MECANISMES MOLECULAIRES DE LA MOTILITE CELLULAIRE : LE CYTOSQUELETTE

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Motilité cellulaire deDictyostelium discoideum

L’amibe Dictyostelium discoideum est capable de se déplacer sur une surface à une vitesse de l’ordre de 10µm/mn. Cette motilité dite amibienne peut être décomposée en un cycle comportant trois phases (figure 1.4) :
– l’émission de protrusions au front avant de la cellule ( a et b ). C’est-à-dire une déformation de la membrane qui peut avoir des formes diverses. La cellule doit donc exercer des forces sur la membrane pour la déplacer. Ces forces sont obtenues grâce à la polymérisation de filaments d’actine.
– l’adhésion de ces protrusions sur le substrat( c ). L’adhésion des protrusions sur le substrat permet d’exercer des forces pour tirer la cellule vers l’avant. L’adhésion cellulaire met en jeu de nombreux assemblages moléculaires, parmi lesquels des protéines de type intégrine.
– le détachement et la rétraction du front arrière dela cellule ( d et e ). Une fois la cellule bien étirée sur la surface, elle doit se contracter avant de pouvoir s’étendre à nouveau. Cette phase nécessite d’exercer des forces de contraction à l’arrière de la cellule. Elle met plus particulièrement en jeu des assemblages de myosine II et de filaments d’actine.
Les trois phases ne sont pas indépendantes : la coordination temporelle et spatiale entre les différentes phases est un élément essentiel pour que la cellule avance correctement.
Pour se déplacer, la cellule doit être capable de ousserp sa membrane à l’avant et de tirer celle-ci à l’arrière, et donc d’exercer des forces. L’existence de ces forces peut être mise en évidence en déposant les cellules sur un substrat éformabled. (Uchida et al., 2003). Dans ce qui suit, nous allons revenir sur l’origine moléculaire de ces différentes forces, puis nous nous intéresserons aux voies de signalisation qui régulent et coordonnent leurs actions.

Mécanismes moléculaires de la motilité cellulaire : le cytosquelette

Le cytosquelette est un élément essentiel pour la éponser mécanique des cellules. Comme son nom l’indique, c’est un vrai squelette interne de l a cellule qui sert entre autres au transport d’organelles, à la division cellulaire et à la moti lité cellulaire. ChezDictyostelium, il est formé de deux types de protéines, formant deux réseaux defilaments :
– les microtubules, longs filaments assez rigides (longueur de persistance Lp 6mm) sont composés de monomères de tubuline. Ces filaments sont principalement impliqués dans le maintien de la forme des cellules, dans le transport intracellulaire, et dans la division cellulaire. Ils ne semblent pas impliqués dans la motilité cellulaire, du moins dans la production de forces chez Dictyostelium, même s’ils pourraient jouer un rôle de stabilisation des protrusions (Ueda et al., 1997)
– les filaments d’actine, beaucoup plus souples (L p 18µm) sont formés à partir de monomères d’actine.

Les filaments d’actine

L’actine est une protéine de 375 acides aminés, depoids moléculaire 42 kDa, et dont la séquence est très conservée au cours de l’évolution.C’est une des protéines les plus abondantes de la cellule, avec une concentration de l’ordre de 100µM dans le cytoplasme.
La structure de l’actine est connue ((Kabsch et al. , 1990), voir figure 1.5). La molécule a une forme globulaire, avec une cavité qui rend la protéine asymétrique. A l’intérieur de cette cavité se trouve un site de liaison à l’ATP/ADP.
Chaque molécule d’actine est capable de se lier à d’autres molécules d’actine pour former un polymère qui peut atteindre plusieurs µm de long. Le polymère obtenu a la forme d’un long filament ayant une structure en double hélice (figure 1.6). De plus, il est polarisé, du fait de la non-symétrie des monomères d’actine. En effet, chaque extrémité du filament exposant des résidus différents du monomère d’actine, les deux xtrémitése ont des propriétés différentes et interagissent avec des molécules différentes. On définit ainsi une extrémité +, dite « barbée » et une extrémité –, dite « pointée ». Pour distinguer l’actine sous forme monomérique de l’actine présente sous forme de filament, on parlera d’actine-G (pour globulaire) dans le cas du monomère libre et d’actine-F pour les filaments.
L’actine-G commence à polymériser spontanément si la concentration en monomère est supérieure à une concentration critique Cc. La valeur de Cc dépend du fait que le monomère d’actine soit lié à une molécule d’ATP ou à une molécule d’ADP (Cc de respectivement 0,12µM et 2,0µM). L’actine-G polymérise donc plus f acilement lorsqu’elle est liée à l’ATP. La polymérisation se déroule alors en deux phases figure( 1.7) : une première étape, lente, dite phase de nucléation, pendant laquelle des monomèress’assemblent pour former des trimères d’actine. Une fois ces trimères formés, les filaments croissent rapidement par addition de monomères aux extrémités. C’est la phase d’élongati des filaments.
de la polymérisation d’actine. (a) La première étape, la plus lente, est la formation d’un trimère par nucléation de l’actine-G. (b) Une fois ce trimère formé, les monomère s’associent et se dissocient pour former un filament (Bray, 2001).
Une fois cette phase d’élongation enclenchée, le phénomène de polymérisation peut être décrit comme un équilibre dynamique entre association de monomères (qui dépend de la concentration en monomères libres), et dissociation de monomères. La vitesse de croissance d’un filament peut alors s’écrire : V konactine G koff
A la concentration critique koff/kon, la polymérisation est en équilibre avec la dépolymérisation.
On a vu que les deux extrémités d’un filament n’étaient pas identiques. Cela se retrouve aussi au niveau des vitesses de croissance à chaque extrémité : L’extrémité barbée (+) croît plus vite que l’extrémité pointée (-) (Pollard and Borisy, 2003).
En résumé, on a une polymérisation préférentielle l’actined-G liée à l’ATP à l’extrémité barbée du filament. Une fois polymérisé, l’ATP estrapidement hydrolysé en ADP. Et à l’extrémité pointée, les monomères d’actine liés l’ADPà ont tendance à se dissocier du filament. Il en résulte un mouvement de tapis roulant (ou treadmilling) des monomères de l’extrémité barbée vers l’extrémité pointée. Ce mouvement a pu être observé directement à l’aide de monomères d’actine fluorescents (Fujiwara et al., 2002)
On a vu précédemment qu’in vivo, la concentration d’actine est de l’ordre de 100µ M. Or la moitié seulement de cette actine est présente sousforme d’actine-F. Au vu de la concentration critique de polymérisation, on s’attendrait pourtan à ce que 99% de l’actine soit sous forme filamenteuse. D’autre part la cellule est capable de réorganiser son cytosquelette en quelques secondes (Schleicher and Noegel, 1992). Il existe donc des systèmes de régulation de la polymérisation de l’actine in vivo.
En effet, l’actine interagit avec de nombreuses protéines, que ce soit sous sa forme actine-G ou actine-F. Les assemblages formés sont à l’origine de la motilité en permettant l’application de forces et la polarisation de la cellule. Nous allons maintenant détailler la nature de ces assemblages moléculaires en fonction de leur localisation dans la cellule et de leur rôle dans la motilité.

Polymérisation d’actine et protrusions au front avant de la cellule

Dans les protrusions, il y a polymérisation rapide des filaments d’actine (Condeelis, 1993). Les protéines chargées de réguler cette polymérisation peuvent être classées en 6 catégories (voir figure 1.8):
· les protéines qui séquestrent l’actine globulairesequestering( proteins):
Ce sont des protéines qui, en se liant à l’actine-G, abaissent la concentration d’actine-G libre au voisinage de la concentration critique. Les complexes formés constituent un réservoir d’actine-G facilement mobilisable grâce à leur faib le affinité avec les monomères d’actine (Kd = 0,7 µM) (De La Cruz et al., 2000). La thymosi ne4 et l’actobindin font partie de ces protéines. Il existe trois homologues de cette dernière chez Dictyostelium.
· les profilines, qui lient l’actine-G et accélèrentl’échange de l’ADP en ATP :
En facilitant l’échange de l’ADP en ATP au niveau d’une sous-unité d’actine-G, la profiline favorise la liaison de cette sous-unité à l’extrémité barbée d’un filament et donc accélère la polymérisation.
· Les protéines qui aident la nucléation de filamentsd’actine :
Ces protéines se lient à plusieurs unités d’actine et les positionnent de façon à engendrer la croissance d’un nouveau filament ou d’une nouvelle branche sur un filament existant. Ceci permet d’accroître la capacité de l’actine à former de nouveaux filaments. Par exemple, citons le complexe Arp2/3 et la protéine WASP, les formines.
· Les protéines de coupe ou de fragmentation(severing proteins) :
Ces protéines se lient aux filaments d’actine et les coupent. Cela permet d’accélérer le turnover des monomères d’actine. C’est le cas par exemple de l’ADF/cofiline qui accélère la dépolymérisation des filaments d’actine à l’extrémité pointée du filament (Theriot, 1997).
· Les protéines de coiffe (capping proteins) :
Ces protéines se fixent aux extrémités des filaments d’actine, empêchant leur élongation. Cela favorise la densification du cytosquelette d’actine, et permet d’exercer des forces plus importantes. Parmi ces protéines, on peut citer cap32/34. (Eddy et al., 1996)
· Les protéines de réticulation (cross-linking proteins) :
Ces protéines lient les filaments d’actine entre eux. Cela permet de rigidifier les filaments d’actine.
Toutes ces familles de protéines sont présentes chez Dictyostelium discoideum. Pour une revue, on pourra consulter (Eichinger et al., 1999; Eichinger et al., 2005).
En partant de protéines purifiées, il a été montréqu’à partir d’un jeu de seulement cinq protéines (actine, ARP2/3, gelsoline, ADF et WASP) et en présence d’ATP on pouvait propulser des billes de quelques microns de diamètre (Carlier et al., 2003). Les forces mises en jeu ont été estimées, à l’aide de billes attachées à une micropipette, à quelques nN. (Marcy et al., 2004). Ce mouvement à base de polymérisation d’actine explique le déplacement de la bactérie Listeria monocytogenes dans le cytoplasme des cellules infectées. On retrouve ce type de structure au niveau des protrusions des cellules motiles ((Schafer et al., 1998), (Bretschneider et al., 2002), (Carlier et al., 2003)). Les forces mises en jeu au niveau de ces structures sont du même ordre de grandeur, bien queles variations entre types de cellules soient importantes (de 1 nN pour Dictyostelium à quelques dizaines de nN pour des fibroblastes par exemple, voir (Fukui et al., 2000) ou (Balaban et al., 2001)).

Complexe actine/myosine II et rétractions aufront arrière de la cellule

Au niveau du front arrière des cellules, le cycle de polymérisation/dépolymérisation des filaments d’actine est moins actif, et la force de contraction nécessaire à l’avancement de la cellule est produite non pas par la polymérisation de l’actine, mais par le déplacement de moteurs moléculaires, notamment de la myosine II, sur les filaments existants. Le mouvement polarisé du moteur est assuré par l’association etla dissociation successive des deux têtes de la myosine II avec un filament d’actine.
La myosine II est une grosse protéine composée de euxd chaînes lourdes (220kDa) et deux chaînes légères(20kDa). Chaque chaîne lourde peut elle-même être décrite comme l’association de deux domaines : une tête globulaire possédant des domaines de liaison à l’actine et à l’ATP, et une longue queue en hélice par laquelle sont reliées les deux chaînes lourdes (figure 1.9). Ces chaînes lourdes constituent le moteur moléculaire proprement dit, alors que les chaînes légères n’ont qu’un rôle de régulation de l’activité du moteur.

Voies de signalisation impliquées dans la polarisation cellulaire et le chimiotactisme

Le chimiotactisme est un processus par lequel un gradient chimique extérieur est détecté par des récepteurs cellulaires, ce qui conduit à un mouvement dirigé de la cellule dans la direction du gradient.
Dictyostelium discoideum a beaucoup été utilisé pour découvrir et comprendrles voies de signalisation permettant à une cellule de se polari ser et de se déplacer dans un gradient de chimioattractant (pour des revues, voir (Parent and Devreotes, 1999), (Kimmel and Parent, 2003), (Merlot and Firtel, 2003), (Parent, 2004)).
Dictyostelium possède des récepteurs à l’AMPc uniformément répartis à la surface de sa membrane plasmique. Ces récepteurs sont couplés à des protéines G hétérotrimériques, protéines composées de trois sous unités et et se liant au GDP à l’état inactif. La liaison de l’AMPc à son récepteur entraîne l’activation cat alytique de protéines G, par échange du GDP en GTP. Les sous unités G et G se dissocient alors et servent de messager intracellulaire pour activer différentes voies de ignalisation. Les principales sont (Kimmel and Parent, 2003):
– La régulation de la concentration locale en PI(3,4,5)P3, via l’activation et le recrutement à la membrane des phosphoinositide 3-ki nases (PI3K), qui phosphorylent le lipide PI(4,5)P2 en PI(3,4,5)P3 , et la dissociation de la membrane de PTEN (phosphatase and tensin homolog), qui joue le rôle inverse d es PI3K.
– l’activation de la guanylyl cyclase (GC), qui catalyse la transformation d’une molécule de GTP en une molécule de GMPc. Le GMPc joue un rôle de second messager intracellulaire.
– l’activation de l’adenylyl cyclase (ACA), qui cata lyse la transformation d’une molécule d’ATP en une molécule d’AMPc. Lors de la phase d’agrégation du développement, une partie de cet AMPc est sécrétée. esL cellules Dictyostelium relayent ainsi des vagues d’AMPc qui permettent aux cellules suivantes de rejoindre le centre de l’agrégat.
A l’endroit où la concentration de chimioattractant est la plus grande, c’est-à-dire au front avant de la cellule, les PI3K sont activées par des protéines de la famille Ras, et recrutées à la membrane plasmique. A l’inverse, PTEN, qui en l’absenc e de signal est présent à la membrane grâce à son domaine de liaison au PIP 2, se détache de la membrane au front avant. (Funamoto et al., 2002). PTEN est alors localisé sur les côtés et à l’arrière de la cellule, à l’inverse de PI3K. Cette localisation a pour conséquence une accumulation de PI(3,4,5)P3 au front avant de la cellule. Le PIP3 a donc un rôle essentiel dans la polarisation et l a motilité cellulaire. Dans la cascade de signalisation en réponse à une stimulation chimique, c’est l’élément connu le plus amont qui présente une asymétrie dans la cellule (voir figure 1.14).
L’accumulation de PIP 3 au front avant entraîne le recrutement de protéines possédant un domaine de liaison au PIP3, comme les domaines PH par exemple (pour Plekstrin Homology). Parmi ces protéines, on trouve PhdA (PH domain-containing protein A) la kinase Akt, CRAC (cytosolic regulator of adenylyl cyclase) mais aussi des protéines comme WASP, agissant directement sur le cytosquelette d’actine. Suite à l eur recrutement, la polymérisation d’actine au front avant de la cellule et donc la formation de protrusions, sont stimulées.
La signalisation induite par le gradient intracellulaire de PIP3 ne se limite pas au front avant. Akt par exemple active PAKa (p21 activated kinase A), qui se relocalise au front arrière et régule l’assemblage des myosines II. C’est aussi le cas d’une autre cascade de signalisation impliquant le GMPc, via l’activation de kinases qui phosphorylent la chaîne régulatrice de la myosine (Bosgraaf et al., 2002). Le rôle de ces assemb lages de myosine-II du côté opposé au côté stimulé par l’AMPc est double : permettre la contraction du bord cellulaire, mais aussi empêcher l’apparition de protrusions au front arrière.
Toutes ces voies de signalisation permettent à la c ellule de se polariser, en définissant un front avant où l’actine polymérise et un front arrière oùla cellule se contracte sous l’action de la myosine II. (figure 1.14 et 1.15)
Les cellules phagocytaires comme Dictyostelium ou les neutrophiles sont capables de s’orienter dans des gradients de chimioattractant très faibles, avec des différences de concentration de l’ordre de 2% entre l’avant et l’a rrière de la cellule. Pour obtenir une réponse bien polarisée comme décrite précédemment, il doitxister un mécanisme d’adaptation et d’amplification capable de créer un gradient intracellulaire beaucoup plus important que le gradient de chimioattractant.
Ce mécanisme d’amplification fait intervenir des boucles de feedback positif ou négatif entre plusieurs protéines (Weiner et al., 2002). On peut citer par exemple au front avant une boucle de feedback positif impliquant le PIP3, les PI3-kinases, la polymérisation d’actine et des petites protéines G comme Rac ((Charest and Firtel, 2006), voir figure 1.15). De plus, les signalisations au front avant et arrière de la cellule s’excluent mutuellement (Xu et al., 2003), ce qui renforce la polarisation cellulaire. Enfin, on peut noter que P. Devreotes a montré que le gradient de PI3K, mais pas celui de PTEN, présentait une amplification par rapport au gradient extérieur d’AMPc (Janetopoulos et al., 2004).

Plasmides et constructions utilisés

· CRAC-GFP : plasmide à réplication autonome contenant le domaine PH (Pleckstrin
homology) de CRAC (cytoplasmic regulator of adenylyl cyclase), en fusion avec la GFP. Ce domaine se lie au PIP3 in vivo. Le plasmide contient des gènes de résistance à l’ampicilline (sélection E.coli) et à la généticine (sélectionD.discoideum). Ce plasmide provient du laboratoire de P. Devreotes (Johns Hopkins University, Baltimore, USA)
· LimEcc -GFP: plasmide à réplication autonome contenant le gène codant pour la protéine LimE, dépourvu de son domaine C-terminal (domaine coiled-coil), en fusion avec la GFP. LimE s’associe in vivo aux filaments d’actine nouvellement créés, marquant ainsi le front avant des cellules motiles, où l’actine polymérise. Le plasmide contient des gènes de résistance à l’ampicilline et à la généticine. Ce plasmide provient du laboratoire de G. Gerisch (Max Planck Institut, Martinsried, Allemagne).
· pFL712, pFL726, pFL739, pFL741: constructions réalisées à partir du vecteur PDXA-GFP2 (Levi et al., 2000) contenant des gènes de résistance à l’ampicilline et à la généticine, ainsi que le gène codant pour la GFPsous le contrôle du promoteur de l’actine. Différents fragments du gène Phg2 ont étéinsérés entre les sites BamHI et XhoI de ce vecteur, la GFP se trouvant toujours à l’ extrémité N-terminale de ces fragments (figure 2.1).
– pFL712, Phg2 complet
– pFL726, Phg2 sans le domaine N-terminal de liaison au PIP2
– pFL739, Phg2 sans le domaine kinase
– pFL741, Phg2 sans le domaine de liaison à Ras

Table des matières

1 INTRODUCTION
1.1 L’AMIBE DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
1.1.1 Dictyostelium discoideum comme modèle d’étude
1.1.2 Motilité cellulaire de Dictyostelium discoideum
1.2 MECANISMES MOLECULAIRES DE LA MOTILITE CELLULAIRE : LE CYTOSQUELETTE
1.2.1 Les filaments d’actine
1.2.2 Polymérisation d’actine et protrusions au front avant de la cellule
1.2.3 Complexe actine/myosine II et rétractions au front arrière de la cellule
1.2.4 Molécules de l’Adhésion cellulaire
1.3 VOIES DE SIGNALISATION IMPLIQUEES DANS LA POLARISATION CELLULAIRE ET LE CHIMIOTACTISME
1.4 MECANO-SENSIBILITE CELLULAIRE.
1.4.1 Exemples de cellules mécano-sensibles
1.4.2 Mécanismes moléculaires de la mécano-sensibilité
1.5 CAS DE DICTYOSTELIUM : MECANO-SENSIBILITE ET ROLE DU CALCIUM
1.6 OBJECTIFS DU TRAVAIL DE THESE
2 MATERIELS ET METHODES
2.1 BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE
2.1.1 Souches utilisées
2.1.2 Plasmides et constructions utilisés
2.1.3 Sous-clonage
2.1.4 Techniques de biologie moléculaire
2.1.5 Modes de culture et milieu nutritif
2.1.6 Mesure de la concentration cellulaire
2.1.7 Préparation des cellules
2.2 TRAITEMENT DES SURFACES
2.3 MESURE DE LA CINETIQUE DE L’ETALEMENT CELLULAIRE ET DE LA DYNAMIQUE DES ZONES DE CONTACT
2.3.1 Protocole expérimental
2.3.2 RICM
2.3.3 Analyse statistique de l’étalement cellulaire
2.4 EXPERIENCES DE MOTILITE SOUS FLUX A FAIBLE GROSSISSEMENT : DETERMINATION STATISTIQUE DE LA VITESSE ET DE L’ORIENTATION DES CELLULES
2.4.1 Chambre à flux latéral à lame
2.4.2 Calcul de la contrainte appliquée aux cellules
2.4.3 Préparation des cellules et déroulement de l’expérience
2.4.4 Changement de milieu, utilisation du calcium et détermination de la concentration
2.4.5 Acquisition et traitement des images
2.4.6 Traitement des données, champ de vitesse et orientation des cellules
2.5 EXPERIENCES DE MOTILITE SOUS FLUX A FORT GROSSISSEMENT : ANALYSE DE LA MORPHOLOGIE CELLULAIRE ET DE LA DYNAMIQUE DES ZONES DE CONTACT
2.5.1 Montage expérimental et déroulement de l’expérience
2.5.2 Acquisition et traitement des images
2.6 ADHERENCE CELLULAIRE
2.6.1 Chambre à flux radial, préparation des cellules et déroulement de l’expérience
2.6.2 Calcul de la contrainte appliquée aux cellules
2.6.3 Acquisition et traitement des images
2.6.4 Détermination de la contrainte seuil apparente de détachement
3 RESULTATS
3.1 ETALEMENT CELLULAIRE
3.1.1 Cinétique d’étalement de Dictyostelium discoideum.
3.1.2 Etude des protrusions et rétractions. Mise en évidence d’une activité périodique
3.1.3 Influence de la concentration en calcium sur l’activité périodique des protrusions et rétractions
3.1.4 Influence de l’adhérence cellule-substrat sur l’activité périodique des protrusions et rétractions
3.1.5 Polarisation de l’étalement
3.2 ETUDE DU ROLE DE LA PROTEINE PHG2 DANS LA MOTILITE CELLULAIRE.
3.2.1 Introduction
3.2.2 Rôle des différents domaines de Phg2 dans l’adhésion cellulaire
3.2.3 Rôle des différents domaines de Phg2 dans la motilité induite par un flux hydrodynamique
3.2.4 Rôle des différents domaines de Phg2 dans l’étalement cellulaire
3.3 ETUDE DE LA FONCTION DES PROTEINES PKD2 ET TPC DE DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM
3.3.1 Invalidation de pkd2 et tpc et surexpression de GFP-PKD2
3.3.2 Rôle de PKD2 et TPC dans la croissance cellulaire et le développement
3.3.3 Analyse de la motilité cellulaire sous contrainte hydrodynamique
4 DISCUSSION ET PERSPECTIVES
4.1 CARACTERES GENERAUX DE L’ETALEMENT CELLULAIRE.
4.1.1 L’étalement est un processus quasi-linéaire.
4.1.2 Anisotropie de l’étalement et cellules phagocytaires
4.2 PHENOMENES OSCILLANTS, ETALEMENT ET MOTILITE
4.3 ROLE DU CALCIUM DANS L’ETALEMENT ET LA MOTILITE CELLULAIRE INDUITE PAR UN FLUX
4.4 ROLE DE PHG2 DANS L’ETALEMENT ET LA MOTILITE CELLULAIRE
4.4.1 Phg2 et la polarisation cellulaire
4.4.2 Les partenaires de Phg2 : Phg2 et la phosphorylation des myosines II
4.4.3 Rôle proposé pour les différents domaines de Phg2
4.5 PERSPECTIVES
5 BIBLIOGRAPHIE
6 ANNEXES : PUBLICATIONS

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