe
II.2. Mesure de l’absorbance de l’oxydation du cholestérol sans la Vitamine C (A0 )
II.3. Mesure de l’absorbance de l’oxydation du cholestérol en présence de la Vitamine C (A1 )
II.4. Expression de résultats et analyse statistique
CHAPITRE II : RESULTATS
I. Mesure de l’absorbance l’oxydation du cholesterol sans la vitamine c (A0)
II. Recherche d’activité de la vitamine C en fonction de la concentration
III. Evaluation de l’effet de dilution de la solution de vitamine C
IV. Tests de détermination des temps d’incubation et de stabilité de la coloration
CHAPITRE III : DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRPHIQUES
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