Soutenance mémoire
Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études
Principaux genres d’Enterobacteriaceae
Escherichia coli et autres Escherichia
Le genre Escherichia appartient à la famille des Enterobacteriaceae et à la classe des gammaproteobacteria (phylum des proteobacteria) [5]. Escherichia coli (E. coli) est l‟espèce type du genre Escherichia. Cette bactérie décrite pour la première fois par le pédiatre allemand Theodor Escherich en 1885 sous le nom de « bacterium coli commune » a fait l‟objet d‟un très grand nombre d‟études [6]. Elle est responsable aux côtés de Klebsiella pneumoniae et de Proteus mirabilis de plus de 80% des infections humaines dues à des entérobactéries [7], [8].
Le genre Escherichia comprend quatre autres espèces isolées chez l‟homme : Escherichia hermanii, Escherichia vulneris, Escherichia fergusonii et Escherichia albertii. Les espèces les plus proches d‟E. coli sur le plan génotypique sont E. fergusonii et E. albertii, l‟hybridation ADN-ADN indiquant 55 à 64% d‟homologie. Viennent ensuite les espèces E. vulneris et E. hermanii avec 39 à 46% d‟homologie [5], [9], [10].
En 1962, Leclerc décrit l‟espèce Escherichia adecarboxylata [11] qui a été reclassée dans le genre Leclercia sur la base des homologies ADN-ADN et devenu Leclercia adecarboxylata [12].
Les principaux caractères biochimiques permettant de distinguer l‟espèce E. coli des espèces voisines sont résumés dans l‟annexe II.
Certaines souches possédant des facteurs de pathogénicité peuvent être responsable d‟infections intestinales et d‟infections extra-intestinales : infections de l‟arbre urinaire, suppurations diverses, méningite et bactériémie.
La présence de facteurs de virulence spécifiques (facteurs de colonisation, toxines) permet de regrouper les souches dans des pathovars (variétés pathogènes). Chaque pathovar est associé à un syndrome infectieux caractéristique. L‟identification d‟une souche à l‟espèce E. coli par les techniques classiques n‟est pas suffisante pour apprécier la responsabilité de celle-ci dans l‟infection, il est nécessaire d‟identifier le pathovar auquel la souche appartient, donc de caractériser ses facteurs de virulence.
Les souches de E. coli responsables d‟infections intestinales sont actuellement classés dans six pathovars définis sur la base des facteurs de pathogénicité et des signes cliniques engendrés [13], [14]. Ils sont désignés par un sigle francisé comme « ECEP : E. coli entéropathogène » ou anglicisé comme « EPEC : Enteropathogenic Escerichia. coli ». Leurs caractéristiques sont résumées dans l‟annexe III.
Shigella
Les Shigella sont des bactéries strictement adaptées à l‟espèce humaine. Ils provoquent la dysenterie bacillaire. Ils sont toujours immobiles, lactose négatif, H2S négatif, citrate de Simmons négatif, gaz négatif, uréase négatif, désaminase oxydative négatif. Les Shigella sont génétiquement très proches du genre Escherichia coli. De ce fait, elles ne peuvent être distinguées par hybridation ADN /ADN. La subdivision en espèce est basée sur des caractères biochimiques et antigéniques. Le genre comprend quatre espèces : Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii et Shigella sonnei. Les caractères différentiels des quatre espèces sont résumés dans l‟annexe IV.
Klebsiella-Enterobacter-Serratia-Hafnia
Les genres Klebsiella, Enterobacter, Serratia et Hafnia sont souvent associes sous le nom « KEHS » sur la base du caractère VP. En effet les espèces de ces genres présentent une réaction de Voges-Proskauer (VP) positive à l‟exception de Klebsiella ozaenae et Klebsiella rhinoscleromatis qui sont VP négatif.
Les principaux caractères différentiels de leurs espèces types Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Hafnia alvei, Serratia marcescens sont résumés dans l‟annexe V.
Citrobacter- Levinea
Ce sont des bacilles Gram négatif, mobiles, aéro-anaérobie et facilement cultivable sur milieux usuels ou sur milieu sélectif pour les entérobactéries où ils donneront des colonies grosses, blanches, opaques. Le genre Citrobacter a un habitat mal défini, présent chez un grand nombre d‟animaux, dans les eaux, le sol, les aliments.
Chez l‟homme, ils font partie de la flore intestinale normale mais, pour certains, ils seraient impliqués dans la survenue de diarrhées. Citrobacter braakii a été isolé de prélèvement de selles, d‟urine, dans le tractus respiratoire et dans des plaies. Les infections à Citrobacter sont surtout d‟origine nosocomiale.
Salmonella
Présentes dans l‟eau et dans diverses denrées alimentaires, les Salmonelles sont pathogènes, généralement pour l‟homme ou les animaux (zoonose) mais sont parfois exclusivement pathogènes pour l‟homme (ex. Salmonella Typhi), ou l‟animal (ex. Salmonella Gallinarum). Chez l‟homme, elles sont responsables de gastro-entérites et de la fièvre typhoïde (Salmonella Typhi). Chez l‟animal, les tableaux cliniques sont variés : avortements chez différentes espèces, septicémies du jeune, entérites. La morphologie est celle des entérobactéries. Certaines souches habituellement mobiles peuvent à l‟isolement se présenter sous forme immobile.
Les colonies mesurent en général 1,5 à 3 mm après 24 heures à 37°C et apparaissent lors de l‟isolement sous forme S.
La plupart des salmonelles sont : H2S positif (sauf Paratyphi A), LDC positif, ONPG négatif, Indole négatif, CS variable, Gélatine négatif, Uréase et TDA négatif.
BÊTALACTAMINES
Les bêtalactamines représentent la plus importante famille d‟antibiotiques par le nombre de molécules disponibles et par le volume d‟utilisation, aussi bien en milieu communautaire qu‟en milieu l‟hospitalier. Cette utilisation importante est due à leur large spectre d‟action, leur efficacité, leur faible toxicité et à leur faible coût pour de nombreuses molécules [15].
L‟histoire des bêtalactamines a débuté dans les années 1930 par les observations de Sir Alexander Fleming concernant un agent antibactérien dénommé pénicilline isolé à partir du champignon Penicillium notatum [16]. Cependant, l‟utilisation large des bêtalactamines depuis plus de 60 ans s‟est accompagnée d‟une augmentation importante de la résistance bactérienne à ces antibiotiques. Et le développement de nouveaux antibiotiques, notamment contre les bactéries Gram négatif, connaît un franc ralentissement depuis plus de 10 ans [15].
Structure des bêtalactamines
La base commune à toutes les bêtalactamines est le noyau bêtalactame (Figure 1). À partir de ce cycle, quatre sous-familles ont été développées par adjonction de chaînes latérales : les pénicillines (ou pénames), les céphalosporines (ou céphèmes), les monobactames et les carbapénèmes [17] (Figure 1). Toutes ces molécules présentent des caractéristiques communes ainsi que des particularités propres à chaque classe, notamment en termes de spectre antibactérien.
Mode d’action des bêtalactamines
Les bêtalactamines sont des antibiotiques bactéricides qui interfèrent avec la dernière étape périplasmique de la synthèse du peptidoglycane. Leurs cibles sont les transpeptidases et les carboxypeptidases, les enzymes PLP. La nature de ces PLPs est relativement spécifique d‟espèce et leur nombre varie d‟une espèce bactérienne à l‟autre.
La structure des bêtalactamines mime la séquence D-ala-D-ala qui constitue le substrat naturel des PLP. Les bêtalactamines se fixent de façon covalente au niveau du site actif de l‟enzyme par réaction d‟acylation. La liaison PLP-bêtalactamines ainsi formée a deux conséquences : elle empêche la synthèse du peptidoglycane en inhibant la transglycosylation et la transpeptidation (effet bactériostatique) et elle entraine une activation endogène des autolysines bactériennes (effet bactéricide).
Mécanismes de résistance bactérienne aux bêtalactamines
Il existe quatre principaux mécanismes de résistance, chacun pouvant être lié aux caractéristiques génétiques d‟une espèce bactérienne donnée (résistance naturelle) ou être acquis suite à des modifications génétiques (résistance acquise) :
Défaut de pénétration de l‟antibiotique : diminution de la perméabilité ;
Modification de la cible : modification des PLP ;
Excrétion de l‟antibiotique : efflux ;
Inactivation de l‟antibiotique : production de bêtalactamases
Défaut de pénétration de l’antibiotique : diminution de la perméabilité
Ce mécanisme est lié à la structure de la paroi bactérienne et aux propriétés physicochimiques de l‟antibiotique.
Les bacilles Gram négatif ont une paroi comprenant une membrane externe qui empêche la pénétration des antibiotiques hydrophobes et/ou de masse moléculaire élevée (pénicilline G, pénicilline M, macrolides, rifampicine, acide fusidique, vancomycine) entraînant une résistance naturelle à ces antibiotiques, le plus souvent à bas niveau. Les molécules hydrophiles de faible masse moléculaire peuvent tout de même traverser cette barrière hydrophobe en empruntant des canaux remplis d‟eau formés par des protéines transmembranaires appelées porines.
Une modification qualitative ou quantitative des porines entraîne une diminution de la perméabilité membranaire et, par conséquent, une augmentation du niveau de résistance aux antibiotiques. Par exemple, une mutation dans la séquence du gène ompF codant pour une porine de E. coli entraîne une résistance aux bêtalactamines [18]. De même, une réduction de l‟expression du gène codant pour la porine OprD chez P. aeruginosa peut conduire à une résistance de ce germe à toutes les carbapénèmes, sans affecter les autres bêtalactamines [19].
Modification de la cible
Ce mécanisme de résistance aux bêtalactamines est prédominant chez les bactéries à Gram positif. Les cibles des bêtalactamines sont les PLPs, enzymes intervenant dans la synthèse du peptidoglycane. Certaines espèces expriment naturellement une PLP de faible affinité pour certains antibiotiques, comme la PLP5 des entérocoques vis-à-vis des céphalosporines et de de l‟oxacilline [20]. Des mutations au niveau des PLPs peuvent engendrer une perte d‟affinité de l‟antibiotique pour sa cible, entraînant une réduction de sensibilité aux bêtalactamines sans affecter leur fonction dans l‟élaboration du peptidoglycane[21].
D‟autres espèces acquièrent un gène exogène codant pour une PLP insensible aux bêtalactamines, comme le gène mecA codant pour la PLP2a acquis par Staphylococcus aureus et conférant à cette espèce une résistance à la méthicilline et à toutes les autres bêtalactamines [20].
Excrétion de l’antibiotique : efflux
Les systèmes d‟efflux sont basés sur une pompe insérée dans la membrane interne de la bactérie et capable d’excréter l’antibiotique hors de celle-ci grâce à un canal présent dans la membrane externe et à une protéine de jonction périplasmique. Cet efflux conduit à une diminution de la concentration intracellulaire de l’antibiotique et confère généralement des résistances de bas niveau.
Des systèmes d’efflux constitutifs ont été identifiés chez de nombreuses bactéries à Gram négatif. Ces mécanismes d’efflux actif ont été décrits à l’origine chez E. coli [22]. Ils s’exercent vis-à-vis de nombreux antibiotiques dont la cible d’action est intracellulaire (quinolones, tétracyclines) et ils sont qualifiés de pompes d’efflux multidrogues.
Des mutations dans les régions régulatrices des opérons des systèmes d’efflux multidrogues peuvent conduire à une surexpression des systèmes d’efflux constitutifs, associée ou non à une perte des porines, et conférer une multirésistance aux antibiotiques. Ainsi, l‟hyperproduction du système MexAB-OprM est associée à la résistance au méropénème et à la ticarcilline chez P. aeruginosa [23]. Une acquisition de gènes peut être à l’origine de systèmes d’efflux spécifiques qui, contrairement aux systèmes d’efflux multi-drogues, ne permettent que l’exportation de molécules apparentées.
Inactivation enzymatique de l’antibiotique : production de bêtalactamases
Ce mécanisme de résistance aux bêtalactamines, prédominant chez les bactéries à Gram négatif, repose sur la production d‟enzymes capable de se lier et d‟inactiver l‟antibiotique.
Chez les bactéries à Gram positif, les bêtalactamases sont excrétées alors que, chez les bactéries à Gram négatif, les bêtalactamases restent localisées dans l‟espace périplasmique.
L‟origine des gènes codant ces enzymes peut être intrinsèque (gène naturellement présent sur le chromosome de l‟espèce bactérienne) ou extrinsèque (gène transmis à la bactérie par des plasmides ou des éléments génétiques mobiles).
Certaines espèces sont naturellement résistantes aux aminopénicillines par production d‟une bêtalactamase naturelle : SHV chez Klebsiella, AmpC chez A. baumannii.
Certaines souches peuvent acquérir une résistance enzymatique soit par hyperproduction d‟une enzyme naturellement peu ou pas exprimée (exemple : céphalosporinase des entérobactéries du groupe 3 comme Enterobacter, Serratia ou Morganella), soit par acquisition d‟un gène d‟origine extrinsèque codant une bêtalactamase.
BÊTALACTAMASES
Généralités
La première description d‟une enzyme capable d‟inactiver la pénicilline date de 1940 [24]. Depuis cette date, quelques temps après l‟introduction de chaque nouvelle génération de bêtalactamine, des mécanismes de résistance par inactivation de l‟antibiotique venant d‟être commercialisé ont été décrits. C‟est ainsi que plusieurs centaines de bêtalactamases ont été identifiées à ce jour dans diverses espèces bactériennes pathogènes ou non.
Ces enzymes peuvent être classées en fonction de leur spectre d‟activité enzymatique [25], [26] ou de leur séquence en acides aminés [27].
Classifications
Classification d’Ambler
Cette classification proposée en 1980 permet de grouper les bêtalactamases en quatre classes en fonction de leurs homologies structurales [27].Les caractéristiques de chaque classe sont résumés dans l‟annexe VI.
Classification de Bush
La classification fonctionnelle de Bush, revue en 2010 est basée sur le phénotype de résistance aux bêtalactamines. Elle prend en compte le profil de substrats et celui d‟inhibition [26]. Les caractéristiques de chaque classe sont détaillés dans l‟annexe VII.
Mécanisme d’action des bêtalactamases
Quelle que soit leur classe, ces bêtalactamases catalysent la même réaction : ouverture du cycle bêtalactame suivi d‟une hydrolyse rapide de la bêtalactamine. Les bêtalactamases des classes A, C et D de Ambler sont des enzymes à sérine active qui utilisent au sein de leur site actif une sérine intervenant dans le processus catalytique. Les différentes phases de la réaction d‟hydrolyse sont :
Liaison non-covalente et réversible entre la bêtalactamase et la bêtalactamine ;
Rupture du noyau bêtalactame par acétylation covalente avec la sérine du site actif (formation d‟un complexe acyl-enzyme intermédiaire avec les bêtalactamines) ;
Intervention d‟une molécule d‟eau permettant l‟hydrolyse de l‟acyl-enzyme pour réactiver la bêtalactamase et libérer la molécule d‟antibiotique inactivée.
De façon simplifiée, l‟hydrolyse d‟une bêtalactamine se déroule en trois étapes caractérisées par des constantes cinétiques. Ces constantes permettent de définir le comportement enzymatique d‟une bêtalactamase vis-à-vis d‟une bêtalactamine donnée. Elles permettent d‟établir un profil d‟hydrolyse propre à chaque enzyme sur lequel s‟appuie la classification de Bush [28], [29].
Suivi des participants
Nouveau-nés et accompagnants principaux
Les nouveau-nés et leurs accompagnants ont été suivis pendant toute la durée de l‟hospitalisation.
Pour l‟accompagnant principal, la recherche d‟EBRCIIIG au niveau des mains s‟est faite tous les deux jours.
Des prélèvements systématiques des nouveau-nés et de leurs accompagnants ont été effectués pour détecter la colonisation intestinale par des EBRCIIIG. Le rythme de ces prélèvements dépendait de la durée de l‟hospitalisation.
– si la durée d‟hospitalisation était inférieure à sept jours, les prélèvements ont été faits lors de la sortie d‟hospitalisation,
– si la durée d‟hospitalisation était supérieure à sept jours, les prélèvements ont été faits sur un rythme hebdomadaire.
Données collectées
Les données concernant les facteurs de risque présumés de portage ou colonisation et de transmission ont été collectées :
la topologie relationnelle : le personnel soignant étant en contact avec tous les nouveau-nés, seuls le secteur, la place dans le secteur et le voisinage direct de chaque nouveau-né sont enregistrés ;
les actes invasifs effectués ;
l‟administration d‟antibiotiques que ce soit de manière préventive ou curative ;
la consommation d‟antibiotiques de l‟accompagnant principal et du nouveau-né
METHODES
Techniques prélèvements
Les prélèvements pour la recherche d‟EBRCIIIG sont réalisés :
par écouvillonnage de l‟ampoule rectale (nouveau-né) ou sur une émission de selles (accompagnant) ;
par écouvillonnage des éventuelles lésions cutanées (infection chez les accompagnants).
Les prélèvements de la flore cutanée pour la recherche d‟EBRCIIIG seront réalisés par apposition de trois doigts de la main (droite pour les droitiers, gauche pour les gauchers) pendant quelques secondes sur une boîte de Pétri.
Pour les prélèvements environnementaux, ils ont été réalisés par gélose contact ou par écouvillon en cas d‟impossibilité de prélever certaines surfaces (ex : poignées de porte,…).
Les prélèvements ont été réalisés par des moniteurs d‟étude clinique possédant une formation de médecin. Les prélèvements ont été immédiatement acheminés à +4°C dans une glacière au laboratoire de microbiologie des Institut Pasteur où ils ont été pris en charge. En cas de fermeture du laboratoire (week-end), les écouvillons ont été placés dans un milieu de transport pour un ensemencement différé (48 heures). Les boîtes sélectives et les géloses contacts ont été acheminées à température ambiante.
Recherche d’EBRCIIIG dans l’environnement
Des prélèvements environnementaux ont été réalisés en début, milieu et fin de l‟étude. Les sources de contaminations potentielles identifiées sont les poignées de porte, les robinets des lavabos, les sèche-mains, les couveuses, les pèse-bébés et les toilettes.
Etudes bactériologiques
Choix du milieu de sélection des BLSE
Pour cette étude, le milieu CHROMagar ESBL a été choisi pour la sélection des bactéries productrices de BLSE. Selon la littérature le milieu CHROMagar ESBL est le plus performant puisque en comparaison avec les milieux ChromID ESBL et Brilliance il présente une sensibilité plus élevée (tableau1)
|
Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
A : ENTEROBACTERIACEAE
I- Généralités
II- Principaux genres d’Enterobacteriaceae
II-1- Escherichia coli et autres Escherichia
II-2- Shigella
II-3- Klebsiella-Enterobacter-Serratia-Hafnia
II-4- Citrobacter- Levinea
II-5- Salmonella
B : BÊTALACTAMINES
I- Structure des bêtalactamines
II- Mode d’action des bêtalactamines
III- Mécanismes de résistance bactérienne aux bêtalactamines
III-1- Défaut de pénétration de l’antibiotique : diminution de la perméabilité
III-2- Modification de la cible
III-3- Excrétion de l’antibiotique : efflux
III-4- Inactivation enzymatique de l’antibiotique : production de bêtalactamases
C : BÊTALACTAMASES
I- Généralités
II- Classifications
II-1- Classification d’Ambler
II-2- Classification de Bush
III- Mécanisme d’action des bêtalactamases
MATERIELS ET METHODES
A : MATERIELS
I- Population étudiée
II- Inclusion des participants
III- Suivi des participants
III-1- Nouveau-nés et accompagnants principaux
III-2-Données collectées
B : METHODES
I- Techniques prélèvements
II- Recherche d’EBRCIIIG dans l’environnement
III- Etudes bactériologiques
III-1- Choix du milieu de sélection des BLSE
III-2- Isolement sur CHROMagar ESBL
III-3- Isolement sur la gélose lactosée de Drigalski
III-4- Identification au spectromètre de masse MALDI TOF
III-5- Confirmation des Escherichia coli par la détection des gènes uidA par PCR
III-6- Etude de la sensibilité aux antibiotiques par la méthode de diffusion
III-6-1- Méthode de diffusion
III-6-2- Test de double synergie
III-6-3-Détection de la production de métallobêtalactamase
III-6-4- Phénotypes de résistance des souches isolées
III-7- Conservation des souches à -80°C
IV- Etude moléculaire
IV-1- Extraction d’ADN par choc thermique
IV-2- Réaction de Polymérisation en Chaine
IV-2-1- Principe de la PCR
IV-2-5- Détection et analyse des produits PCR
IV-3- Criblage des gènes de résistance
IV-4- Caractérisations du pathotype ETEC et recherche du locus LEE dans les Escherichia coli par PCR multiplexe
IV-5- Etude de la relation phylogénétique entre souches par REP PCR
RESULTATS
I- Nombre de sujets inclus dans l’étude
II- Descriptions des sujets d’étude
II-1- Nouveau – nés
II-2- Accompagnants
III- Antibiothérapie
III-1- Nouveau-nés
III-2- Accompagnants
IV– Souches bactériennes isolées
V- Test de double synergie
VI- Détection de la production de metallobêtalactamases
VII- Sensibilité aux antibiotiques
VII-1- Accompagnants
VII-2- Nouveau-nés
VII-3- Environnement
VIII- Lecture interprétative des antibiogrammes
VIII-1- Nouveau-nés
VIII-2- Accompagnants
VIII-3- Environnement
IX- Screening des gènes de résistances des souches isolées
IX-1- Nouveau-nés
IX-2- Accompagnants
XI-3-Environnement
X- Caractérisation du pathotype ETEC et du locus LEE dans les Escherichia coli
XI- Etude des relations phylogénétiques des souches par REP PCR
DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Télécharger le rapport complet
