M´ecanismes impliquant des coupures de l’ADN

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Mecanismes impliquant des coupures de l’ADN

Certains mecanismes cellulaires impliquent des remaniements de la se-quence nucleotidique. Ces mecanismes, qui interviennent physiologiquement dans la vie cellulaire, emploient donc des enzymes capables de generer des coupures dans l’ADN, necessaires a ces remaniements.

La meiose

Dans les cellules sexuelles, la meiose permet de creer, a partir d’une cellule mere, quatre cellules lles dont les patrimoines genetiques di erent.
Cette diversit resulte de deux phenomenes, dont l’un, appel enjambement, < Crossing over > implique que des coupures aient lieu sur deux molecules d’ADN a n de permettre d’echanger certaines de leurs parties. Ces coupures sont generees dans les cellules germinales m^ales par des enzymes speci ques, telles que la proteine de recombinaison meiotique Spo11 [Cao et al., 1990]. Lors de la meiose, l’ADN est donc physiologiquement < endommag > a n de permettre une diversi cation du patrimoine genetique.

V(D)J et recombinaison de conversion de classe

Dans le systeme immunitaire, les anticorps produits par les cellules B sont composes de deux parties : l’une d’entre elle est commune a tous (partie constante) et l’autre, responsable de la reconnaissance speci que d’un antigene, varie d’une molecule a l’autre (partie variable). Les anticorps sont constitues d’une cha^ne lourde et de deux cha^nes legeres, chacune etant composee d’une partie constante et d’une partie variable.
Les genes qui codent les parties variables de ces cha^nes comportent des repertoires de sequences variables, V, de diversite, D (speci ques de la cha^ne lourde) et de jonction, J. La recombinaison V(D)J permet de produire des millions d’anticorps di erents a partir d’une m^eme sequence genomique en generant des coupures par des enzymes specialisees, Rag1 et Rag2, de la famille des transposases. Les extremites des fragments V/D/J sont ensuite liguees de maniere a combiner ces di erents fragments entre eux, ce qui constitue la source de la diversit generee (pour une revue, lire Jones et Gellert [2004]). Les recepteurs a l’antigene exprimes par les cellules T impliquent le m^eme processus de diversi cation que les anticorps.
Dans les cellules B, le mecanisme de recombinaison de conversion de classe permet de placer une region variable, produite par V(D)J sur di e-rentes parties constantes qui determinent l’isotype. Ce mecanisme a lieu, par exemple, lorsqu’un anticorps membranaire (IgM) reconna^t son anti-gene et qu’il est alors necessaire de produire des anticorps libres (IgE, par exemple) comportant la m^eme sequence variable a n de pouvoir reconna^tre et eliminer speci quement l’antigene detect . Le processus permettant la constitution d’une nouvelle classe d’anticorps dotee de la m^eme speci cit de reconnaissance que ceux qui sont presents a la surface des cellules du systeme immunitaire est mis en uvre par le biais de l’excision d’une partie de la sequence genomique (pour une revue, consulter Geha et al. [2003]). La production de coupures dans les sequences < signal > est suivie de la ligation des sequences appropriees.
Les cellules peuvent donc endommager leur propre ADN de maniere transitoire et organisee (mais non totalement contr^olee). Ce proced permet notamment d’introduire de la diversit genetique (et donc moleculaire) qui est ensuite mise a pro t par les cellules.

Facteurs endogenes toxiques pour l’ADN

Dans les cellules, l’ADN est soumis a de nombreuses attaques par des agents endogenes. Parmi les lesions ainsi provoquees, nous avons distingue celles liees a la presence de composes reactifs dans les cellules, capables d’interagir avec les groupements chimiques des molecules d’ADN et celles provoquees par des dysfonctionnements de proteines qui interviennent dans la physiologie de l’ADN.

Les produits secondaires du metabolisme

Certains produits secondaires du metabolisme possedent une reactivit su sante pour induire des modi cations chimiques sur les molecules d’ADN. L’exemple le plus frappant concerne les especes reactives de l’oxygene qui sont produites, par exemple, tout au long de la cha^ne respiratoire, dans les mitochondries [Simsek et Jasin, 2011]. Les especes radicalaires, en parti-culier, sont extr^emement reactives et peuvent modi er la nature chimique des bases de l’ADN. Les lesions provoquees par ces composes ne sont pas individuellement graves, mais elles le deviennent lorsqu’elles sont presentes en quantite importante.

Les dysfonctionnements enzymatiques

De nombreux enzymes sont impliques dans la physiologie de l’ADN. Ces proteines, qui sont necessaires a la vie des cellules, peuvent toutefois egalement provoquer l’apparition de lesions dans l’ADN lorsqu’elles ne fonctionnent pas correctement.
Les polymerases a ADN (DNA-polymerases) sont les enzymes respon-sables de la replication de l’ADN (mecanisme necessaire a n de transmettre l’information genetique d’une cellule mere a deux cellules lles). La synthese de l’ADN est dite semi-conservative, car elle utilise la complementarit des bases d’ADN a n de produire un nouveau brin d’ADN a partir d’un ancien (chaque nouveau duplexe d’ADN comporte donc le brin neosynthetis hybride a l’un des anciens). Bien que ces enzymes soient deles (moins d’une erreur tous les 105 nucleotides) et, de plus, dotes d’une activite de correction (3’-5’ exonuclease), il peut arriver que des mesappariements soient observes apres la replication, ce qui perturbe la structure de la double-helice (apparition de < bulges >). Certaines de ces DNA-polymerases sont utilisees uniquement apres un stress genomique lors d’un processus particulier de reparation appel synthese translesionnelle. Or, ces polymerases sont bien moins ables que leurs contreparties specialisees dans la replication et peuvent ainsi introduire une proportion non negligeable de mesappariements [Saugar et al., 2014].
Dans les noyaux, la double-helice d’ADN subit un enroulement qui permet sa compaction (les molecules d’ADN ont une taille importante, alors que l’espace disponible dans le noyau est limite). Cet enroulement est en partie contr^ole par des enzymes, les topoisomerases, dont le mecanisme peut faire intervenir un complexe covalent entre un brin d’ADN clive et la proteine [mecanisme de TOP1 (p 187), par exemple]. Ces intermediaires covalents, toxiques pour l’ADN dans certaines conditions, peuvent ^etre stabilises par des inhibiteurs de topoisomerases.

Facteurs exogenes toxiques pour l’ADN

En plus des di erents facteurs endogenes pouvant endommager l’ADN, l’environnement constitue egalement une source d’exposition a des composes pouvant induire des lesions. Parmi ces derniers, on peut notamment citer la fumee de cigarette, la lumiere ultraviolette (lumiere solaire), les radiations ionisantes, ou encore des composes chimiques comme le plomb contenu dans certaines peintures. Ces composes sont donc nocifs pour les cellules et, a plus grande echelle, pour l’organisme tout entier. De maniere interessante, nous verrons egalement par la suite qu’il peut ^etre utile d’induire ces dommages dans nos cellules a n d’en exploiter la dangerosit (voir x 1.5.1, page 30).
Conclusion. Dans les cellules, l’ADN est continuellement soumis a des agressions, aussi bien endogenes qu’exogenes. Les dommages provoques entravent le bon fonctionnement du metabolisme de l’ADN et donc celui de la cellule. A n de permettre aux cellules de survivre et de continuer a se diviser, l’evolution a selectionn des mecanismes destines a restaurer l’integrit de l’ADN.
La diversit des dommages a l’ADN re ete la variet des facteurs qui peuvent les causer. La detection, la caracterisation et la quanti cation de ces dommages induits par l’un des agents mentionnes ci-dessus, par exemple, fait l’objet d’une discipline a part entiere (pour une revue, voir Cadet et Wagner [2013]). Les cassures de la cha^ne phosphodiester, sur l’un des brins (CSB, pour cassure simple-brin) ou les deux (CDB, pour cassure double-brin) sont des types de dommages particuliers qui necessitent l’intervention de ligases a ADN. Ces cassures peuvent egalement constituer des intermediaires pour la reparation d’autres dommages, plus varies et plus complexes.

Reparation de l’ADN

Di erents mecanismes de reparation sont mis en uvre par des acteurs cellulaires repondant speci quement a une categorie particuliere de dommages (Figure 1.2, page ci-contre). Ces mecanismes, ou < voies de reparation >, se materialisent par le recrutement dynamique et ordonne de proteines au niveau du dommage, qui forment des complexes permettant de reparer ce dommage selon un processus en plusieurs etapes. Certaines cassures, dites de < chimie complexe >, peuvent cependant mettre en di culte les systemes de reparation de l’ADN en raison de la structure particuliere de l’ADN au niveau des extremites generees (seules les extremites 5’phosphate et 3’OH, qui sont dites < canoniques >, sont reconnues par les ligases).
D’excellentes revues discutent des di erents mecanismes connus pour reparer les dommages a l’ADN [Ciccia et Elledge, 2010; Iyama et Wilson

Le NER (< nucleotide excision repair >)

Le mecanisme du NER est declench par la detection d’une distorsion de la double-helice d’ADN, due a la presence d’un dommage. Contrairement au BER, ce mecanisme met en uvre l’elimination du fragment d’ADN endommag . Deux chemins sont possibles, selon que le dommage est present dans une region transcrite (< transcription coupled NER >) ou non (< global genome NER >) . Ces deux voies ne di erent que par les proteines qui sont impliquees dans la reconnaissance des lesions (Figure 1.4, page suivante).

Dans le GG-NER, les proteines RPA, XPA et XPC reconnaissent les dommages. La proteine de replication RPA (trimere de RFA1,RFA2 (p 178) et RFA3) ne reconna^t pas directement le dommage, mais se xe sur l’ADN simple-brin qui en resulte, ce qui induit l’ouverture de la double helice par l’activite helicase de TFIIH. Dans le cas du TC-NER, la RNA-polymerase II, bloquee par le dommage au cours de la transcription, recrute directement les proteines de reparation.

Dans les deux cas, les nucleases XPG et XPF-ERCC1 realisent ensuite une incision dans le brin qui provoque l’apparition d’extremites 3’ et 5’. La formation du complexe d’incision PIC3, constitue des proteines XPA, RPA, TFIIH, XPG et XPF-ERCC1, est dependante de l’ATP. Les incisions realisees de part et d’autre du dommage sont situees respectivement 6 nucleotides en 5’ du dommage, pour la premiere et 20 nucleotides en 3’, pour la seconde. Le complexe d’excision genere donc un oligonucleotide simple-brin d’une vingtaine d’oligonucleotides comportant le dommage, qui sera ensuite elimine. Les proteines du complexe d’excision se detachent ensuite, a l’exception de RPA, puis la synthese d’une nouvelle portion de brin est realisee par les proteines RFC (proteine de replication), RPA et par les DNA-polymerases ou . La restauration de la continuite du brin d’ADN est e ectuee par l’action de la DNA-ligase 1 [Reardon et Sancar, 2005].

< Proliferating cell nuclear antigen >

< Flap endonuclease 1 >

Le MMR (< mismatch repair >)

La reparation des mesappariements est initiee par la reconnaissance d’un defaut dans la structure de la double helice d’ADN par le complexe MSH2{MSH6 (homologue de la proteine bacterienne MutS ) ou par la reconnaissance d’une boucle formee suite a la deletion ou a l’ajout de nucleotides sur l’un des deux brins par le complexe MSH2{MSH3 (homologue de la proteine bacterienne MutS).

REPARATION DE L’ADN

Cette reconnaissance provoque le recrutement du complexe homologue de la proteine bacterienne MutL, formee par les proteines MLH1 et PMS1. Le complexe homologue de MutL a ensuite lui-m^eme pour fonction de recruter les proteines qui vont permettre de prendre en charge le dommage : des nucleases (telles que la nuclease EXO1) pour exciser le fragment d’ADN endommage, des DNA-polymerases (telles que la polymerase ) pour syn-thetiser la nouvelle portion du brin remplacant le fragment excis et la DNA-ligase 1 a n de permettre de retablir les liaisons phosphodiester entre les nucleotides de part et d’autre des coupures.

Il est interessant de noter que le MMR est un mecanisme impliquant ses propres senseurs des dommages, mais qu’il fait intervenir des machineries moleculaires egalement impliquees dans les mecanismes d’excision de base et de nucleotide decrits ci-dessus.

La HR (< homologous recombination >)

Les cassures double brin sont parmi les cassures les plus dangereuses et ont la particularite de n’^etre pas immediatement reparables par emploi d’une quelconque homologie, contrairement a nombre de mecanismes decrits plus haut. A n de realiser une reparation dele des dommages en utilisant la complementarit des paires de bases, il est necessaire, lorsque cela est possible, d’exploiter l’information contenue dans la chromatide s ur au moment de la replication du chromosome. La voie de reparation par recombinaison homologue (HR) utilise la chromatide s ur pour reparer des cassures double-brin en phases S et G2 du cycle cellulaire (Figure 1.5, page suivante).

La recombinaison homologue est initiee par la generation d’un ADN simple-brin 3’ sortant a partir du site de la cassure double-brin. Cette etape, dite de resection est initiee par le complexe MRN (constitue des proteines Mre11, Rad50 et Nbs1) ainsi que l’endonuclease CtIP (cette derniere proteine est speci que de la phase S) et pourrait ^etre en partie contr^olee par BRCA1 [Germani et al., 2003]. La resection est ensuite ampli ee par l’activite exonuclease de 5’ vers 3’ de Exo1 a n d’augmenter la taille de la region simple-brin. RPA recouvre le fragment simple-brin ainsi expos et le protege de l’action des nucleases, puis elle en est chassee par la proteine Rad51 qui initie de maniere irreversible la reparation par recombinaison homologue et provoque l’invasion de brin [Krejci et al., 2012]. Ce brin d’ADN, recouvert par Rad51 est alors place en vis-a-vis de sa sequence homologue situee sur la chromatide s ur du chromosome. L’action des proteines BRCA2 et Rad52 est necessaire pour deplacer RPA et permettre la recherche de la region homologue et la formation d’une boucle permettant au brin d’ADN recouvert par Rad51 de s’y xer. Les extremites 3’ des coupures sont alors allongees par des DNA-polymerases en se servant des deux brins de la chromatide s ur comme matrice. Les jonctions de Holliday formees par le croisement des brins sont resolues par des nucleases speci ques, appelees resolvases, ainsi que par des helicases (appartenant a la famille RecQ). En n, la DNA-ligase 1 restaure la continuite des deux brins d’ADN.

NHEJ < non homologous end joining >

Il n’est pas toujours possible d’utiliser une sequence complementaire de la sequence endommagee pour reparer delement les cassures double-brin de l’ADN. C’est notamment le cas pendant les phases du cycle cellulaire durant lesquelles les chromosomes ne sont pas encore dupliques (phases M, G1 et debut de la phase S). A n de reparer les cassures double-brin hors phase S/G2, les cellules font intervenir un processus de jonction des extremites, et cela independamment de la sequence (NHEJ, Figure 1.5, page ci-contre) Lieber [2010]; Mahaney et al. [2009]. Le mecanisme NHEJ est potentiellement actif a chaque etape du cycle cellulaire et il constitue donc la voie de reparation par defaut des cassures double-brin dans l’ADN, et la seule voie possible pour les cellules qui ne se divisent pas [Iyama et Wilson, 2013]. Ce mecanisme implique toujours une etape ultime : la ligation des extremites liberees par la cassure double-brin. Comme aucune homologie de sequence ne vient abiliser le processus d’aboutement, le NHEJ peut occasionner des erreurs par ligation d’extremites appartenant, par exemple, a deux chromosomes di erents. La abilite de ce mecanisme, longtemps remise en doute, semble cependant acceptable lorsque la quantite de dommages n’est pas trop importante [Betermier et al., 2014].

La voie NHEJ de reparation des cassures double-brin est importante car les cassures double-brin sont les plus dangereuses pour les cellules : elles provoquent une rupture de la continuite chromosomique, des translocations et des deletions qui induisent a terme l’apparition de cancers. A n de permettre la reparation des lesions, le cycle cellulaire est interrompu des que la cellule en detecte un nombre su sant, ce qui permet d’exclure du site du dommage toute machinerie qui ne soit pas utile a la reparation, comme celles de la replication ou de la transcription, par exemple. Lorsque la cellule detecte que le nombre de dommages est tellement important qu’elle ne sera pas a m^eme de tout reparer avant la reprise du cycle cellulaire, elle peut choisir la voie de l’apoptose, la mort cellulaire programmee. La signalisation moleculaire, qui consiste a informer la cellule dans son ensemble des qu’une lesion de l’ADN a et percue, est donc un processus complexe qui rapproche des proteines de di erentes voies en des complexes non covalents transitoires. On peut citer ici les proteines de signalisation a proprement parler : d’abord les proteine-kinases, ensuite les proteines de < checkpoint >, mais aussi les proteines qui regulent le niveau de compaction de la chromatine, par exemple. Un certain nombre des proteines citees ci-dessus ont et identi ees par spectrometrie de masse au cours de nos experiences et font l’objet de ches individuelles descriptives en annexe (voir annexe < Fiches relatives aux proteines d’inter^et >, page 153).

L’heterodimere KU (constitue des sous-unites Ku70 et de Ku80, connues egalement sous les noms de XRCC6 et de XRCC5) possede une a nite tres importante pour les extremites de l’ADN (avec un Kd de l’ordre de 1010 M) autour desquelles il forme un anneau [Walker et al., 2001]. Ce complexe, abondant dans les noyaux (il a et estim a 105 le nombre de molecules de ce dimere dans une cellule), est le premier de la voie du NHEJ a se xer au niveau des extremites de la cassure double-brin. KU est le domaine regulateur de la sous-unite catalytique de la proteine kinase ADN-dependante (DNA-PKcs) (voir PRKDC, page 177). Lorsque le complexe ternaire est forme, l’enzyme est sous sa forme holoenzyme. PRKDC appartient a la m^eme famille que les proteines ATM et ATR (phosphatidylinositol 3-kinases), elles-m^emes impliquees dans la signalisation des dommages de l’ADN (voir paragraphe 1.4, page 26) [Falck et al., 2005]. Elle est capable de se xer seule sur les extremites libres de l’ADN mais son interaction avec KU augmente son a nite pour l’ADN [Uematsu et al., 2007].

La xation de PRKDC sur le dimere KU provoque le glissement ATP-dependant, sur une dizaine de paires de bases, de ce dernier le long de la sequence nucleotidique, ce qui permet de liberer l’extremit d’ADN qu’il protegeait. Ces extremites peuvent alors ^etre prises en charge par des enzymes de traitement des extremites. On peut distinguer deux types de proteines impliquees dans le traitement des extremites : les nucleases, qui permettent de generer une nouvelle extremite, canonique, et les enzymes qui permettent la conversion des groupements chimiques, telles que PNKP par exemple, qui permet de regenerer une extremit 5’ phosphate a partir d’une extremit 5’ OH et/ou de generer une extremit 3’ OH a partir d’une extremit 3’ phosphate. Les regions simple-brin qui peuvent ^etre mises en evidence, s’il y a un debut de resection lors du NHEJ, sont prises en charge par les DNA-polymerases et , apres appariement | simple ou partiel | avec le brin complementaire. Lorsque la nature des extremites est compatible avec une ligation, PRKDC e ectue la synapsis des deux extremites a liguer, et un complexe de ligation est recrut pour reparer la cassure. Ce complexe est constitue de la DNA-ligase 4 [DNLI4 (p 161)], de XRCC4 (p 189) et de XLF (p 193) (pour cette derniere, voir Ahnesorg et al. [2006]; Buck et al. [2006]). Le r^ole de XLF dans ce complexe serait d’augmenter la processivit de DNLI4, alors que le r^ole de XRCC4 est de stabiliser la ligase 4 sur le complexe deja assembl au niveau des extremites a liguer.

NHEJ < alternatif >

Le processus de reparation selon la voie NHEJ decrite ci-dessus a long-temps et consider comme l’unique voie possible pour la reparation des cassures double-brin qui ne soit pas la recombinaison homologue. Une voie, dite < alternative >, a cependant et caracterisee plus recemment (Figure 1.5, page 14). En e et, des etudes ont permis d’observer, dans des cellules de-cientes en PRKDC, que la reparation des cassures double-brin pouvait toujours avoir lieu en dehors des phases G2 et S du cycle cellulaire, mais de facon tres ralentie [DiBiase et al., 2000]. Des etudes plus approfondies ont con rme que la reparation observee dans ces conditions etait independante des proteines de la recombinaison homologue et ont permis de mettre en evidence l’existence de cette voie alternative au NHEJ < canonique >, qui aurait lieu de maniere independante de KU et de la DNA-ligase 4 (pour une revue voir Rass et al. [2012]).

Les proteines de cette voie de reparation sont les proteines PARP1 (p 175), XRCC1 (p 189) et la DNA-ligase 3 (DNLI3, p 161), qui sont par ailleurs impliquees dans la reparation des cassures simple-brin de l’ADN par la voie du BER (voir plus haut). Il est egalement possible que l’activite de ligation soit portee par la DNA-ligase 1. Ce mecanisme de reparation peut egalement faire intervenir des enzymes impliques dans le traitement des extremites (Figure 1.5, page 14), lorsque la structure de ces dernieres n’est pas compatible avec une ligation directe (Figure 1.7, page 22). La voie de reparation alternative du NHEJ est egalement parfois appelee MMEJ (< micro-homology mediated end-joining >) en raison de l’utilisation d’une homologie inferieure a une vingtaine de paires de bases a n de realiser la synapsis des deux extremites a liguer. Cette homologie est revelee par l’activite exonuclease du complexe MRN, en association avec CtIP et BRCA1 (qui sont des proteines de la recombinaison homologue ; voir plus haut) [Rass et al., 2012; Zhang et Jasin, 2011].

Les deux voies du NHEJ coexistent dans les cellules eucaryotes. Les proteines impliquees dans la reconnaissance des dommages, pour chacune de ces deux voies (KU pour la voie canonique et PARP1 pour la voie alternative) sont en competition.

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Table des matières

1 Introduction
1.1 Les origines des dommages de l’ADN
1.1.1 M´ecanismes impliquant des coupures de l’ADN
1.1.1.1 La m´eiose
1.1.1.2 V(D)J et recombinaison de conversion de classe
1.1.2 Facteurs endog`enes toxiques pour l’ADN
1.1.2.1 Les produits secondaires du m´etabolisme
1.1.2.2 Les dysfonctionnements enzymatiques
1.1.3 Facteurs exog`enes toxiques pour l’ADN
1.2 R´eparation de l’ADN
1.2.1 Le BER (< base-excision repair >)
1.2.2 Le NER (< nucleotide excision repair >)
1.2.3 Le MMR (< mismatch repair >)
1.2.4 La HR (< homologous recombination >)
1.2.5 NHEJ < non homologous end joining >
1.2.6 NHEJ < alternatif >
1.2.7 Conclusions
1.3 Choix de la voie de r´eparation
1.3.1 R´egulation des diff´erentes voies de r´eparation
1.3.1.1 Le niveau de diff´erenciation cellulaire
1.3.1.2 La phase du cycle cellulaire
1.3.1.3 La nature chimique des extr´emit´es
1.3.1.4 Le contexte chromatinien de la l´esion
1.3.2 R^ole des trois ligases humaines dans les m´ecanismes de jonction
1.3.3 Signatures mol´eculaires des voies de r´eparation
1.3.4 Choix de la voie de r´eparation
1.3.4.1 Equilibre entre HR et NHEJ ´
1.3.4.2 Equilibre entre les voies du NHEJ canonique ´ et alternatif
1.3.4.3 Hi´erarchie des m´ecanismes mis en jeu
1.3.5 Quels enjeux du choix de la voie de r´eparation ?
1.4 La r´eponse int´egr´ee aux dommages de l’ADN
1.4.1 D´etection des dommages et transduction du signal
1.4.1.1 D´etection des CDB dans le NHEJ canonique
1.4.1.2 D´etection des CDB dans le NHEJ alternatif
1.4.1.3 D´etection des CDB dans la HR
1.4.2 Remodelage de la chromatine
1.4.3 Cycle cellulaire et apoptose
1.5 R´eparation et th´erapie anticanc´ereuse
1.5.1 Irradiation des cellules tumorales
1.5.2 Exploitation des d´efauts des cellules tumorales
1.6 Etude des interactions prot´eine{ADN ´
1.6.1 M´ethodes d’´etude in vivo
1.6.1.1 ChIP < chromatin immunoprecipitation >
1.6.1.2 Double et triple hybride
1.6.2 In silico
1.6.3 M´ethodes d’´etude in vitro
1.6.3.1 EMSA (< electrophoretic mobility shift assay >)
1.6.3.2 Empreinte aux endonucl´eases
1.6.3.3 Puces `a ADN
1.6.3.4 Southwestern blot
1.6.3.5 Purification par affinit´e
1.6.4 Conclusion
2 Mat´eriels et m´ethodes
2.1 Tampons pour les phases chromatographiques
2.2 Pr´eparation des phases chromatographiques
2.2.1 Pr´eparation du mat´eriel nucl´eique
2.2.1.1 Synth`ese des oligonucl´eotides par PCR
2.2.1.2 Purification des produits de PCR
2.2.2 Constitution des phases chromatographiques
2.3 V´erification de la phase chromatographique contr^ole
2.4 Tampons pour la purification des prot´eines
2.5 Purification de complexes nucl´eoprot´eiques
2.5.1 Etape de purification ´
2.5.2 Le photoclivage UV
2.6 S´eparations ´electrophor´etiques
2.6.1 Tampons pour les ´electrophor`eses et solutions pour les colorations
2.6.2 Electrophor`ese en conditions natives : ´ migration et coloration des gels
2.6.2.1 La migration ´electrophor´etique en BN PAGE 53
2.6.2.2 La coloration analytique des gels
2.6.2.2.1 La coloration `a l’argent
2.6.2.2.2 La coloration au bleu de Coomassie collo¨ıdal
2.6.3 Electrophor`ese en conditions d´enaturantes : ´ migration et coloration des gels
2.6.3.1 La migration ´electrophor´etique d´enaturante 55
2.6.3.2 La coloration au SYPRO
2.7 Exp´erience d’empreinte aux nucl´eases
2.8 S´equen¸cage de l’ADN des complexes
2.9 Activit´e de ligation des complexes purifi´es
2.9.1 Ligation par les extraits nucl´eaires bruts
2.9.2 Ligation avec des complexes purifi´es
2.9.2.1 Ligation avec des complexes purifi´es attach´es aux billes
2.9.2.2 Ligation en l’absence de supports chromatographiques
2.10 Spectrom´etrie de masse
3 R´esultats
3.1 Un syst`eme chromatographique int´egr´e
3.1.1 Production des d´eterminants d’affinit´e par PCR
3.1.2 Purification des produits de PCR
3.1.3 Constitution des phases chromatographiques
3.1.4 Contr^ole de la qualit´e des phases produites
3.1.5 Elimination du support chromatographique ´
3.2 Purification de prot´eines de r´eparation
3.2.1 Electrophor`ese en conditions natives ´
3.2.1.1 Les bandes contiennent des complexes multiprot´eiques
3.2.2 Points techniques critiques
3.2.3 Etude qualitative des produits de purification ´
3.2.3.1 Les complexes visualis´es comportent-ils de l’ADN ?
3.2.3.2 Quelle est la topologie des complexes nucl´eoprot´eiques ?
3.2.3.3 Les complexes sont-ils sp´ecifiques des extr´emit´es de l’ADN ?
3.2.4 Etude fonctionnelle des produits de purification ´
3.2.4.1 Ligation par les complexes encore sur les billes 90Biochimie analytique des complexes de ´ eparation de l’ADN
3.2.4.2 Ligation par les complexes d´etach´es des billes
3.2.4.3 R´eflexions sur les exp´eriences de ligation
3.3 Analyses par spectrom´etrie de masse
3.3.1 R´epartition fonctionnelle (en nombre)
3.3.2 R´epartition fonctionnelle (en quantit´e)
3.3.3 Comparaison des bandes obtenues sur phase
3.3.3.1 Prot´eines exclusives d’une bande donn´ee
3.3.3.1.1 La m´ethode de calcul en moyenne < totale >
3.3.3.1.2 La m´ethode de calcul en moyenne < restreinte >
3.3.3.1.3 Les prot´eines d´esign´ees comme exclusives de la bande `a 720 kDa
3.3.3.1.4 Les prot´eines d´esign´ees comme exclusives de la bande `a 480 kDa
3.3.3.1.5 L’analyse des prot´eines exclusives de la bande `a 240 kDa
3.3.3.1.6 Les prot´eines exclusives de la bande < asp´ecifique >
3.3.3.2 Analyse de la r´epartition des prot´eines de r´eparation dans les quatre bandes
3.3.3.2.1 Interactions prot´eine{prot´eine
3.3.3.2.2 Sp´ecialisation fonctionnelle des complexes
3.3.4 Comparaison des bandes obtenues sur phase /
3.3.4.1 Prot´eines sp´ecifiques de la phase , bande `a 720 kDa
3.3.4.2 Prot´eines sp´ecifiques de la phase , bande `a 480 kDa
3.3.4.3 Prot´eines sp´ecifiques de la phase , bande `a 240 kDa
3.3.4.4 Prot´eines sp´ecifiques de la phase , bande asp´ecifique
3.3.5 Conclusions sur la fouille des donn´ees
3.3.5.1 R´epartition des prot´eines dans les bandes `a diff´erents poids mol´eculaires (phase )
3.3.5.1.1 Caract`ere significatif des assemblages non covalents tels qu’ils sont r´esolus sur gel
3.3.5.1.2 Recherche de prot´eines < exclusives > d’une bande donn´ee
3.3.5.1.3 Abondance relative des prot´eines de r´eparation dans les diff´erentes bandes des pistes
3.3.5.2 R´epartition des prot´eines dans les produits de purification sur phases et (par poids mol´eculaire)
3.3.5.3 Tableau r´ecapitulatif de toutes les donn´ees de masse
4 Conclusions & discussion | Perspectives
4.1 Conclusions & discussion
4.1.1 Coexistence de trois voies de r´eparation de l’ADN
4.1.2 Activit´e des complexes des diff´erentes bandes
4.1.3 Recherche de nouvelles prot´eines de r´eparation
4.1.3.1 Pr´esentation de prot´eines < candidats >
4.1.3.2 Strat´egies d’´etude des prot´eines candidats
4.1.4 Comment envisager l’identification de nouvelles prot´eines candidats ?
4.1.5 Certaines prot´eines sont absentes, pourquoi ?
4.2 Perspectives
4.2.1 Les dommages `a chimie complexe
4.2.2 Les sites `a dommages multiples
5 Annexes
Fiches relatives aux prot´eines d’int´er^et
5.0.3 Prot´eines r´ev´el´ees par la fouille des donn´ees
5.0.4 Prot´eines comment´ees dans le chapitre < R´esultats >
Fiches relatives aux prot´eines comment´ees
Manuel de l’utilisateur du logiciel dsbRepair (anglais)
5.1 Introduction
5.2 Getting the software and installing it
5.3 Overview of the biochemical experiments
5.4 General overview of the graphical user interface
5.4.1 The main window
5.4.2 The results window
5.4.3 The history window
5.4.4 The console window
5.4.5 Common features
5.5 Various calculations using sample lists
5.5.1 The three general procedures available
5.5.1.1 List exclusive proteins
5.5.1.2 Ratio of calculated values
5.5.1.2.1 Example with a Sum-based computation
5.5.1.2.2 Example with Mean total-based computation
5.5.1.2.3 Example with Mean restricted-based computation
5.5.1.3 Calculation on ratio values
5.5.2 Specific handling of the sample units
5.5.3 Global options
5.6 User-crafted custom SQL queries
5.6.1 Crash course in SQL SELECT queries
5.7 Appendix