Mélanome oculaire et pronostic vital

Mélanome oculaire et pronostic vital

Matériel et méthod
Echantillonnage et prélèvements

Seuls les mélanomes uvéaux et épibulbaires ont été retenus pour cette étude. Les localisations palpébrales ont ainsi été écartées de l’échantillonnage. Les prélèvements utilisés proviennent tous des collections du laboratoire d’Anatomie Pathologique de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse et les quarante et un cas retenus se sont limités aux années 1996 à 2004.
L’ensemble des prélèvements considérés correspond à des pièces d’exérèse chirurgicale (énucléation) ou à des biopsies fixées dans une solution de formol tamponnée à 10%, recoupées, inclues et archivées en blocs de paraffine.

Fiches de renseignements

Chaque cas recensé s’accompagne d’une fiche de renseignements remplie en vue de l’examen histopathologique et d’une autre destinée à obtenir un suivi post-opératoire (Annexe 2).
• Fiche de renseignements associée à la demande d’examen histopathologique.
Elle comprend les coordonnées du propriétaire et du vétérinaire traitant, mais aussi une information la plus complète possible sur :
– l’animal atteint : espèce, sexe, race, âge
– le prélèvement, avec :
les commémoratifs cliniques (ancienneté des lésions, vitesse d’évolution, traitements antérieurs, résultats d’analyses précédentes, résultats d’examens complémentaires déjà effectués)
la nature du prélèvement : biopsie ou pièce d’exérèse chirurgicale
la description des lésions facilitée par la présence de deux coupes d’oeil schématique de face et de profil : localisation, aspect, distribution.
• Fiche de suivi clinique post-opératoire.
Elle reprend en quelques points les principales caractéristiques du cas étudié (propriétaire, animal, nature et date du prélèvement, ainsi que la conclusion histologique) et permet d’obtenir des données relatives :
– à l’évolution clinique de la lésion : décision thérapeutique consécutive à l’analyse histopathologique, éventuelle récidive (dans le cas d’exérèse non totale), évolution
– au devenir clinique de l’animal : vivant ou décédé, causes du décès, présence ou non de métastases, examens complémentaires effectués…

Technique histologique conventionnelle

Les blocs ont été coupés à 4 μm d’épaisseur. Les lames ainsi obtenues ont été séchées (37°C, une heure) puis déparaffinées dans du toluène (un bain de 5 minutes), avant d’être réhydratées dans des bains d’éthanol de concentrations décroissantes (éthanol absolu : un bain de 5 minutes, éthanol à 95° : un bain de 5 minutes, eau courante : un bain de 5 minutes). Une coloration conventionnelle à l’Hémalun-éosine a ensuite été réalisée en plongeant les lames 20 secondes dans une solution d’Hémalun de Mayer, puis en les rinçant à l’eau courante pendant 5 minutes et en les plongeant enfin dans une solution d’éosine-érythrosine aqueuse à 1%.
Les lames ont été à nouveau déshydratées par des bains d’éthanol de concentrations croissantes, puis placées dans du toluène. Des lamelles ont été alors montées en milieu synthétique avant lecture des lames.

Technique immunohistochimique

• Immunomarquage.
L’analyse immunohistochimique est réalisée sur des sections de 3 μm d’épaisseur. Les lames sont déparaffinées à l’aide de 3 bains successifs de toluène (5 minutes par bain) ; puis elles sont réhydratées dans deux bains successifs d’acétone (deux fois 5 minutes) et un bain de 5 minutes d’eau courante. Cette technique est celle utilisée en routine au service d’Anatomie Pathologique de l’Ecole Vétérinaire de Toulouse.
• Démasquage antigénique.
Le démasquage des sites antigéniques de Ki-67 est obtenu par l’action couplée de la trypsine et de la chaleur : c’est la phase de prétraitement.

Trypsinisation

Cette technique permet la digestion enzymatique et le démasquage antigénique. Une trypsinisation de 6 minutes à 37°C est effectuée dans le tampon phosphate salé (TPS) dilué au 1/10ème à pH 7,6 et trypsiné à 0,1%. Un rinçage à l’eau courante pendant 5 minutes arrête enfin l’action de la trypsine.

Traitement au four à micro-ondes

Les lames sont plongées dans un bac contenant 250 ml de tampon citrate à pH proche de 6, puis chauffées à la puissance de 700 watts pendant 10 minutes en surveillant l’évaporation du tampon. 50 ml de tampon sont ensuite ajoutés dans le bac pour réaliser un deuxième passage au four à micro-ondes pendant 5 minutes. Une dernière addition de 25 ml de tampon est ensuite effectuée avant le dernier chauffage de 5 minutes, après quoi on laisse refroidir les lames pendant ½ heure.
A la fin de cette première étape, les coupes sont cerclées à l’aide du Dako pen.
– Inhibition des marquages non spécifiques.Après inhibition des peroxydases endogènes dans un bain de méthanol additionné de peroxyde d’hydrogène pendant 30 minutes à température ambiante, les lames sont équilibrées dans une solution de TPS (1/10ème) additionnée de 1% de Sérum Albumine Bovine. Afin de minimiser les fixations non protéiques, un sérum normal de chèvre dilué au 1/10ème dans du TPS est appliqué pendant 20 minutes à température ambiante.
– Marquage immunohistochimique.
• Première couche.
Sans rincer, l’excès de sérum est retiré et l’anticorps monoclonal MIB-1 (code n° M7240, DAKO, Danemark) dilué au 1/50ème dans du TPS à 1% de SAB est laissé en place une heure.
• Deuxième couche.
On rince ensuite les lames dans trois bains successifs de TPS lacté de 5 minutes chacun, puis on les recouvre durant 35 minutes d’anticorps de chèvre antiimmunoglobuline de souris biotinilés (Kit Dakocytonation) dilué au 1/100ème dans du TPS à 1% de SAB.

Table des matières

Introduction
Première partie : synthèse bibliographique
I. Etude bibliographique comparée des mélanomes oculaires de l’uvée chez l’Homme et chez les Carnivores domestiques
1. Incidence et facteurs de risque
2. Localisation
3. Signes cliniques associés
4. Diagnostic différentiel des mélanomes oculaires
a. Lésions tumorales et pseudo tumorales pouvant simuler un mélanome irien chez l’Homme
b. Diagnostic différentiel des pigmentations iriennes chez les carnivores domestiques
c. Autres types tumoraux
5. Mélanome oculaire et pronostic vital
a. Pronostic vital lors de mélanome uvéal chez l’Homme
b. Pronostic vital lors de mélanome uvéal chez les carnivores domestiques
c. Les métastases des mélanomes oculaires des carnivores domestiques existent-elles réellement ?
6. Méthodes d’évaluation pronostique des mélanomes oculaires en médecine humaine
a. Influence des caractéristiques histopathologiques tumorales
b. La composition de la tumeur
c. Influence de l’extension tumorale
d. Profil du patient et autres paramètres tumoraux
e. Le choix du traitement
7. Méthodes d’évaluation pronostique des mélanomes oculaires en médecine vétérinaire
a. Intérêt pronostique de la classification de Callender pour les mélanomes oculaires canins
b. Analyse histologique des mélanomes oculaires adaptée à l’espèce canine selon Bussanich
c. Mélanomes oculaires et intérêt pronostique de l’index mitotique selon Wilcock.
8. Particularités des mélanomes oculaires félins
II. Intérêt pronostique du marqueur de prolifération tumorale Ki-67
1. Structure et fonction
2. Expression
Deuxième partie : étude expérimentale
I. Matériel et méthode
1. Echantillonnage et prélèvements
2. Fiches de renseignements
3. Technique histologique conventionnelle
4. Technique immunohistochimique
a. Trypsinisation
b. Traitement au four à micro-ondes
5. Analyse histopathologique
a. Critères architecturaux
b. Critères cytologiques
6. Analyse immunohistochimique
II. Résultats
1. Epidémiologie
2. Evolution clinique
3. Résultats des analyses histopathologiques et immunohistochimiques
a. Mode de croissance
b. Architecture
c. Vascularisation et emboles
d. Stroma réaction
e. Remaniements
f. Pigmentation tumorale
g. Atypies cytonucléaires
h. Type cellulaire
i. Index mitotique
j. Marqueur de prolifération Ki-67
k. Classification de Callender
l. Classification de Bussanich
m. Cas particulier des 2 mélanomes épibulbaires félins
III. Discussion
1. Echantillonnage
2. Suivi post-opératoire
3. Aspect épidémio-clinique
4. Nature et distribution des lésions
5. Critères histologiques
a. La pigmentation tumorale
b. Architecture et mode de croissance
c. Stroma réaction et remaniements
d. Index mitotique et atypies cytonucléaires
e. Type cellulaire
f. Vascularisation et emboles
6. Critères immunohistochimiques
7. A travers nos connaissances actuelles, quelle conduite convient-il de tenir face à un mélanome oculaire ?
a. Considérations générales sur le traitement des mélanomes oculaires en médecine humaine
b. Traitement des mélanomes oculaires en médecine vétérinaire
Conclusion
BIBLIOGRAPHIE
Table des illustrations
Annexes

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