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Caractères culturaux
K. pneumoniae est facilement cultivable sur les milieux de culture classiques pour entérobactéries (MH, Mac Conkey, BCP, EMB). Sur des milieux riches en glucides, K. pneumoniae donne des colonies luisantes, extrêmement muqueuses de 3 à 4 mm de diamètre (Cf. Figure 2). Leur température optimum de culture se situe à environ 35°C [7, 15].
Caractères biochimiques
K. pneumoniae est une bactérie aéro-anaérobie facultative. K. pneumoniae est positif au test de Voges-Proskauer (VP +), à l’orthonitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG+) et à la lysine-décarboxylase (LDC). Il attaque le glucose en produisant beaucoup de gaz et ne produit pas d’indole (IND -). K. pneumoniae possède une nitrate réductase, n’hydrolyse pas l’ADN et ne produit pas d’hydrogène sulfuré (H2S). La majorité des souches de K. pneumoniae possède une uréase (Uréase +). Les souches de K. pneumoniae uréase (-) sont parfois confondues avec Enterobacter aerogenes qu’on peut différencier avec la mobilité et l’ODC [7, 15, 22].
Caractères antigéniques
Chez K. pneumoniae, l’antigénicité est conférée par des lipopolysaccharides à longue chaîne (antigènes somatiques O) et des antigènes capsulaires (K).
Douze (12) types d’antigènes somatiques O sont actuellement connus, bien que le typage de l’antigène somatique puisse être gêné par la capsule. Certains antigènes O sont identiques ou apparentés aux antigènes O des entérobactéries.
Environ 80 types d’antigènes capsulaires ont été décrits chez K. pneumoniae et les types K1, K2 sont les plus impliqués dans les infections humaines [7].
Facteurs de pathogénicité
K. pneumoniae possède plusieurs facteurs de pathogénicité qu’il utilise en fonction du type d’infections et du mode d’infectivité : la capsule, la production de sidérophores, la production de lipopolysaccharides (LPS), les facteurs d’adhérence et la production d’uréase (Cf. figure 3).
Les souches présentant un phénotype d’hypermucoviscosité sont définies comme hypervirulentes [61].
Capsule
La majorité des souches de K. pneumoniae produit une capsule de nature polysaccharidique ; elle donne aux colonies sur gélose une apparence plus ou moins muqueuse. La capsule est essentielle à la virulence de K. pneumoniae. Les souches hypervirulentes de K. pneumoniae produisent des hypercapsules [12]. La capsule de K. pneumoniae forme d’épais faisceaux couvrant la surface bactérienne en couche épaisse et dense qui protège K. pneumoniae de la phagocytose par les polynucléaires neutrophiles d’une part, et de l’effet bactéricide des facteurs sériques d’autre part. En outre, la capsule de K. pneumoniae inhibe la différentiation et les capacités fonctionnelles des macrophages [5, 48, 61]. Elle permet aussi de faciliter la formation de biofilms.
Sidérophores
Un facteur de pathogénicité important de K. pneumoniae est sa possibilité de chélater le fer environnant grâce des structures particulières, les sidérophores. En effet, la captation du fer est essentielle à la croissance et la réplication de K. pneumoniae et joue un rôle primordial dans l’installation et la progression de l’infection. K. pneumoniae produit quatre types de sidérophores : aérobactine, salmocheline, entérobactine, yersiniabactine [46, 49].
Facteurs d’adhésion (adhésines)
Les adhésines sont des structures protéiques non flagellaires et filamenteuses formant des appendices à la surface des bactéries. Ils sont impliqués dans l’adhérence de K. pneumoniae aux cellules hôtes mais aussi dans la formation de biofilms. K. pneumoniae produit différents types d’adhésines : les fimbriae (fimbriae KPF-28), les pili (pili du type 1 et 3) et les adhésines non fimbriales (adhésines non fimbriale CF29K) [46, 49].
Les Lipopolysaccharides (LPS)
Les LPS sont constitués de trois domaines : le lipide hydrophobe A, l’oligosaccharide de noyau et le polysaccharide de longue chaîne. Le LPS permet à K. pneumoniae d’éviter les facteurs de destruction du sérum [22, 48]. Les chaînes polysaccharidiques terminales (antigène O) du lipopolysaccharide protègent K. pneumoniae de l’activation du complément et des anticorps spécifiques. Le lipide A (endotoxine) est doué de propriétés toxiques. Sa libération massive dans la circulation au cours des bactériémies conduit au choc endotoxinique [57].
Mode de transmission
K. pneumoniae peut être transmis par contact cutané avec des objets ou des surfaces contaminées par l’environnement, le matériel médical et les produits sanguins. La possibilité d’une transmission fécale a également été avancée pour certains cas de bactériémies causés par K. pneumoniae. Il a été observé que K. pneumoniae est souvent présent sur les mains du personnel hospitalier où il peut survivre plusieurs heures, ce qui contribue probablement à la propagation nosocomiale. K. pneumoniae est aussi présent naturellement dans le tube digestif et les voies aériennes supérieures de l’homme et des animaux, et dans l’environnement (eau, sols et poussière) facilitant la transmission et la contagiosité des souches pathogènes [50].
Pouvoir pathogène
K. pneumoniae a été identifié comme pathogène commun dans les infections des voies urinaires (6 à 17%), les septicémies néonatales (3 à 20%), les pneumonies nosocomiales (7 à 14%), les septicémies (4 à 15%), les suppurations des plaies (2 à 4%) [50]. K. pneumoniae peut également causer des infections hépatiques, et des souches ont été isolées dans un certain nombre d’infections inhabituelles (les endocardites, les abcès médiastinaux, les péritonites, les cholécystites aiguës, myonécroses, pyomyosites, fasciites nécrosantes, abcès musculaires, les abcès du cou et les arthrites septiques). Des souches entérotoxigènes et entéroagrégatives de K. pneumoniae ont également été impliquées comme causes potentielles de gastro-entérites infantiles [7, 15, 22]. K. pneumoniae est également des agents pathogènes opportunistes importants, en particulier chez les immunodéprimés. K. pneumoniae est incriminé dans la survenue de diarrhée chronique chez les adultes infectés par le VIH en Afrique.
Au Sénégal, selon une étude réalisée en 2015, K. pneumoniae vient en seconde position après E. coli en termes de prévalence d’implications dans les ITU avec 17,96 % des ITU [16].
Fluoroquinolones (FQ)
Définition
Les FQ sont des antibiotiques synthétiques bactéricides largement utilisés dans le monde [13] ; ceci à cause de leur large spectre d’activités, leur pharmacocinétique, leur excellente biodisponibilité et leur tolérance clinique satisfaisante. Les FQ constituent la seule classe actuelle d’antibiotique qui inhibe directement la synthèse de l’ADN bactérien [28].
Les FQ sont une classe synthétique d’antimicrobiens dont les racines se trouvent dans les médicaments antipaludiques mépacrine et chloroquine [25]. La première quinolone, l’acide nalidixique, était synthétisée après qu’il a été noté que les distillats de sous-produit dans la fabrication de la chloroquine antipaludique avaient des propriétés antimicrobiennes. En 1980, Koga et ses collaborateurs [32] ont procédé à l’amélioration de l’absorption et de l’activité avec l’ajout d’un fluor en position 6 au pharmacophore des quinolones et une nouvelle classe d’antibiotique est née et est appelée fluoroquinolone. L’ajout de cet atome de fluor en position 6 du pharmacophore leur confère une action plus puissante (activité 100 à 1000 fois plus élevée que celle des quinolones de 1ère génération) et un spectre d’activité plus large incluant des bactéries pathogènes à Gram positif et à Gram négatif (Cf. figure 5) [25, 6, 41].
Classification
L’acide nalidixique (quinolone de première génération), (Cf. figure 4a) a servi à la synthèse de la structure chimique commune encore appelé pharmacophore des FQ (Cf. figure 4b). De différentes substitutions ont engendré diverses générations de FQ (Cf. figure 4). Plus la génération des FQ est récente, plus elle a un spectre plus large d’activité et plus d’efficacité [25, 6, 41].
Les FQ constituent la classe d’ATB de premier choix dans le traitement empirique des ITU. On distingue les quinolones hydrophobes (Ofloxacine, lévofloxacine, moxifloxacine) et des quinolones hydrophiles (norfloxacine et ciprofloxacine) [25, 41].
Mécanisme d’action des fluoroquinolones sur K. pneumoniae
Les FQ ont une action bactéricide sur les bactéries. Ils ont un mode d’action intracytoplasmique. Les FQ inhibent certaines enzymes du métabolisme de l’ADN. Après avoir franchi la paroi de la bactérie, les FQ se fixent sur les complexes formés entre l’ADN bactérien et la topoisomérase II (ADN gyrase) ou la topoisomérase IV, qui sont respectivement responsables du surenroulement négatif de la molécule d’ADN et de la séparation des brins néoformés au cours de la réplication. Ce complexe devient irréversible et conduit, d’une part, à l’immobilisation des enzymes qui entraînent la bactériostase et, d’autre part, à la libération des cassures double brin de l’ADN activant le système SOS ou produisant un effet toxique pour les bactéries, responsable de la bactéricidie intense des fluoroquinolones. L’effet bactéricide varie en fonction de la molécule de FQ utilisée [35, 25, 51]. L’action des FQ sur l’ADN gyrase est le mécanisme d’action primordial des FQ sur les bactéries à Gram négatif comparativement à l’action sur la topoisomérase IV [25, 51].
Chez la bactérie, les quinolones hydrophiles pénètrent grâce aux porines ; par diffusion passive en fonction de leur degré d’hydrophobicité et de leur poids moléculaire. Les quinolones hydrophobes pénètrent par un passage direct à travers la bicouche phospholipidique [12, 40].
III. Mécanismes de résistance de K. pneumoniae aux Fluoroquinolones La résistance de K. pneumoniae aux FQ est classée en deux types selon leur origine: – Résistance d’origine chromosomique de K. pneumoniae aux FQ – Résistance d’origine plasmidique de K. pneumoniae aux FQ (Cf. figure 6).
Résistance d’origine chromosomique de K. pneumoniae aux FQ
La résistance d’origine chromosomique de K. pneumoniae aux FQ provient des mutations localisées dans des gènes qui conduisent soit à : – La perte d’affinité des FQ pour leurs cibles – Une augmentation de l’excrétion des FQ hors du cytoplasme de K. pneumoniae – Une diminution de la perméabilité membranaire aux FQ [2, 42, 52]. III.1. 1. Perte d’affinité des FQ pour leurs cibles Elle provient de modifications structurales dans une région de la topoisomérase appelée QRDR (Quinolone Résistance Determining Region). Les mutations dans les QRDR consistent en des substitutions d’acides aminés, modifiant la structure de la protéine cible des FQ et, par la suite, l’affinité de liaison de l’enzyme aux FQ diminue, conduisant à une résistance aux FQ. Il s’agit des mutations dans les gènes gyrA, gyrB, parC, parE. Dans le gène gyrA, des mutations se produisent habituellement au niveau des nucléotides 201 à 320, des acides aminés codés entre la position 67 et 106, en particulier au niveau de la sérine 83 et de l’aspartate 87. Les mutations aux codons 426 et 447 de gyrB font habituellement un faible niveau de résistance aux FQ. Des mutations dans les positions 78, 80 et 84 de l’acide aminé du gène parC chez K. pneumoniae résistant aux FQ ont également été rapportées à travers le monde mais avec des niveaux de résistance différents [35, 42, 52]. Les mutations dans le gène gyrA sont plus fréquentes que celles observées dans le gène gyrB et les K. pneumoniae hautement résistants aux FQ portent typiquement une combinaison de mutations dans les gènes gyrA et parC [2, 35, 51]. L’effet de ces mutations sur l’activité des FQ dépend de leur type, de leur nombre et de la molécule concernée. Ainsi, la résistance s’établit par paliers successifs par accumulation d’évènements mutationnels avec des mutants de 1e niveau, puis de 2e niveau et enfin de 3e niveau [13]. Par exemple, une mutation sur la QRDR du gène gyrA entraîne une résistance de haut niveau à l’acide nalidixique, alors que pour l’ofloxacine et la ciprofloxacine, il en faut respectivement deux et trois mutations [13]. III.1.2. Augmentation de l’excrétion des FQ hors du cytoplasme de K. pneumoniae Elle est due à une surexpression des systèmes d’efflux. L’exposition de K. pneumoniae aux FQ peut sélectionner des mutants qui surexpriment les systèmes d’efflux à la suite de mutations dans les réseaux régulateurs normaux qui contrôlent les niveaux d’expression de ces systèmes. La surexpression de l’efflux confère une résistance élevée aux FQ [45, 51, 52]
Diminution de la perméabilité membranaire
Elle résulte d’un déficit quantitatif ou qualitatif de synthèse des porines. Ce qui entraîne l’entrée d’une faible quantité de FQ à l’intérieur de K. pneumoniae. Elle a moins d’impact sur le degré de résistance comparé aux mutations dans les QRDR.
Résistance plasmidique de K. pneumoniae aux FQ
La résistance d’origine plasmidique de K. pneumoniae aux FQ survient par trois mécanismes : – Protection de la cible des FQ – Inactivation des FQ – Surexpression des pompes efflux [2, 45, 52].
Protection de la cible des FQ
La protection de la cible des FQ est due à la protéine Qnr qui se lie à la topoisomérase, ce qui empêche physiquement l’intercalation des FQ avec l’enzyme cible. La protéine Qnr est codée par des gènes de résistance aux quinolones à médiation plasmidique (PMQR : Plasmid-Mediated Quinolone Resistance), le gène PMQR archétypal est qnr. On distingue qnrA, qnrB, qnrS, qnrC et qnrD [45, 35, 52]. Les protéines Qnr confèrent souvent une résistance de bas niveau aux FQ.
Inactivation des FQ
L’inactivation des quinolones est un mécanisme qui n’existait pas avant la description du gène aac (6′)-Ib-cr codant un aminoside 6′-N-acétyltransférase plasmidique bi-fonctionnelle capable d’acétyler les FQ. Le FQ pénètre dans K. pneumoniae et atteint une concentration intracellulaire normale, mais est inactivée partiellement par une enzyme : aac(6′)-Ib-cr. Cette enzyme est caractérisée par deux mutations (Trp104Arg et Asp181Tyr) qui entraînent d’une part une diminution de la résistance aux aminosides, et d’autre part d’une résistance à la ciprofloxacine et à la norfloxacine par N-acétylation du groupement amine secondaire du cycle pipérazinyl [35, 51, 52].
Surexpression des pompes efflux
La troisième classe de gènes plasmidiques de résistance aux FQ comprend les gènes oqxAB et qepA, qui codent pour des transporteurs capables d’exporter des molécules de FQ hors de K. pneumoniae. Le gène qepA provoque un haut niveau de résistance aux FQ hydrophiles [45, 42, 52].
Les souches de K. pneumoniae peuvent présenter un ou une association de mécanismes de résistance. L’association de divers mécanismes de résistance a un effet additif sur l’élévation des CMI des FQ.
Détection des gènes de résistance par technique moléculaire
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Définition
La PCR a été conçue au début des années 80 par Kary Mullis, et permet d’amplifier in vitro un fragment d’ADN de petite taille en grand nombre. Elle permet le diagnostic rapide des infections causées par des bactéries difficiles à cultiver. C’est une technique alliant rapidité, une bonne sensibilité et reproductibilité [30].
Principe de la PCR en point final
La PCR est une technique in vitro pour amplifier des séquences d’ADN recherchées en utilisant des amorces spécifiques en présence de la Taq polymérase, des désoxyribonucléotides (dNTP), du chlorure de magnésium (MgCl2) et des tampons de réaction à des concentrations optimales [34]. Elle permet d’obtenir, à partir d’un échantillon faible, d’importantes quantités d’un fragment d’ADN spécifique et de longueur définie. L’ordre de grandeur est celui du million de copies en quelques heures. Chaque cycle de PCR est constitué de trois phases différentes à trois températures différentes : la dénaturation, l’hybridation et l’élongation (Cf. figure 7).
Echantillonnage des souches de K. pneumoniae BLSE uropathogènes
Cinquante (50) souches de K. pneumoniae ont été étudiées au cours de notre étude et sélectionnées au hasard parmi des souches de K. pneumoniae isolées d’ECBU au LBM-IPD, productrices de BLSE et résistantes phénotypiquement aux FQ.
Chaque souche de K. pneumoniae sélectionnée avait été ré-identifiée à partir des caractères morphologiques, culturaux et biochimiques et un antibiogramme a été réalisé par la technique de diffusion sur le milieu MH selon les recommandations du CASFM/EUCAST (2018).
Extraction des ADN
Chaque souche de K. pneumoniae sélectionnée a été repiquée sur le milieu MH. Deux colonies de culture pure ont été mises en suspension dans un tube Eppendorff® contenant 4ml d’eau physiologique stérile. Les tubes Eppendorff® contenant les suspensions de Kp ont été placés dans un bain-marie à une température de 100°C pendant 12 min. Les tubes étaient ensuite centrifugés à 4°C (centrifugation réfrigérée), à la vitesse de 10 000 tr/min pendant 10min. Le surnageant contenant l’ADN a été recueilli et la pureté de l’ADN a été évaluée au Nanodrop Lite® (Cf. figure 8).
Préparation du mix réactionnel de PCR
Le mix réactionnels de PCR étaient composés de l’ADN de la souche K. pneumoniae analysée, des paires d’amorces (Inquaba Biotec West Africa Ltd) du ou des gènes de résistance recherchés (Cf.Tableau II), de l’eau PCR (Reaction buffer B Solis BioDyne) et du master mix (Master Mix FIREPol® Solis Biodyne). Le master mix était composé de: Taq polymérase (FIREPol® DNA polymerase), le mélange des quatre désoxyribonucléotides (1mM dNTP), du chlorure de magnésium (12 ,5 mM MgCL2).
Nous avons procéder par des PCR simplex et multiplex en fonction de la taille des amplicons attendue. La composition du mix réactionnel de la PCR est fonction du nombre de gènes recherchés.
Discussion
Notre étude a porté sur 50 souches de K. pneumoniae uropathogènes productrice de BLSE et résistantes aux fluoroquinolones. Les gènes de résistance aux fluoroquinolones (QRDRs, PMQR, aac(6’)-Ib) ont été détectés chez 94 % (47/50) des souches. Seules 3 souches n’hébergeaient pas les gènes recherchés bien qu’elles présentaient un profil de résistance aux fluoroquinolones. Parmi les QRDRs, seuls les gènes gyrA (n=1) ; parC (n=1) et parE (n=3) ont été détectés. Le gène gyrB n’a pas été détecté. Les mutations des gènes QRDR détectés n’ont pas été recherchées. Ces résultats sont différents des résultats obtenus lors d’une étude réalisée à Dakar dans le même laboratoire en 2017 aucour de laquelle sur 50 souches, gyrB et parE étaient détectés chez une souche et gyrA et parC n’avaient pas été détéctés [44]. La très faible détection des QRDRs au cours de notre étude contraste avec une étude réalisée en Sierra-Leone en 2016 au cours de laquelle sur 17 souches K. pneumoniae, 9 possédaient le gène gyrA (avec une mutation au niveau de la Sérine 83) et 09 possédaient également le gène parC (avec une mutation au niveau de la sérine 80) [36]. Ailleurs, au cours d’une étude en Corée en 2013 portant sur 21 souches de K. pneumoniae, les gènes QRDRs ont été fortement détectés avec la présence de gyrA chez 19 souches (avec une mutation dans la Serine 83); parC chez 14 souches avec mutation dans la Serine 80 [43].
Au cours de notre étude, l’analyse des déterminants plasmidiques (PMQR, aac(6’)Ib et qepA) a montré la présence des gènes qnrB et qnrS respectivement chez 41 isolats (82%) et une souche (02%). Le gène aac(6’)-Ib a été détecté chez 44 souches (88%). Le séquençage de ces gènes n’a pas été réalisée pour identifier les sous-types des gènes qnr et le variant aac(6’)-Ib-cr qui code à la fois la résistance aux fluoroquinolones et aux aminosides. Les gènes qnrA, qnrC, qnrD et qepA n’ont pas été détectés. L’étude réalisée à Dakar en 2017 sur 50 souches a montré une plus faible présence du gène qnrB (n=30) associée à une présence de qnrA (n=1) ; le gène qnrS n’avait pas été détecté lors de cette étude [44]. Une autre étude réalisée à Ouagadougou au Burkina-Faso en 2015 sur treize (13) souches K. pneumoniae avait montré une distribution plus basse du gène qnrB (n=7) [41]. Une autre étude réalisée en 2008 à Abidjan chez 66 souches de K. pneumoniae a montré une faible présence du gène qnrB (n=8) et le séquençage a permis de détecter les sous-types qnrB1 (07/66) et qnrB4 (01/66) [23]. Le gène aac(6’)-Ib a été très fortement détecté au cours de notre étude 88% (44/50). Ces résultats sont comparables à la forte détection à 72% (36/50) du gène aac(6’)-Ib observée au cours de l’étude de 2017 à Dakar [44]. le variant aac(6’) a été retrouvé chez la totalité (13/13) des souches étudiées en 2015 à Ouagadougou [41]. Ailleurs, dans le monde, une autre étude réalisée à Alep en Syrie en 2015 sur 24 souches K. pneumoniae a révélé aussi une forte présence du gène aac(6_)-Ib à 75% (n=18) [03].
Le variant aac(6_)-Ib-cr a été détecté chez 20 souches (90,9%) au cours de l’étude réalisée en Corée en 2014 chez 22 souches K. pneumoniae [60].
L’absence du gène qepA observée au cours de notre étude a été aussi observée au cours de l’étude réalisée à Dakar en 2017 [44] ainsi qu’au cours de l’étude réalisée en Corée 2014 [60].
03 des souches n’hébergeaient aucun des gènes recherchés bien qu’elles présentaient un profil de résistance aux fluoroquinolones. La résistance de ces trois souches ne portant aucun des gènes recherchés pourraient être due à des gènes de résistance que nous n’avons pas recherché lors de notre étude ; comme le gène oqxAB. En effet, le gène oqxAB a été détecté chez toutes les 17 souches K. pneumoniae étudiées en Sierra-Leone en 2016 [36] et sa variante oqxB a été retrouvée chez toutes les 21 souches K. pneumoniae étudiées à Durban Afrique du Sud en 2017 [47].
La réalisation du séquençage des gènes détectés permettra d’identifier: la présence ou non de mutations au niveau des gènes QRDR, les sous-types des gènes qnr et la présence de la variante aac (6’)-Ib-cr.
La très forte présence des gènes plasmidiques aac(6’)-Ib et qnrB pourrait être source de transferts conjugatifs de ces gènes à d’autres bactéries, surtout en milieu hospitalier. Le personnel hospitalier doit alors veiller à plus d’hygiène afin d’éviter les infections nosocomiales à bactéries multirésistantes. Une étude des déterminants plasmidiques de résistance aura une grande importance dans la compréhension du mode de dissémination des gènes de résistance.
Vue le fort taux de résistance des K. pneumoniae aux FQ observée, les FQ doivent être proscrits comme traitement de première intention dans le traitement des ITU.
Il faut aussi adapter constamment les algorithmes d’antibiothérapie par rapport à l’écologie bactérienne.
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Table des matières
Introduction
Objectif
Première partie : Revue bibliographique
I. Généralités sur K. pneumoniae
I.1. Historique
I.2. Taxonomie
I.3. Caractères bactériologiques
I.4. Facteurs de pathogénicité
I.5. Epidémiologie
I.6. Pouvoir pathogène
II. Fluoroquinolones (FQ)
II.1. Définition
II.2. Classification
II.3. Mécanisme d’action des fluoroquinolones sur K. pneumoniae
III. Mécanismes de résistance de K. pneumoniae aux Fluoroquinolones
III.1. Résistance d’origine chromosomique de K. pneumoniae aux FQ
III.2. Résistance plasmidique de K. pneumoniae aux FQ
IV. Détection des gènes de résistance par technique moléculaire
IV.1. Polymerase Chain Reaction (PCR)
IV.2. Séquençage
Deuxième partie : Travail expérimental
I. Objectifs
II. Cadre de l’étude
III. Souches bactériennes
IV. Matériels et méthode
IV.1. Matériels
IV.2. Méthodologie
V. Résultats
VI. Discussion
Recommandations
Conclusion
Références bibliographiques
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