Membranes biologiques et translocation des toxines bactériennes

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Implications des P450s dans les évènements biologiques

Les P450s sont impliqués dans le métabolisme oxydatif, peroxydatif et réducteur de substrats endogènes comme les stéroïdes, les prostaglandines et les acides gras, mais aussi exogènes tels les polluants de l’environnement, les médicaments, les carcinogènes [22, 50].

Métabolisme des xénobiotiques

Plus de 200000 molécules chimiques peuvent être métabolisées par les P450s humains, catalysant plusieurs types de réactions différentes dont les oxydations, réductions, déshalogénations [73], désaturations, clivages d’esters, déshydratations… [48]
Chez les mammifères et les autres espèces animales, les P450s des familles CYP1, CYP2 et CYP3 catalysent les réactions de phase I du métabolisme de la majorité des composés exogènes auxquels est exposé l’organisme. Le foie est le principal organe où se trouvent ces enzymes chez les mammifères, même si une activité métabolique a déjà été décrite dans d’autres organes et tissus (intestin, sein, poumon, prostate, cerveau…).
Les P450s catalysent un très grand nombre de biotransformations, qui se différencient principalement par l’activité biologique éventuelle du métabolite obtenu [48]. Dans la plupart des cas, ce dernier n’a pas d’activité. Le substrat subit en effet une étape de fonctionnalisation, ce qui permettra aux enzymes de conjugaison de phase II d’augmenter l’hydrophilie du composé et de faciliter ainsi son élimination urinaire ou fécale. Il peut cependant arriver que le métabolite formé par action d’un P450 présente une activité biologique. Ainsi, le produit obtenu à la suite du métabolisme d’un composé par un P450 peut être toxique pour l’organisme, par activation de procarcinogènes ou formation de radicaux libres [45]. Les métabolites formés sont de nature électrophile et vont réagir avec des structures nucléophiles de l’organisme pour conduire à des réactions néfastes, réactions avec des protéines ou des lipides à l’origine de nécrose, ou avec des acides nucléiques à l’origine de mutations voire de cancers. Dans le tableau III sont présentés quelques exemples de réactions induites par les P450s pouvant générer la formation de métabolites toxiques.
Un autre aspect de la toxicité causée par les P450s est l’apparition d’effets indésirables lors d’interactions médicamenteuses. Par exemple, des torsades de pointes peuvent apparaître lorsque des inhibiteurs du CYP3A4 sont administrés avec le cisapride. De même, des rhabdomyolyses ont été associées à la coadministration de statines et d’inhibiteurs du CYP3A4 [29].
Les P450s sont donc impliqués dans des phénomènes de toxicité, mais la formation d’un métabolite présentant une activité biologique peut également être bénéfique dans le cas de l’activation d’une prodrogue en molécule active avec des propriétés thérapeutiques. C’est le cas par exemple de l’ifosfamide et du cyclophosphamide, des cytotoxiques alkylants faisant partie de la classe des moutardes à l’azote [115].
Les P450s ont également un rôle au niveau de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie des xénobiotiques et donc au niveau de leur impact clinique. La métabolisation par le P450 a en effet une influence sur la durée de vie du composé actif dans l’organisme et donc sur son activité thérapeutique. En effet, un composé métabolisé rapidement par le P450 en un métabolite inactif n’aura que peu de temps pour exercer son action au niveau de la cible thérapeutique puisque sa demi-vie sera considérablement diminuée. Par exemple, les dérivés de l’ergot de seigle ont un temps de demi-vie d’élimination très court. Ce sont les métabolites produits par action du CYP3A, possédant un temps de demi-vie plus long, qui sont actifs et responsables de l’activité sur plusieurs heures, notamment dans le traitement des migraines et des hypotensions orthostatiques.
De plus, des interactions médicamenteuses peuvent être bénéfiques voire recherchées. Certains inhibiteurs de protéases utilisés dans le traitement du VIH (Virus de l’Immunodéficience Humaine), comme le saquinavir ou l’indinavir, ont une faible biodisponibilité par voie orale qui est améliorée par l’administration concomitante de ritonavir. En effet, le ritonavir forme un complexe avec le fer du CYP3A qui est ainsi bloqué. L’inhibiteur de protéases, qui est donc beaucoup moins métabolisé, peut alors exercer son action thérapeutique [37]. De même, l’administration d’un inhibiteur du CYP3A4 avec la ciclosporine permet de réduire les doses et par conséquent le coût de l’immunosuppresseur [29].
Un paramètre important à considérer concernant l’action des P450s, et plus généralement en toxicologie, est la dose. Prenons l’exemple de la ciclosporine, médicament utilisé contre le rejet de greffe et dans le traitement de certaines maladies auto-immunes. Elle est métabolisée par le CYP3A4 en plusieurs métabolites oxygénés dont certains possèdent une activité pharmacologique. L’administration de cette molécule à faibles doses permet d’obtenir un effet thérapeutique immunosuppresseur. A forte dose, la ciclosporine devient néphrotoxique de façon dose-dépendante. De fortes concentrations peuvent être obtenues par exemple après une consommation excessive de jus de pamplemousse, inhibiteur du CYP3A4 [30].
Les P450s métabolisent des substrats de structure et taille très variées. Les différentes isoformes des CYP3A peuvent par exemple métaboliser un nombre important de substrats (plus de 300), de masse moléculaire très variée : de 190 Daltons pour la N-hydroxy-Arginine à 1200 Daltons pour la ciclosporine.

Métabolisme des substances endogènes

Chez les espèces animales, et les mammifères en particulier, les fonctions endogènes principales des P450s incluent la biosynthèse des stéroïdes, le métabolisme des prostaglandines et des acides gras, l’oxydation lipidique et l’hydrolyse de la vitamine D3. D’autres rôles endogènes ont été suggérés, notamment pour les P450s impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques. Ainsi, le CYP1A1 a un rôle dans le catabolisme de l’hème, le CYP1A2 dans le métabolisme de l’estradiol, les CYP2A, 2B, 2C et 3A dans le métabolisme de la testostérone, le CYP2D dans le métabolisme des catécholamines et le CYP2E dans la néoglucogenèse [73].
Les P450s responsables de la biosynthèse des stéroïdes par exemple présentent une spécificité d’expression tissulaire et subcellulaire. Les P450s présents dans les mitochondries des glandes surrénales (CYP11) conduiront à la formation de pregnénolone, progestérone, corticostérone et aldostérone à partir du cholestérol. Ceux présents dans le réticulum endoplasmique des hépatocytes (CYP17, 21 et 19) aboutiront à l’androstènedione et la testostérone, et l’activité aromatase du CYP19, également présent dans le placenta et les gonades, formera les œstrogènes [73].
Ces voies métaboliques sont très importantes puisqu’un déficit en certains des P450s impliqués dans ces activités peut engendrer des maladies très graves. Ainsi, un défaut d’expression du CYP21, causé par une mutation du gène codant pour la 21-hydroxylase, conduit à une hyperplasie congénitale des surrénales, maladie génétique rare pouvant entraîner des accidents graves de déshydratation et des anomalies de la croissance [135].

Modèles d’études des P450s

Les différents modèles d’études des fonctions hépatiques sont représentés dans le tableau VII. Il existe de nombreux systèmes d’études, chacun ayant une utilité spécifique dans un domaine particulier. Classiquement, la technique du foie isolé perfusé, les tranches de foie, les hépatocytes isolés et en culture sont employés en développement préclinique, les microsomes servent au screening avant les études chez l’animal.
L’Homme est le meilleur modèle d’étude. Cependant, les modèles humains in vitro pour évaluer l’hépatotoxicité sont peu utilisés en industrie pharmaceutique. En effet, les données littéraires sont peu fournies et leur utilisation entraîne des difficultés techniques, du fait de leur variabilité et de leur manque de disponibilité [34]. Les morceaux de foie humain sont en effet difficiles à obtenir, puisque les foies sont en priorité réservés pour les transplantations hépatiques. L’industrie pharmaceutique et la recherche peut toutefois obtenir des morceaux de foie sains prélevés lors d’une biopsie d’un foie malade lors de cancer par exemple, puisqu’une partie non touchée du foie est systématiquement enlevée pour éliminer au maximum les cellules tumorales. De plus, l’utilisation de foie humain pose des problèmes éthiques. Le Comité d’éthique doit donner son accord au préalable, valable uniquement pour un projet bien déterminé.
Les modèles obtenus à partir de rongeurs, en particulier les rats, sont beaucoup plus disponibles. Les rats peuvent être traités par des injections de dexaméthasone avant leur sacrifice. Ce corticoïde entraîne une surexpression des cytochromes de la famille 3A, famille la plus présente dans le foie humain. L’extrapolation des données obtenues à l’Homme est alors facilitée. Des injections de phénobarbital, de la famille des barbituriques, ou de 3-méthylcholanthrène, hydrocarbure aromatique polycyclique carcinogène, induisant les cytochromes de la famille 2 et 1 respectivement, peuvent également être réalisées [26].
Les modèles hépatiques que nous avons utilisés sont les microsomes de rat et humains, les coupes de foie de rat et humain, les hépatocytes de rat en culture primaire (hépatocytes commercialisés congelés) et les hépatocytes isolés à partir du foie de rat puis mis en culture primaire.
Les applications des modèles hépatiques in vitro dans les études de pharmacotoxicologie sont diverses et comprennent l’étude des paramètres cinétiques (Km, Vmax…), du profil métabolique des xénobiotiques, des comparaisons inter-espèces, des inductions et inhibitions enzymatiques par action des P450s et des enzymes de phase II, des P450s impliqués dans la métabolisation de divers composés, des interactions médicamenteuses, de l’influence du polymorphisme génétique, de cytotoxicité et génotoxicité… [53]
D’un point de vue réglementaire, les recommandations proposées en vue de l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (AMM) se sont considérablement développées au cours de ces dix dernières années. Il y a une dizaine d’année, il suffisait pour le laboratoire pharmaceutique de démontrer que le composé était métabolisé ou non (grâce aux techniques du foie isolé perfusé et des coupes de foie). Au fur et à mesure des années, d’autres informations ont dû être apportées dans chaque dossier d’AMM, afin de garantir une meilleure efficacité et une meilleure sécurité au médicament mis sur le marché. Ainsi, le ou les métabolites sont identifiés et leurs éventuelles activités thérapeutiques, toxicités, réactivités vis-à-vis des macromolécules sont déterminées. Ensuite, le lieu où se passe le métabolisme, le ou les organes impliqués, sont mentionnés (grâce à l’utilisation de l’organisme entier). Les systèmes enzymatiques impliqués sont indiqués (avec l’utilisation d’hépatocytes ou de microsomes), en vue de prévoir les interactions possibles avec les voies métaboliques de produits endogènes, exogènes (interactions médicamenteuses) ou de nutriments. Dans ce même but et pour étudier le polymorphisme génétique, les isoformes impliquées sont également citées (à la suite d’études sur enzymes purifiées ou avec des inhibiteurs). Ainsi, un médicament substrat du CYP3A ou du CYP2D6 a toutes les chances d’être rejeté dès le début du développement. En effet, environ 60% des médicaments sur le marché sont métabolisés par le CYP3A, ce qui augmente le risque d’interactions médicamenteuses. En ce qui concerne le CYP2D6, il est soumis à un important polymorphisme génétique, un médicament métabolisé par cette isoforme ne pourra donc pas être utilisé de la même façon dans toutes les populations.

Régulation de l’expression des P450s

La variabilité d’expression intra- et inter-espèces des P450s est régulée par de nombreux facteurs : par des facteurs non génétiques incluant les facteurs environnementaux, les produits chimiques, les aliments, les médicaments (inducteurs ou inhibiteurs), le sexe, l’âge, la physiologie, les pathologies… et par des facteurs génétiques, c’est-à-dire le polymorphisme.

Origine non génétique

Induction

Une des caractéristiques des P450s est que certaines de ces enzymes, en particulier celles impliquées dans la métabolisation des xénobiotiques, sont inductibles. L’induction est souvent un procédé de régulation lent, car il fait intervenir un mécanisme transcriptionnel ou post-transcriptionnel [136].
L’expression du CYP3A peut être induite par des xénobiotiques. Une telle induction entraîne un métabolisme accéléré soit des xénobiotiques (auto-induction), soit de médicaments substrats du CYP3A administrés simultanément, en altérant leurs profils pharmacocinétique et pharmacodynamique [82]. Ce phénomène sera à l’origine d’une diminution des concentrations plasmatiques, avec un risque d’échec thérapeutique. Par exemple, le phénobarbital, inducteur du CYP2B, est rapidement métabolisé par le P450 qu’il induit. La conséquence sera une diminution des concentrations plasmatiques de phénobarbital et une réapparition des crises d’épilepsie chez les patients.
Les mécanismes d’induction des P450s sont complexes et diffèrent selon la sous-famille de P450s concernée. Une augmentation de la transcription est le plus souvent mise en jeu, mais il existe des augmentations de stabilité ou des diminutions de dégradation des ARNm ou de la protéine elle-même. Le premier mécanisme d’induction démontré a été celui de l’augmentation du taux du CYP1A1 après traitement par des hydrocarbures aromatiques polycycliques comme les dioxines. Le processus est initié par liaison du ligand au récepteur Ah cytosolique. Le complexe est alors transloqué dans le noyau. Le récepteur Ah s’associe à une seconde protéine, l’ARNT (Ah Receptor Nuclear Translocator). Ce complexe se lie à une séquence consensus XRE (Xenobiotic Responsive Element) présente dans le promoteur du gène de la protéine induite et active donc la transcription du CYP1A1 [60]. Le CYP3A est également inductible. Il existe en effet un récepteur à la pregnénolone PXR (Pregnan X Receptor) et une séquence de fixation de ce récepteur dans le promoteur des P450s humains. Le récepteur fixe des stéroïdes mais également une grande variété de médicaments dont la rifampicine et les glucocorticoïdes. Deux autres mécanismes impliquant des récepteurs sont connus. Il s’agit des PPAR (Peroxisome Proliferator Activator Receptor) et CAR (Constitutive Androstane Receptor), ce dernier, par liaison des barbituriques, permet l’induction du CYP2B6 [39]. D’autres cytochromes, comme le CYP2E1, sont induits par des mécanismes de stabilisation des ARNm mais également par des mécanismes de stabilisation de la protéine sous l’effet de l’éthanol. En effet, la dégradation de ce P450 par les protéases est retardée car l’éthanol diminue l’activité des protéasomes [107]. Sur le tableau VIII sont indiqués quelques exemples d’inducteurs des P450s en fonction de l’isoforme qu’ils induisent. Certains inducteurs induisent plusieurs isoformes de P450, comme la rifampicine qui induit les CYP2B6, 2C8, 2C19, 2C9, 2D6 et 3A. Des exemples d’inducteurs du CYP3A4 en particulier sont présentés dans le tableau VI.

Historique – Résistance aux chimiothérapies anticancéreuses

La résistance des cellules tumorales aux agents cytotoxiques représente un obstacle majeur à la chimiothérapie anticancéreuse. Les mécanismes en cause sont multiples, extrinsèques (liés aux relations hôte-tumeur ou hôte-médicament) ou intrinsèques (liés aux cellules cancéreuses elles-mêmes) [6]. Un ensemble de mécanismes de résistance cellulaire est lié à la diminution des concentrations intracellulaires en médicaments cytotoxiques, soit par diminution de l’absorption soit par augmentation de l’efflux hors de la cellule. Le mécanisme responsable de cet efflux, et donc du phénotype de résistance à certains médicaments, est lié à la présence de transporteurs membranaires, dont le premier décrit a été la P-glycoprotéine [64].
La résistance multidrogue (MDR pour « multidrug resistance ») est définie comme étant une résistance croisée des cellules tumorales vis-à-vis d’agents cytostatiques de famille et de modes d’action très divers. La surexpression de la P-gp peut conférer à la cellule le phénotype MDR [85].

Répartition – Localisation

Localisation tissulaire

La P-gp, codée par le gène mdr-1, est une enzyme exprimée dans la membrane plasmique de certaines cellules. Cette protéine a d’abord été décrite au niveau de cellules en lignée d’ovaires de hamster chinois [64]. La P-gp est exprimée dans les cellules tumorales, mais également dans les tissus humains sains de façon constitutive : la P-gp est localisée spécifiquement au niveau de certains types tissulaires dans le foie, le pancréas, les reins, le côlon, le jéjunum, la barrière hémato-encéphalique, les testicules, le placenta…[130]

Localisation dans la membrane plasmique

Dans le foie, la P-gp est retrouvée exclusivement au niveau des canalicules biliaires bordant les hépatocytes et au pôle apical des cellules épithéliales des canaux biliaires. Dans le pancréas, elle se trouve à la surface apicale des cellules épithéliales des canalicules mais n’est pas détectée au niveau des canaux pancréatiques. Dans les reins, la P-gp se concentre à la surface des cellules épithéliales des tubules proximaux. Le côlon et le jéjunum présentent de forts taux de P-gp à la surface apicale des cellules épithéliales superficielles. Dans les glandes surrénales, la P-gp est détectée de façon diffuse à la surface des cellules du cortex et de la médulla [130]. La P-gp est également présente dans les cellules endothéliales au niveau de la barrière hémato-encéphalique et des autres barrières faisant l’interface entre le sang et un tissu, au niveau des testicules ou du placenta par exemple [5, 7, 128].

Localisation intracellulaire

Bien que la P-gp soit majoritairement exprimée dans la membrane plasmique des cellules, des localisations intracellulaires ont également été décrites dans les cellules tumorales au niveau de l’enveloppe nucléaire et de la membrane d’organites cytoplasmiques [90].
En 1998, il est démontré, dans des cellules ovariennes de hamster chinois CHRC5 ayant acquis le phénomène de résistance multidrogue, que des médicaments sont séquestrés dans des vésicules cytoplasmiques, sur la membrane desquelles se trouve la P-gp [123]. La P-gp semble aussi être exprimée dans le noyau de lignées humaines de cellules d’ostéosarcome MDR [84]. En 1998, une équipe italienne [91] démontrait, dans des cellules en lignée de mélanome humain n’ayant jamais été en contact avec des cytotoxiques et n’exprimant pas la P-gp au niveau de la membrane plasmique, que la P-gp était présente au niveau intracytoplasmique dans l’appareil de Golgi. Les mêmes observations ont été décrites avec des cultures primaires obtenues à partir de métastases de mélanomes humains. En 2001, la même équipe prouvait cette même localisation de la P-gp dans des cellules tumorales MDR de sein [3]. Selon les auteurs, ces localisations intracellulaires prouveraient le rôle fonctionnel de la P-gp dans le transport et la séquestration de médicaments, et constitueraient une protection complémentaire des cellules tumorales contre les agents cytotoxiques.
Néanmoins, les localisations intracellulaires de la P-gp n’ont été démontrées que dans des cellules tumorales et jamais dans des cellules saines. De plus, dans notre étude, nous nous intéresserons principalement aux hépatocytes. Or, seule une localisation au niveau du pôle biliaire de ces cellules a été prouvée.

Structure

La P-gp est une protéine membranaire de 170 kDa, composée d’une chaîne polypeptidique monomérique de 140 kDa et d’un groupement N-glycosylé localisé du côté extracellulaire. Elle contient 1280 acides aminés qui s’organisent en deux séquences symétriques. L’existence de douze régions hydrophobes transmembranaires lui donne une configuration caractéristique de protéine assurant un transport transmembranaire. La partie intracytoplasmique contient deux sites de liaison à l’ATP. La P-gp est ainsi classée dans la famille des protéines ABC (ATP-Binding Cassette) et est également appelée ABCB1 (sous-famille B des transporteurs ABC) (Figure 15).

Table des matières

PARTIE I : CONTEXTE SCIENTIFIQUE
Chapitre I : Toxines bactériennes à activité intracellulaire
1. Organisation structurale des toxines bactériennes à activité intracellulaire
1.1. Toxines ABRTC
1.2. Toxines AB5
1.3. Toxines AnB7
1.4. Toxines A orphelines
2. Mode d’action des toxines à activité intracellulaire
2.1. Mécanismes généraux d’intoxication des toxines de type AB
2.1.1. Mécanisme d’action des toxines de type ABRTC
2.1.2. Mécanisme d’action des toxines de type AB5
2.1.3. Mécanisme d’action des toxines de type AnB7
2.2. Récepteurs
2.2.1. Récepteurs protéiques
2.2.2. Récepteurs lipidiques
2.2.3. Récepteurs mixtes : cas des neurotoxines clostridiales
2.2.3.1 Neurotoxines botuliques
2.2.3.2. Neurotoxine tétanique
2.3. Internalisation et trafic intracellulaire des toxines
2.3.1. Voies d’internalisation des toxines
2.3.1.1 Internalisation des toxines par la voie clathrine dépendante
2.3.1.2. Internalisation des toxines par la voie des cavéoles
2.3.1.3. Internalisation des toxines par les voies indépendantes de la clathrine  et des cavéoles
2.3.2. Trafic intracellulaire des toxines
2.3.2.1. Trafic des toxines par la voie endosomale
2.2.2.2. Trafic des toxines par la voie retrograde
2.4. Compartiments de destination
2.4.1. Endosomes
2.4.2. Réticulum endoplasmique
2.5 Activités catalytiques, cibles cellulaires et fonctions touchées
Chapitre II : Membranes biologiques et translocation des toxines bactériennes
1. Membranes cellulaires et membranes modèles
1.1. Composition et structure des membranes cellulaires
1.2. Propriétés de la bicouche lipidique
1.2.1. La fluidité membranaire
1.2.2. Potentiel de membrane, constante diélectrique et pH à la surface de la membrane
1.3. Membranes modèles
1.3.1. Les couches planes de lipides
1.3.2. Les vésicules de bicouches lipidiques
2. Interactions protéines-membrane
2.1. Influence des têtes polaires
2.2. Influence des chaînes acylées
2.3. Repliement des protéines et membrane
3. Rôle du composant B des toxines bactériennes
3.1. Domaine de translocation des toxines ABRTC
3.2. Pentamère B des toxines AB5
3.3. Heptamère des toxines AnB7
4. Passage du composant A à travers la membrane
4.1. Toxines ABRTC
4.2. Toxines AB5
4.3. Toxines AnB7
Chapitre III : Toxine diphtérique
1. De la pathogénèse à la cristallographie de la DT
2. Structure et mécanisme d’action de la DT
2.1. Structure de la toxine diphtérique
2.2. Mécanisme d’intoxication de la DT
2.2.1. Liaison de la DT à son récepteur
2.2.2. Internalisation de la DT et trafic intracellulaire
2.2.3. Translocation à travers la membrane
2.2.3.1. Isolé, le domaine C n’est pas transloqué
2.2.3.2. Domaine de translocation
2.2.3.3. Passage de C à travers la membrane 15389
2.3.4. Activité enzymatique du domaine C
3. Utilisation de la DT en biotechnologies
PARTIE II : RESULTATS-PUBLICATIONS
Article 1. La protonation concertée des histidines du domaine T de la toxine diphtérique déclenche son interaction avec la membrane
Article 2. Le domaine T de la toxine diphtérique favorise la liaison à la membrane et la translocation du domaine C
PARTIE III : CONCLUSIONS
BIBLIOGRAPHIE 

Télécharger le rapport complet