Mécanismes de transport d’anions dans les cellules végétales

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Principe de fonctionnement de clopHensor

ClopHensor est un biosenseur ratiométrique par excitation, cela implique que plusieurs longueurs d’onde d’excitation sont nécessaires pour les mesures de pH et de concentration en anions. Ce biosenseur fonctionne selon un système d’extinction statique de la fluorescence, c’est-à-dire que l’intensité de la fluorescence change en fonction des interactions du biosenseur avec des ions, dans le cas de clopHensor, le chlorure, le nitrate et les protons. Les deux fluorophores de clopHensor sont espacés l’un de l’autre d’une distance supérieure à 10 nm et leurs spectres d’excitation et d’émission ne présentent pas de recouvrement. De ce fait, clopHensor n’est pas un senseur de type FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Ce biosenseur est génétiquement codé et peut donc être exprimé de manière ubiquitaire ou dans un type cellulaire spécifique. Ce biosenseur est particulièrement intéressant car il permet la mesure de deux paramètres en simultané, d’une part la concentration en anions et d’autre part les variations de pH dans le cytosol. Deux informations importantes puisque les flux d’anions sont souvent corrélés avec les flux de protons, dans le cas de transporteurs actifs comme les antiports et les symports (Felle, 2001). ClopHensor est un dimère composé de deux chromophores, une DsRed liée à une E2GFP (Schéma 1-1). Seule l’E2GFP est capable d’interagir avec les protons et les anions selon les réactions représentées dans le Schéma 1-1 et 1-2. Lorsque les anions ou les protons interagissent avec celle-ci, cela induit une extinction de la fluorescence émise. La DsRed en revanche n’est capable de lier ni les anions ni les protons. Cette dernière permet de normaliser l’intensité de fluorescence émise détectée avec le niveau d’expression de clopHensor dans le compartiment cytosolique.
Schéma 1-1. Représentation de clopHensor et des longueurs d’onde d’excitation utilisées adapté de Arosio et al., 2010).
Schéma 1-2. Représentation des réactions acido-basique et de dissociation des anions de clopHensor (adapté de Arosio et al. 2007; Bregestovski 2011).
La caractérisation de l’E2GFP de clopHensor par Bizzarri et Arosio, a permis d’identifier un point isobestique. Ce point correspond à une valeur de mesure, ici une longueur d’onde pour laquelle un chromophore, dans ce cas l’E2GFP, est insensible aux variations de pH. Ce point isobestique a été identifié pour la longueur d’onde d’excitation à 458 nm (Fig. 1-3). En effet, à cette longueur d’onde d’excitation de 458 nm, l’intensité de la fluorescence de l’E2GFP a la même valeur aux différents pH testés (Fig. 1-3).
Figure 1-3. Spectre d’excitation sur extrait de protéine de clopHensor à différents pH et à une émission fixée à 590nm. (adaptée de Arosio et al. 2010)
ClopHensor étant un biosenseur ratiométrique par excitation, trois longueurs d’onde d’excitation sont nécessaires pour obtenir les informations pH et de concentration en anions.
L’E2GFP est excitée aux longueurs d’onde d’excitation 488 et 458 nm, la fluorescence émise est détectée entre 500 et 550 nm et la DsRed est excitée à 561 nm et l’émission est détectée entre 600 et 625 nm (Schéma 1-1).
L’intensité de fluorescence détectée après excitation à 488 nm comprend à la fois l’information du pH et de la concentration en anions, tandis que la fluorescence émise après excitation à 458 nm contient seulement l’information de la concentration en anions. Le ratio pH, appelé RpH de l’équation (1-1), des intensités récoltées par l’excitation de l’E2GFP aux deux longueurs d’onde d’excitation 488 et 458 nm permet d’isoler l’information sur le pH.
L’information concernant la concentration en anions est obtenue par le ratio anion RAnion de l’équation (1-2), comprenant les intensités de fluorescence détectées en réponse à l’excitation à 458 et 561 nm. La fluorescence détectée résultant de l’excitation à 561 nm reflète la concentration du biosenseur dans le cytosol et sert alors de facteur de normalisation.
L’obtention des valeurs pH et concentration en anion est obtenue en utilisant les équations (1-3), (1-4) et (1-5). Ces équations d’Arosio et al. 2010 ont été elles-mêmes établies à partir des équations de Grynkiewicz (Grynkiewicz, Poenie, and Tsien 1985). Ces équations peuvent être utilisées seulement dans le cas où le senseur forme un complexe 1:1 (analyte:senseur), qu’il fonctionne de la même manière in vivo et in vitro et que l’intensité de la fluorescence soit proportionnelle à la concentration du senseur (Grynkiewicz, Poenie, and Tsien 1985). La première équation (1-3) permet de calculer le pH dans le cytosol à partir des intensités de fluorescence détectées avec les deux longueurs d’onde d’excitation, 488 et 458nm.
Plusieurs paramètres sont à déterminer par calibration du senseur, tels que le pKa du senseur ainsi que les deux valeurs extrêmes, Racide (minimum), Rbasique (maximum), ces ratios pH correspondent aux formes respectivement protonées et déprotonées de clopHensor. Le pKa de clopHensor a été mesuré à 6,8 rendant ce biosenseur intéressant pour des mesures in vivo dans le compartiment cytosolique (Bizzarri et al., 2006; Arosio et al., 2010; Arosio et al., 2007). De cette formule, il en découle une deuxième pour obtenir la constante de dissociation de clopHensor pour les anions en fonction du pH (Equation 1-4). En effet, l’état protoné du chromophore a une influence sur son affinité pour les anions. Lorsque clopHensor est protoné, à pH acide, son affinité pour les anions augmente et inversement lorsque celui-ci est déprotoné, à pH basique, l’affinité aux anions est diminuée.
C’est seulement, une fois la valeur du Kd(pH) connue que la concentration peut être calculée, au moyen de l’équation (1-5).

Obtention des paramètres biochimiques de clopHensor in vitro : billes de sépharose

La connaissance des caractéristiques biochimiques de clopHensor (chapitre 1, 1.1) est essentielle pour le calcul du pH et de la concentration en anions in vivo dans les compartiments cellulaires dans lesquels clopHensor, une fois exprimé est adressé. A cette fin, deux approches ont été utilisées, une in vitro, au moyen de billes de sépharose et une autre in vivo sur un type cellulaire en présence d’ionophores.

Des billes de sépharose comme système de mesure in vitro

Les caractéristiques biochimiques de clopHensor ont été déterminées in vitro, sur des billes de sépharose. Les billes de sépharose, comme système de mesure in vitro, présentent l’intérêt de déterminer les paramètres biochimiques de clopHensor en utilisant le même système optique pour l’acquisition des données in vitro que lors des mesures in vivo.
Ces billes possèdent à leur surface l’épitope Strep-Tactin® qui reconnaît spécifiquement le Strep-tag. Pour cela, la protéine de clopHensor avec un strep-tag en position N-terminale est exprimée en bactéries E. coli en utilisant un système d’expression inductible avec de la tétracycline. Le strep-tag en position N-terminale est reconnu par l’épitope présent sur les billes de sépharose et permet de fixer clopHensor à leur surface (Schéma. 1-3, A). Les billes de sépharose sont préalablement rincées dans une solution contenant 100 mM Tris-H2SO4 (pH 8) ; 50 mM (NH4)2SO4 ; 1 mM EDTA, durant la nuit. Puis, ces billes sont ensuite incubées, également sur la nuit, en présence de l’extrait protéique d’E. coli contenant la protéine recombinante clopHensor afin qu’elles fixent celles-ci à leur surface (Schéma 1-3, B). Par la suite, afin de pouvoir effectuer la caractérisation des paramètres biochimiques de clopHensor, les billes présentant clopHensor à leur surface sont placées dans différentes solutions dites de calibration. Ces solutions de calibration ont un pH et une concentration en anions fixés aux valeurs choisies pour les mesures (Schéma 2-1, C).
Schéma 1-3. Les billes de sépharose un outil de calibration in vitro. A. Représentation de clopHensor avec le Strep-tag (en noir) en position N-terminale, les cylindres vert et rouge symbolisent respectivement l’E2GFP et la mDsRed. B. Représentation d’une bille de sépharose (cercle gris) avec les épitopes à sa surface et les protéines clopHensor dont le Strep-tag est fixé dessus. C. Image prise au confocal SP8 droit d’une bille de sépharose dans un milieu à pH 7 avec 60mM sulfate d’ammonium et 10mM Bis Tris Phosphate (BTP), en lumière transmise, par excitation à 561 nm (mDsRed) et émission à 600-625 nm, excitation à 488 et 458 nm (E2GFP) et émission récoltée entre 500-550 nm (échelle : 50 μm).
Nous avons effectué l’acquisition des images en mode séquentiel, c’est-à-dire que chaque bille a été imagée aux trois longueurs d’onde d’excitation nécessaires à clopHensor. Nous avons utilisé cet ordre d’acquisition, 561, 488 et 458 nm avec la fenêtre de longueurs d’onde d’émission respectives 600-625 et 500-550 nm (Fig. 1-3, B). Lors des mesures nous avons choisi des billes de sépharose de tailles similaires présentant un diamètre d’environ 130 μm.
Ces billes de sépharose étant de forme sphérique, toute leur surface n’est pas exposée au laser de manière uniforme. Afin de limiter l’influence de la géométrie des billes sur la mesure de fluorescence, le plan focal a été ajusté proche de la surface supérieure des billes permettant de maximiser l’exposition au laser d’excitation sur la surface ayant fixé les protéines recombinantes de clopHensor. De ce fait, on maximise le signal fluorescent émis afin d’améliorer la précision de la quantification du signal (Fig. 1-3, A). Malgré toutes les précautions au niveau de l’analyse, il a fallu déterminer une région présentant un signal fluorescent non affecté par la forme et suffisamment intense pour la mesure de l’intensité de la fluorescence. Les profils d’intensité de fluorescence détectée en fonction du diamètre de la bille de sépharose examinée aux trois longueurs d’onde d’excitation utilisées montrent qu’en son centre l’intensité est maximale et atteint un plateau alors que sur ses bords l’intensité décroit (Fig. 1-3, C, D et E). Cette région centrale a été définie d’une surface de 45×45 μm (Fig. 1-3, B). La mesure des intensités de fluorescence se fait donc dans la région centrale des billes afin de mesurer un signal fluorescent homogène avec une intensité maximale (Fig. 1-3, C, D et E)).
Figure 1-3. Acquisition et analyse de la fluorescence émise par clopHensor fixé à la surface de billes de sépharose. A. Représentation du plan focal (ligne en pointillés) lors de l’acquisition des images sur les billes de sépharose avec un microscope confocal SP8 droit. B.
Région choisie (symbolisée par un carré) pour la mesure des intensités récoltées aux trois longueurs d’excitation utilisées, respectivement 561, 488 et 458 nm. C, D et E. Graphiques représentant les intensités de fluorescence mesurées sur le diamètre d’une bille aux différentes longueurs d’onde d’excitation, respectivement 561, 488 et 458 nm.

Mesure des paramètres biochimiques de clopHensor liés au pH

Le point de départ de ce travail, a consisté à comparer les données que nous avons obtenues avec celles de travaux antérieurs dans des systèmes in vitro (Bizzarri et al., 2006; Arosio et al., 2007; Arosio et al., 2010). L’état de protonation de clopHensor ayant une influence directe sur sa capacité à lier les anions, la connaissance des paramètres biochimiques liés au pH est essentielle. Des expériences ont été effectuées visant à déterminer les paramètres biochimiques qui permettent de décrire l’effet du pH sur la fluorescence émise par clopHensor. Ces paramètres comprennent la constante d’acidité (pKa), et les valeurs Racide et Rbasique, correspondant aux ratios des intensités de fluorescence I488 / I458 (ratio pH), lorsque clopHensor est respectivement dans son état protoné et déprotoné (Chapitre 1, schéma 1-2).
Pour cela, les billes ayant lié les protéines recombinantes de clopHensor ont été incubées dans des solutions contenant 60 mM sulfate d’ammonium en absence de chlorure et tamponnées à différents pH 5,6 et 5,9 avec du MES ; les pH 6,95 ; 7,5 ; 8,1 et 8,95 avec du BTP et le pH 10 avec du CAPS. Les mesures dans les solutions aux pH testés ont été obtenues par le ratio des intensités de fluorescence détectées aux longueurs d’onde d’excitation de l’E2GFP, à 488 et 458nm, dit ratio pH (chapitre 1, 1.2. Equation 1-1). Les paramètres pKa, Racide et Rbasique ont été estimés par interpolation, selon l’équation 1-6, du ratio pH aux différents pH.
Les estimations du pKa ont ainsi été identifiées à 6,9 ± 0,1 de même pour les valeurs des ratios pH Racide à 0,1 ± 0,2 et Rbasique à 4,9 ± 0,1 (Fig. 1-4). Ces valeurs sont très proches de celles obtenues in vitro et en cellules animales, par Arosio et al. 2010; Bizzarri et al. 2006. Le pKa avait, en effet, été estimé in vitro à 6,81 ± 0,05 (Arosio et al., 2010) et à 6,78 ± 0,05 (Bizzarri et al., 2006) soit une différence de 0,2 unité de pH. De même, en ce qui concerne les valeurs Racide et Rbasique respectivement mesurées à ~0,5 et ~4,2 par (Arosio et al., 2010) sont également identiques. De ces estimations, il peut être établi une fourchette de pH allant de 6,5 à 7,5 pour lequel clopHensor est suffisamment sensible pour détecter une variation de pH 0,1 unité.
Figure 1-4. Estimation des paramètres biochimiques décrivant la dépendance du pH de clopHensor. Ratio pH (I488 / I458) des mesures d’intensités de fluorescence détectées sur les billes de sépharose (entre n = 15 et n = 30) pour les longueurs d’onde d’excitation 488 et 458 nm dans des solutions contenant 60 mM de sulfate d’ammonium, 10 mM BTP/MES/CAPS ont été utilisés pour tamponner le pH selon les pH testés (5,6 ; 5,9 ; 6,95 ; 7,5 ; 8,1 ; 8,95 ; 10). Les barres d’erreurss représentent les écarts-types des mesures moyennes.
L’interpolation des données a été faite en utilisant l’équation 1-6.
La reproductibilité des mesures sur billes de sépharose par rapport aux données publiées précédemment dans une condition test valide ce système de mesure in vitro. En effet, les billes de sépharose permettent de contrôler précisément les conditions de mesures puisque les billes sont en contact direct avec les solutions testées. Cela constitue un avantage qui est propre aux systèmes de mesures in vitro. L’autre principal avantage de ce système par rapport à d’autres systèmes de mesures in vitro est de permettre l’utilisation du même système optique d’acquisition pour la calibration in vitro que pour les mesures in vivo.

Sensibilité ionique de clopHensor

ClopHensor a été conçu dans l’optique d’une utilisation en cellules animales, la sensibilité de clopHensor a donc été testée pour les principaux anions inorganiques monovalents de type halogénure présents dans ces cellules (Arosio et al. 2007). Les données dans la littérature montrent que clopHensor présente une sensibilité aux anions de type halogénure, avec pour séquence, I- > Br- > F- > Cl- (Arosio et al., 2007). Cependant, dans le cadre de ce travail, l’objectif est d’utiliser clopHensor dans les cellules végétales. Les cellules végétales contiennent contrairement aux cellules animales de nombreux anions, inorganiques et organiques, en quantités élevées. Les principaux anions inorganiques incluent le nitrate (NO3 – ), le sulfate (SO4 2-) et le phosphate (PO4 3-) et parmi les principaux anions organiques se trouvent le malate2- et le citrate3-. L’étude de la sensibilité de clopHensor pour ces différents anions a été testée afin de déterminer la marge d’utilisation de clopHensor en cellules végétales. Chacun des anions testés a été ajouté dans une solution de base, à une concentration fixée à 30 mM, sous forme de sels de sodium, chlorure de sodium (NaCl), nitrate de sodium (NaNO3), phosphate de sodium (Na3PO4), sulfate de sodium (Na2SO4), malate de sodium et citrate de sodium. La solution de base dans laquelle sont incubées les billes contient 60 mM d’ammonium sulfate et 10mM BTP, le pH est ajusté à 6,9 avec du NaOH. La présence d’ions sulfate dans cette solution ne pose pas de problème puisqu’il est connu que clopHensor y est insensible, cette solution est donc définie comme étant la solution 0 mM Anion (0 mM A-).
La séquence de sélectivité de clopHensor a été obtenue par le ratio des intensités de fluorescence détectées aux longueurs d’onde d’excitation à 458 nm de l’E2GFP, et à 561 nm de la DsRed, qui ont été nommés ratio anions I458 / I561 (chapitre 1, 1.2, Equation 1-2). Une diminution de ce ratio indique une diminution de la fluorescence qui est détectée lors de l’excitation à 458 nm. Cette diminution est due à un changement de conformation lors de la liaison d’un anion sur le site de fixation au niveau du chromophore (Chapitre 1, 1.1).
Les ratios anions ont été normalisés par rapport à la valeur moyenne mesurée dans la condition 0 mM A-. Les ratios anions normalisés obtenus pour les ions sulfate, phosphate, malate et citrate montrent que leurs ratios anions respectifs sont proches de la valeur 1 de la condition 0 mM A- (Fig. 1-5, A). Dans la condition 30 mM de chlorure, le ratio anion est mesuré à 0,42 ± 0,04 soit une diminution de 2,3 fois par rapport à la condition 0 mM A- (Fig. 1-5, A et B). En revanche, en 30 mM nitrate, le ratio anion est de 0,21 ± 0,03, correspondant à une diminution de 4,8 fois, soit une diminution plus importante qu’en présence de chlorure (Fig. 1- 5, A et B). Les résultats obtenus montrent donc que le nitrate est plus efficace que le chlorure à éteindre la fluorescence émise par clopHensor à 458 nm. Le nitrate ayant une structure très similaire à celle des ions nitrite, il était nécessaire de vérifier si clopHensor est également sensible à ces ions. Les ratios anions normalisés dans les conditions 30 mM nitrate et nitrites sont mesurés respectivement à 0,21 ± 0,03 et 0,23 ± 0,04, soit identiques (Fig. 1-5, B).
Les résultats sur la sensibilité de clopHensor aux différents anions que nous avons obtenus confirment d’une part l’interaction avec le chlorure et d’autre part, ils montrent que clopHensor subit une extinction de la fluorescence émise par les ions nitrate et nitrite plus forte. Concernant les ions nitrite, ils sont estimés à une concentration inférieure à 0,5 mM à pH physiologique dans le cytosol des cellules végétales (Maeda et al., 2014) soit en-dessous du seuil de détection de clopHensor, estimée à 1 mM (Fig. 1-6, C).

Table des matières

Introduction
1. Mécanismes de transport d’anions dans les cellules végétales
2. Le stomate, système modèle d’étude des flux d’ions
2.1. Organisation structurelle d’un stomate
2.2. Mécanismes d’ouverture et de fermeture
2.3. Les transporteurs d’ions impliqués dans les mouvements stomatiques
2.3.1. Les canaux potassiques
2.3.1.1. Les différentes familles de canaux potassiques
2.3.1.2. Canaux potassiques rectifiants entrants
2.3.1.3. Canaux potassiques rectifiants sortants
2.3.1.4. Conductances cationiques à la membrane vacuolaire
2.3.2. Les pompes à protons
2.3.2.1. Les principaux rôles de pompes à protons dans les cellules de garde
2.3.2.2. Les P-ATPases
2.3.2.3. Les V-ATPases
2.3.2.4. Les pyrophosphatases
2.3.3. Les différents systèmes de transporteurs d’anions
2.3.3.1. Les différents transporteurs anioniques identifiés dans les cellules de garde
2.3.3.2. S-type
2.3.3.3. R-type
2.3.3.4. Transporteurs actifs secondaires
2.3.3.5. Transporteurs d’anions de la membrane vacuolaire
3. Deux familles importantes de transporteurs d’anions dans les cellules de garde
3.1. La famille des SLow Anion Channel (SLAC)
3.1.1. Structure des canaux SLACs
3.1.2. Mécanisme de transport
3.2. La famille des ChLoride Channels (CLC).
3.2.1. Découverte de la famille des CLCs.
3.2.2. Caractéristiques structurales des CLCs
3.2.2.1. Topologie des CLCs
3.2.2.2. Les Domaines CBS
3.2.2.3. La structure du site de perméation
3.2.2.4. Le « gating » des CLCs
3.2.2.5. La sélectivité ionique des CLCs
3.2.3. Les CLCs chez Arabidopsis thaliana
3.2.3.1. Un CLC à la membrane des thylakoïdes
3.2.3.2. Les CLCs à la membrane de l’appareil de Golgi
3.2.3.3. Les CLCs à la membrane vacuolaire
Objectifs de la thèse
Chapitre 1 : ClopHensor, un biosenseur permettant de mesurer à la fois des flux d’anions et de protons exprimé chez Arabidopsis thaliana
1. Introduction des méthodes d’utilisation du biosenseur ratiométrique clopHensor in vivo
1.1. Structure de clopHensor
1.2. Principe de fonctionnement de clopHensor
2. Obtention des paramètres biochimiques de clopHensor in vitro : billes de sépharose
2.1. Des billes de sépharose comme système de mesure in vitro
2.2. Mesure des paramètres biochimiques de clopHensor liés au pH
2.3. Sensibilité ionique de clopHensor
2.4. Mesure des paramètres décrivant la dépendance de clopHensor à la concentration en anions
3. Lignées de plantes transgéniques exprimant clopHensor
3.1. Lignées transgéniques homozygotes stable
3.2. Localisation subcellulaire de clopHensor dans les plantes d’Arabidopsis thaliana
4. Obtention des paramètres biochimiques de clopHensor in vivo
4.1. Systèmes contrôlant le pH et la concentration en ions chlorure dans le compartiment cytosolique
4.1.1. Les ionophores
4.1.2. L’acétate d’ammonium
4.2. Mesure des paramètres biochimiques de clopHensor liés au pH in vivo
4.3. Mesure des paramètres biochimiques de clopHensor liés aux anion in vivo
5. Mesure des flux de nitrate et variations de pH cytosolique dans les stomates de plantes cultivées in vitro
5.1. Les cellules de gardes comme système de mesure de flux d’ions et du pH cytosolique in vivo
5.1.1. Mise au point d’un système de perfusion pour cellules de garde
5.1.2. Estimation du paramètre manquant : R0, correspondant au ratio anion (I458 / I561) en absence d’anion
5.2. Quantification ratiométrique de la fluorescence de clopHensor de la concentration en nitrate et du pH cytosolique après perfusion de solutions à différentes concentrations de nitrate
5.2.1. Principe du système d’acquisition séquentielle de la fluorescence dans les stomates..
5.2.2. Perfusion de solutions à différentes concentrations de nitrate en conditions de déséquilibre osmotique
5.2.3. Perfusion de solutions à différentes concentrations de nitrate, en conditions d’équilibre osmotique
5.2.4. Etude comparative des concentrations en nitrate mesurées entre les perfusions de différentes concentrations en nitrate en condition de déséquilibre et d’équilibre osmotique
5.3. Etude de l’influence de l’insertion aléatoire du gène clopHensor sur les flux d’ions nitrate et du pH cytosolique
5.4. Quantification de la concentration en chlorure et pH cytosolique après perfusion de solution à différentes concentrations de chlorure
5.5. Quantification de la concentration en nitrate et pH cytosolique sur les mutants d’un transporteur vacuolaire (clca-3) et d’un canal de la membrane plasmique (slac1- 3)
5.5.1. Mesures des flux d’ions nitrate et de variation pH sur un mutant clca-3, un antiport de la membrane vacuolaire
5.5.2. Mesures des flux d’ions nitrate et de variation pH sur un mutant slac1-3, un canal de la membrane plasmique
5.6. Mesures des variations du pH cytosolique en présence d’une phytotoxine
6. Discussion
Chapitre 2 : Acquisition, analyse et traitement des données favorables à la quantification ratiométrique de la fluorescence
1. Quantification ratiométrique de la fluorescence
2. Format d’acquisition des images
2.1. Surface des voxels
2.2. Profondeur des voxels
3. Prise en compte de la variabilité d’expression de clopHensor dans les cellules végétales..
4. Traitement des images
4.1. Seuillage
4.2. Analyse des images
5. Traitement des données
Chapitre 3 : Caractérisation d’AtCLCc et AtCLCg, deux transporteurs de la famille des CLCs chez Arabidopsis thaliana
1. Caractérisation fonctionnelle d’AtCLCc
1.1. Généralités
1.2. Etude du mécanisme de transport d’AtCLCc
1.3. Etude de la sélectivité ionique d’AtCLCc
2. Caractérisation fonctionnelle d’AtCLCg
2.1. Généralités
2.2. Surexpression d’AtCLCg en cellules végétales isolées
2.3. Plantes transgéniques surexprimant AtCLCg
3. Discussion
Conclusion
Matériels et méthodes
1. Clonages
1.1. Vecteurs
1.2. Amorces nucléotidiques
1.3. Insertion du gène d’intérêt dans le vecteur d’expression
2. Lignées de plantes transgéniques
2.1. Conditions de culture en serre de type S2
2.2. Stérilisation des graines
2.3. Génération des lignées transgéniques par la méthode de « Floral Dip »
2.4. Croisement des lignées transgéniques
2.5. Extraction d’ADN génomique pour les génotypages
2.6. Génotypage des lignées transgéniques
3. Méthodes spécifiques au biosenseur, clopHensor
3.1. Méthodes liées aux mesures in vitro
3.1.1. Expression et purification de clopHensor recombinant
3.1.2. Préparation de billes de sépharose liant clopHensor
3.2. Méthodes liées aux mesures in vivo
3.2.1. Les cals
3.2.1.1. Génération et maintien de cals
3.2.1.2. Extraction des protoplastes de cals
3.2.2. Culture plantules in vitro
3.2.2.1. Milieux de culture
3.2.2.2. Dosage colorimétrique du nitrate
3.2.2.3. Extraction d’ARN et RT-PCR
3.2.2.4. Préparation des stomates et solutions de perfusion
3.3. Acquisition des images
3.3.1. Les billes de sépharose
3.3.2. Les protoplastes de cals
3.3.3. Les cellules de garde
3.4. Analyse et extraction des données des images
3.4.1. Les billes de sépharose
3.4.2. Les protoplastes
3.4.3. Les cellules de garde
4. Méthodes spécifiques à la caractérisation fonctionnelle d’AtCLCc et AtCLCg
4.1. Transformation transitoire de protoplastes du mésophylle d’Arabidopsis thaliana
4.2. Extraction de protoplastes du mésophylle
4.3. Extraction des vacuoles
4.4. Solutions ioniques
4.5. Système d’acquisition
4.6. Analyse des données
Bibliographie

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