Soutenance mémoire
Mesure des signaux de courant et de tension
Avant de commencer les essais sur les bactéries, il est important de connaitre l’énergie et donc l’allure des signaux de courant et de tension délivrées par les deux générateurs. Pour la mesure de courant, un capteur de Rogowski est utilisé. Il est constitué d’une bobine sans noyau magnétique placée autour de la zone de passage du faisceau d’électrons ou du câble conduisant le courant vers le générateur de Marx dans le cas des décharges électriques. Le champ magnétique produit par le courant induit une tension dans la bobine qui est proportionnelle à la vitesse de variation du courant (dI/dt). La mesure de tension pour les faisceaux d’électrons se fait à l’aide d’un diviseur capacitif. Ce dernier utilise deux capacités, une de faible valeur (C1) et une de forte valeur (C2) permettant d’obtenir un bon rapport de division pour avoir une faible tension arrivant au niveau de l’oscilloscope.
Pour les décharges électriques, la mesure de tension s’effectue à l’aide d’un diviseur résistif. Le principe est le même que pour le diviseur capacitif mais il utilise des résistances pour diviser la tension. Pour le générateur de faisceau d’électrons, les mesures de courant et de tension sont notées Id et Ud, respectivement, sur la Figure 26. L’emplacement de ces diagnostiques est indiqué par les flèches.
Mesure de la dose délivrée par le faisceau d’électrons
Dans le cas de la technologie de faisceau d’électrons pulsés, une mesure de dose est effectuée afin d’évaluer l’énergie déposée lors du traitement. Les courtes impulsions et le fort courant délivré par l’équipement ne permettent pas d’employer n’importe quel moyen de dosimétrie. Des dosimètres, dits radiochromiques, ont été choisis. Le principe est que les électrons, en déposant de l’énergie dans la matière constituant les films dosimétriques, vont créer un phénomène de réticulation. Le nombre de liaisons engendrées est proportionnel à la dose. Dans le cas de cette étude, les dosimètres DOSE READER DR 020 (Crosslinking®) ont été choisis. Les films sont constitués de polyvinylbutyral (PVB) avec du cyanure de pararosaniline qui réagit aux radiations et change la couleur des films en rose. Un spectromètre (Dose reader DR020, Crosslinking®) avec une émission dans le rouge à 635 nm et dans le vert à 565 nm est utilisé pour lire la dose après un temps d’incubation de 20 min à 37°C.
Souches étudiées
Escherichia coli
La souche d’Escherichia coli est issue de la collection ATCC 29425 (LGC Standards). Elle est conservée à -80°C dans 30% de glycérol. A partir de cette solution commerciale, une fraction aliquote est prélevée avec un cône de P200 et diluée dans 10 mL de milieu LB (Luria-Bertani, Sigma) dans un Erlenmeyer de 125 mL. La suspension est cultivée pendant 16 h à 37°C sous agitation 200 rpm. Des dilutions jusqu’à 10⁻⁷ sont faites et étalées sur boites LB Ф94 mm (Greiner bio-one) afin d’obtenir des colonies bien séparées (environ 10 par boite). Les boites sont mises à incuber 16 h à 37°C, puis, conservées à 4°C.
Bacillus pumilus
La souche de Bacillus pumilus est issue de la collection ATCC 27142 (LGC Standards) et se présente sous forme de spores. Elle est conservée à -80°C dans 15% de glycérol. A partir de cette solution commerciale, une fraction aliquote est prélevée avec un cône de P200 et diluée dans 10 mL de milieu LB dans un Erlenmeyer de 125 mL. La suspension est cultivée pendant 16 h à 37°C sous agitation 200 rpm. Des dilutions jusqu’à 10⁻⁷ sont faites et étalées sur boites LB afin d’obtenir des colonies bien séparées (environ 10 par boite). Les boites sont mises à incuber 16 h à 37°C, puis, conservées à 4°C.
Préparation des suspensions bactériennes
Les formes végétatives sont obtenues grâce à l’ensemencement d’une colonie dans 10 mL de milieu LB (Sigma) liquide sans antibiotique. La solution est mise sous agitation à 37°C et 200 rpm pendant 16 h dans un Erlenmeyer de 125 mL. Cette culture est ensuite concentrée 10 fois par centrifugation à 10 000 g pendant 5 min, puis, placée à 4°C jusqu’à son utilisation. Pour la préparation des spores, une colonie de Bacillus pumilus est cultivée dans 400 mL de milieu, Difco Sporulation Medium (DSM) qui favorise le processus de sporulation. Les conditions d’incubation sont de 5 jours dans un Erlenmeyer de 2 L et à 37°C et 200 rpm. Les bactéries végétatives résiduelles sont éliminées par choc thermique à 80°C pendant 20 min. La solution de spores est centrifugée à 10 000 g pendant 5 min. Après élimination du surnageant, le culot est repris dans de l’eau distillée stérile et la suspension conservée à 4°C jusqu’à son utilisation. Avant toute utilisation, la suspension est soumise de nouveau au choc thermique à 80°C pendant 10 min.
Caractérisation des souches
Courbe de croissance des bactéries
Les 100 µL de la suspension bactérienne préparée précédemment sont cultivés dans 200 mL de milieu LB et mis sous agitation à 37°C dans un Erlenmeyer de 500 mL. Une mesure de la DO600 nm est effectuée toutes les 30 min jusqu’à atteindre la phase stationnaire. La vitesse spécifique maximale de croissance, µxmax, est déterminée en traçant le logarithme népérien de la DO600 nm en fonction du temps (en heure). La valeur de la pente de la droite obtenue, au moment de la phase exponentielle de croissance, correspond à µxmax. Ensuite, la détermination du temps de génération, G, est obtenue via la formule suivante :
? = ln(2) / µmax
Germination des spores
Les 30 µL de la suspension de spores sont ajoutés à 900 µL de milieu LB à 37°C. La solution obtenue est mise dans une cuve à spectrophotomètre en PMMA (Brant®) placée à 37°C. Une mesure de DO580 nm est effectuée toutes les minutes avec un spectromètre Pharmacia Biotech, Novaspec II [133–135].
Evaluation de l’efficacité du traitement
Faisceau d’électrons
Deux types de tests sont effectués : en milieu gélosé et en milieu sec. Avant tout dépôt, les suspensions de spores de Bacillus pumilus sont incubées à 80°C pendant 10 min afin d’éliminer les formes végétatives résiduelles. Pour les tests en milieu gélosé (milieu Plate Count Agar (PCA) (norme UNE-EN ISO 4833 :2003, VWR Chemicals), 100 µL d’une suspension de Escherichia coli ou Bacillus pumilus (forme végétative et sporulée) sont étalés au centre de la boite avec un râteau stérile (Heathrow Scientific®). La taille du dépôt est de 4 cm par 9 cm. Le faisceau d’électrons n’étant pas homogène sur l’ensemble de la fenêtre, la largeur de l’étalement permet de s’assurer d’être dans cette zone. Pour les tests en milieu sec, sur des boites de Pétri stériles et vides de diamètre 90 mm (greiner bio-one), 3 spots de 10 µL de suspension de Bacillus pumilus sporulé sont déposés au centre. Les boites sont mises à sécher sous la hotte à flux laminaire.
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Table des matières
Chapitre 1. Introduction générale
1.1. Les bactéries
1.1.1. La forme végétative
1.1.2. La forme sporulée
1.1.3. Escherichia coli
1.1.4. Bacillus pumilus
1.2. Le faisceau d’électrons pulsés
1.2.1. Introduction
1.2.2. Principe d’un faisceau d’électrons
1.2.3. Effet sur les microorganismes
1.2.4. Effets sur les matériaux
1.2.5. Comparaison avec les autres technologies ionisantes
1.2.6. Présentation du dispositif expérimental
1.3. Les décharges électriques
1.3.1. Introduction
1.3.2. Principe des décharges électriques
1.3.3. Effets sur les microorganismes
1.3.4. Comparaison avec d’autres techniques utilisant des décharges électriques
1.3.5. Présentation du dispositif expérimental
1.4. Conclusion du chapitre
Chapitre 2. Matériels et méthodes
2.1. Mesure des signaux de courant et de tension
2.2. Mesure de la dose délivrée par le faisceau d’électrons
2.3. Souches étudiées
2.4. Préparation des suspensions bactériennes
2.5. Caractérisation des souches
2.6. Evaluation de l’efficacité du traitement
2.7. Evaluation de l’efficacité en fonction de la phase de croissance après traitement par faisceaux d’électrons
2.8. Evaluation de l’efficacité en fonction de l’état de la spore
2.9. Evaluation de la reprise de croissance après traitement des spores par faisceaux d’électrons
2.10. Préparation des échantillons pour l’AFM
2.11. Observation par MEB et MET
2.12. Evaluation de la perméabilisation de la membrane
2.13. Evaluation de l’intégrité de l’ADN génomique
2.14. Etude des protéines
2.15. Etudes statistiques
Chapitre 3. Étude des effets du faisceau d’électrons pulsés
3.1. Présentation de la problématique
3.2. Configuration des essais
3.3. Mesure des signaux de courant et de tension
3.4. Mesure de la pénétration du faisceau
3.5. Efficacité du traitement
3.5.1. Choix de la souche de référence
3.5.2. Etude de l’effet de différents paramètres
3.6. Détermination des mécanismes responsables de l’inactivation bactérienne
3.6.1. Etude des effets au niveau de la paroi bactérienne
3.6.2. Etude des effets au niveau de l’ADN
3.6.3. Etude des effets au niveau des protéines
Chapitre 4. Étude des effets des décharges électriques
4.1. Présentation de la problématique
4.2. Configuration des essais
4.3. Mesure des signaux de courant et de tension
4.4. Efficacité du traitement
4.4.1. Choix de la souche de référence
4.4.2. Etude de l’effet de différents paramètres
4.5. Détermination des mécanismes responsables de l’inactivation bactérienne
4.5.1. Etude des effets au niveau de la paroi bactérienne
4.5.2. Etude des effets au niveau de l’ADN
4.5.3. Etude des effets au niveau des protéines
Conclusions
