Mécanismes immuno- pathologiques de la para-tuberculose

Culture bactériologique sur échantillon de lait individuel

Il y a peu d’études rapportant l’utilisation de la culture sur échantillon de lait individuel. Cependant, Pillai et Jayaro (2002) estiment que le seuil de détection se situe entre 10-100 UFC/mL. Ils estiment aussi que la culture détecte 10 fois moins de troupeaux infectés que la qPCR sur cette même matrice (respectivement 6% et 68%). Cela s’explique par le fait que la culture permet de détecter uniquement les bactéries vivantes capables de se multiplier, et que la présence de Map dans le lait est majoritairement due à une contamination par les matières fécales (Sweeney et al., 1992) De plus, ce défaut de détection peut être imputable aux difficultés d’adaptation des protocoles de coproculture à la matrice lait. Ainsi Slana et al. (2008) suggère un protocole avec au moins deux centrifugations (4200 g pendant 45 minutes, et 1400 g pendant 10 minutes) pour augmenter la concentration de Map dans l’inoculum d’ensemencement.

En 2013, l’étude de Bradner et Robbe Autermann recommande une décontamination durant 15 min avec une solution à 1,5% de N-acétyl L-cysteine hydroxyde de sodium (NALC-NaOH), suivie d’une culture en milieu liquide Bactec 12B® médium (comparé au Para-JEM) qui montre une meilleure croissance de Map qu’une décontamination avec l’hexadecylpyridinium (HPC) habituellement utilisée.

Culture à partir de prélèvements tissulaires

Actuellement peu de données sont disponibles sur les caractéristiques de cette méthode. Cependant, l’étude de Huda et al. (2003) estime que la sensibilité est de 100% chez des animaux en phase clinique. Cette méthode apparait néanmoins comme plus sensible qu’une coproculture standard, que la bactérioscopie ou l’immunohistochimie (Pradhan et al., 2011), et sa spécificité est proche de 100 %. Chez les ovins, la méthode est également décrite comme la plus sensible pour détecter précocement l’infection (avant 12 mois post-infection) sur des animaux naturellement exposés, comparé au test IDR (intrademo réaction), le test interféron, la coproculture et l’histopathologie (Reddacliff et al., 2004).

Tests immuno-enzymatiques ou ELISA

L’ELISA (Enzyme Liked Immunosorbent Assay) est une technique de détection des anticorps spécifiques d’un agent pathogène, couplée à une réaction colorée permettant la révélation de la détection.

Dans le cas de la paratuberculose bovine, la séroconversion n’a pas lieu avant 12 à 15 mois, et débute souvent quelques mois avant l’apparition des premiers symptômes. L’ELISA permet donc la détection de certains infectés asymptomatiques non excréteurs, des infectés symptomatiques excréteurs et des infectés en phase clinique (avant l’apparition de la phase d’anergie immunitaire qui est probablement rare).

L’ELISA est utilisé pour le diagnostic à l’échelle individuelle ou à l’échelle du troupeau. Son coût est beaucoup moins élevé que celui de la qPCR.

ELISA sur sérum individuel

Le protocole consiste à mettre en contact le sérum à tester avec des antigènes de Map fixés dans les puits d’une microplaque. Il y a alors formation de complexes immuns spécifiques de Map. Les anticorps non fixés (c’est-à-dire qui n’ont pas reconnu Map) sont alors éliminés par un lavage. Des anticorps spécifiques des anticorps de ruminants ou de la protéine A, couplés à une enzyme sont ensuite ajoutés dans les puits et vont se fixer aux complexes immuns préalablement formés. Après lavage, le substrat enzymatique est ajouté et l’intensité de la coloration, c’est-à-dire la densité optique (DO) est mesurée. Le résultat de l’ELISA est exprimé sous la forme d’un rapport signal de l’échantillon sur signal du contrôle positif (S/P), qui est le rapport entre la densité optique de l’échantillon testé (sample « S ») et celui d’un échantillon contrôle (positif « P »). Les résultats sont ensuite interprétés en résultats positifs ou négatifs selon une valeur seuil choisie au préalable.

PARTIE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. CARACTERISTIQUES DE LA PARATUBERCULOSE
1.1. Caractéristiques biologiques de l’agent Mycobacterium avium subsp paratuberculosis (Map)
1.1.1. Réceptivité des animaux
1.1.2. Matières virulentes et voies de transmission
1.2. Mécanismes immuno-pathologiques de la paratuberculose
1.2.1. Evolution des réponses immunitaires au cours de l’infection
1.2.1.1. Réponse immunitaire à médiation cellulaire
1.2.1.2. Modification du profil de réponse
1.2.2. Remise en cause du modèle classique d’évolution de la réponse immunitaire vis-à-vis de Map
1.3. Nature et évolution de l’excrétion fécale
1.3.1. Excréteurs transitoires
1.3.2. Intensité de l’excrétions
1.3.3. Notion de super-excréteur
1.3.4. Dose infectante
1.3.5. Notion d’excrétion passive
1.3.6. Classification selon Nielsen et Toft (2008)
1.4. Stades de la maladie
1.5. Lésions tissulaire
2. EXAMENS DE LABORATOIRE POUR LE DIAGNOSTIC DE LA PARATUBERCULOSE
2.1. Valeur informative des tests utilisés
2.1.1. Test de référence ou Gold standard (Toma, 2001)
2.1.2. Sensibilité
2.1.3. Spécificité
2.1.4. Valeurs prédictives
2.1.5. Prévalence intra-troupeau
2.1.6. Prévalence des troupeaux infectés
2.2. Facteurs de variations de la sensibilité et de la spécificité des tests
2.3. Techniques de laboratoire pour la détection directe de Map
2.4. Tests pour la détection de la réaction immunitaire vis-à-vis de Map
2.4.1. Tests immuno-enzymatiques ou ELISA
2.4.2. Tests pour la détection de la réaction immunitaire à médiation cellulaire
2.5. Intérêt de l’utilisation des tests de mélange ou environnementaux
2.6. Intérêts de l’utilisation combinée des tests
2.7. Méthodes de classification actuelles
PARTIE 2 : ETUDE EXPERIMENTALE 
1. CONTEXTE ET OBJECTIFS DE L’ETUDE
2. MATERIELS ET METHODES
2.1. Troupeaux et animau
2.1.1. Inclusion des troupeaux dans l’étude
2.1.2. Inclusion d’un troupeau avec de la paratuberculose clinique endémique
2.2. Questionnaire adressé aux éleveurs
2.3. Période d’étude et collecte des échantillons
2.4. Techniques de laboratoire
3. RESULTATS
3.1.1. Tests de détection directe de Map par qPCR et par coproculture de mélange
3.1.2. Tests sérologiques par ELISA
3.1.3. Test IFN-γ
3.2. Résultats obtenus dans les troupeaux A et B supposés indemnes durant la première période (1er semestre 2013)
3.3. Résultats au sein des troupeaux supposés indemnes de paratuberculose lors des tests de Janvier 2014
3.4. Evolution des résultats (Janvier 2013 – Janvier 2014) au sein des troupeaux supposés indemnes
3.5. Résultats quantitatifs obtenus en ELISA dans les quatre troupeaux en Janvier 2014
4. DISCUSSION
4.1. Recrutement des élevages et des animaux pour l’évaluation des trousses sérologiques
4.2. Formulation d’hypothèses à partir des réponses au questionnaire
4.3. Méthodes directes de détection Map
4.4. Méthodes de recherche indirecte de l’infection par Map
CONCLUSION 
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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