Mécanismes de formation d’arcs électriques entre deux électrodes immergées

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Analyse des constituants de bactéries

Ce travail de thèse s’inscrit également dans un but autre que celui décrit précédemment. Il s’agit d’utiliser la technique de lyse imaginée, dans le cadre de l’analyse de microorganismes.

Différents types d’analyses

Aujourd’hui de nombreuses techniques d’analyses sont disponibles en laboratoire. De manière non exhaustive les techniques suivantes peuvent être listées :
‐ La mise en culture et la mesure du taux de survie,
‐ L’observation au microscope des cellules,
‐ La cytométrie de flux permettant de compter et caractériser les cellules selon leurs propriétés optiques,
‐ La méthode ELISA (« enzyme‐linked immunosorbent assay ») permettant notamment l’identification des protéines,
‐ L’électrophorèse pour l’identification d’ADN, d’ARN ou de protéines, appelées respectivement Souhtern, Northern et Western Blot,
‐ Les méthodes d’amplification de l’ADN.
Alors que les trois premières techniques listées requièrent des cellules intactes, les suivantes requièrent généralement une étape de libération du contenu intracellulaire. Des méthodes adaptées de lyse cellulaires doivent donc être employées en amont de l’analyse.
Ce travail de thèse est focalisé sur l’analyse d’organismes unicellulaires procaryotes : des bactéries faciles à cultiver et représentatives de différents domaines d’applications tels l’analyse de la qualité de l’air ou de l’eau, la détection de pathologies chez l’homme, etc. Les analyses effectuées dans cette thèse seront réalisées à partir de techniques d’amplification de l’ADN telle que la PCR (« polymerase chain reaction »).
Toutefois, la PCR requiert des cycles de températures qui rendent la technique longue et peu adaptée aux analyses « sur le terrain ». Cependant, le développement récent de techniques d’amplification isotherme de l’ADN permet d’envisager ce type d’analyses. L’amplification isotherme de l’ADN fera l’objet d’une étude dans le dernier chapitre de cette thèse. Le concept de systèmes permettant l’analyse « sur le terrain » est présenté dans le paragraphe suivant.

Développement de systèmes d’analyse d’échantillons bruts

Les systèmes d’analyse intégrant la préparation d’échantillon (systèmes de type « sample‐in » to
« answer‐out ») émergent car ils permettent de réduire considérablement les risques de contamination, de simplifier les manipulations nécessaires à l’analyse et souvent également de réduire les temps d’analyse et la consommation d’énergie (Jungkyu Kim et col., 2009). En outre, ce type de système peut facilement être conçu de façon à être portable.
Ces systèmes autonomes sont développés à l’échelle microfluidique sous forme de laboratoire sur puce (« lab‐on‐chip »). Ils permettent d’effectuer sur le même dispositif la collecte de l’échantillon, la lyse cellulaire et l’analyse du contenu. En raison de la complexité de ces systèmes intégrant à la fois l’étape de préparation et l’étape d’analyse, peu de dispositifs ont connu un développement industriel. Dans ce travail de thèse, une technique de lyse pouvant être intégrée dans ce genre de systèmes est étudiée.

Différentes techniques de lyse

Compte tenu de son importance en biologie la lyse a d’ores et déjà fait l’objet de multiples recherches et plusieurs techniques ont aujourd’hui été développées à plus ou moins grande échelle. Dans le présent paragraphe ces techniques sont classées selon leur mode d’action. Quatre modes seront distingués :

Méthodes chimiques

Choc osmotique

L’osmose fait référence au passage d’un liquide à travers une membrane semi‐perméable d’une zone où la concentration est faible à une zone où la concentration est plus élevée. La différence de concentration entre les deux côtés de la membrane semi‐perméable engendre une pression osmotique sur la membrane. Les membranes cellulaires étant semi‐perméable, elles subissent une pression osmotique lorsqu’elles sont placées dans un milieu où la concentration est différente de celle à l’intérieur de la cellule. Ainsi des cellules placées dans une solution faiblement concentrée en sel subiront un flux d’eau dirigé vers leur intérieur. Elles se gonfleront alors et peuvent exploser (cours de Margaritis, 2007). Dans le cas des microalgues par exemple, c’est une méthode prometteuse pour récupérer l’huile avec des espèces telles que Botryococcus sp. MPCC32 sensibles à cela (Rakesh et col., 2015). Combinée à un solvant organique cette technique d’extraction a permis d’obtenir une quantité d’huile deux fois supérieure à celle obtenue lors de l’utilisation d’un solvant seul (Byreddy et col., 2015). Cependant l’efficacité de cette technique est très variable selon les espèces et certaines d’entre elles peuvent résister à une pression osmotique élevée. La lyse par choc osmotique ne peut donc pas être appliquée de la même manière à toutes les microalgues (Yoo et col., 2012).

Détergents

Les détergents sont des molécules amphiphiles, c’est‐à‐dire composées d’une partie hydrophile et d’une partie hydrophobe. Cette structure leur permet de solubiliser des molécules telles que les constituants des membranes (notamment les lipides). Cette technique est efficace mais dénature souvent les protéines et pollue les produits obtenus.

Traitement alcalin

La méthode d’extraction alcaline par exemple est fondée sur l’utilisation d’un mélange d’un surfactant tel que le dodécylsulfate de sodium (SDS) avec de l’hydroxyde de sodium (NaOH). Cette méthode a été développée pour extraire l’ADN des cellules (Birnboim & Doly, 1979). Harun et col. (2011) utilisèrent l’hydroxyde de sodium pour libérer et fragmenter des polysaccharides contenus dans les parois de microalgues de la souche C. infusionum. D’après les auteurs l’hydroxyde de sodium rompt les parois cellulaires en clivant les liens intermoléculaires entre les hémicelluloses et les autres composants polymériques. Leur étude montre qu’un pré‐traitement alcalin sur les microalgues peut améliorer l’extraction de sucres et donc la production de bioéthanol.
Des traitements oxydants utilisant le peroxyde d’hydrogène peuvent également être mis en place dans le but de détruire les composants carbonés de la membrane cytoplasmique. C’est par ailleurs une technique classique de désinfection des eaux polluées (Dang, 2011).

Solvants organiques

Les solvants organiques tels que l’acétone, le chloroforme, le cyclohexane, l’éthanol, l’hexane, le méthanol ou un mélange de ceux‐ci, détruisent les membranes cellulaires et dissolvent les lipides. Pour les microalgues, en raison du pourcentage élevé d’huile récupérée, l’extraction par solvent est devenue la méthode d’extraction d’huile et de graisses la plus populaire (Topare et col., 2011). Dans une étude comparative de treize solvants, Ramluckan et col. (2014) ont montré que pour une extraction à l’aide d’un seul solvant par la méthode soxhlet, le chloroforme, l’éthanol et l’hexane offrent les meilleurs rendements d’extraction de lipides avec des efficacités de l’ordre de 10 à 11%. Ces auteurs ont également évalué les mélanges binaires de solvants. Parmi les mélanges testés, le plus efficace a été un mélange 1:1 de chloroforme:éthanol. Ce mélange permet d’extraire des lipides avec un rendement de 11,76% tandis que le meilleur solvant, le chloroforme, permet d’atteindre 10,78%. Cependant les solvants doivent être éliminés des produits au terme de l’extraction. En outre ils peuvent réagir avec les composés d’intérêt et dénaturer les protéines.

Fluides supercritiques

La méthode d’extraction fondée sur les fluides supercritiques exploite l’augmentation du pouvoir de solvatation des fluides lorsqu’ils sont amenés au‐dessus du point critique de température et de pression (Mercer & Armenta, 2011). Parmi les différents fluides possibles, le dioxyde de carbone est caractérisé par un point critique de température et de pression relativement bas. Halim et col. (2011) ont montré dans une étude comparative que l’extraction soxhlet en utilisant l’hexane est significativement moins efficace qu’une extraction à l’aide de dioxyde de carbone supercritique, permettant d’atteindre des rendements d’extraction des lipides comparables chez Chlorococcum sp. en 5,6 fois moins de temps. L’extraction au dioxyde de carbone supercritique permet également une meilleure sélectivité pour l’extraction des triglycérides qu’avec une extraction à l’aide de solvant (Cheng et col., 2011).
Le procédé fondé sur le dioxyde de carbone ne laisse pas de trace dans les produits finaux étant donné que le fluide est à l’état gazeux à température ambiante. C’est donc une solution privilégiée pour l’extraction des produits à haute valeur ajoutée. Malheureusement les algues doivent être d’abord séchées avant le traitement ; or le séchage est un procédé très couteux (aussi bien en termes d’énergie que financièrement). En utilisant du méthanol, Patil et col. (2011) évitèrent ce problème et firent la démonstration d’un procédé supercritique en une seule étape permettant simultanément l’extraction et la transestérification de la biomasse humide pour la production de biodiesel.

Digestion enzymatique

Des enzymes peuvent être utilisée pour digérer spécifiquement des composants de la membrane des cellules. Le traitement enzymatique peut avoir un impact important sur la perméabilité des parois des cellules et peut être utile en complément d’une technique de lyse, en particulier les lysozymes et certaines autres enzymes. Le traitement peut détruire partiellement ou complétement les membranes (Mercer & Armenta, 2011). En raison de l’activité très spécifique des enzymes, cette technique peut être considérée comme douce. Mais en règle générale elle fragilise simplement les membranes plutôt qu’elle ne les détruit vraiment. Ainsi la digestion enzymatique sera plutôt utilisée en complément d’une autre technique de lyse (cours de Margaritis, 2007). Les enzymes sont hélas très chères ; un développement à grande échelle de cette technique est donc limité par son coût.

Lyse mécanique

Ce type de lyse consiste à appliquer une contrainte mécanique importante au niveau de la membrane cellulaire. Il peut s’agir de forces de frottement, forces de cisaillement ou de chocs de pression (Nan et col., 2014). Une lyse mécanique peut être obtenue via plusieurs approches :

Approche optique

La lyse par voie optique est effectuée en émettant une impulsion laser dans une solution contenant les cellules à lyser. Ce dépôt d’énergie très localisé engendre la formation d’un plasma conduisant à la croissance et au collapse d’une bulle de gaz dans le liquide. L’impulsion laser est généralement émise pour une durée de quelques nanosecondes à une longueur d’onde de 532 nm (Lai et col., 2008; Rau et col., 2006) ou 1064 nm (A. Vogel et col., 1996).
Lors de la formation du plasma et lors du collapse de la bulle de gaz, des ondes de choc sont émises et peuvent conduire à la lyse (Brown & Audet, 2008). Rau et col. (2006) mirent en revanche en évidence le rôle principal de la phase de croissance de la bulle sur la lyse de cellules adhérentes à surface ; ces dernières sont alors déchirées sous l’action de forces de cisaillement.

Approche acoustique

La génération d’ondes ultrasonores permet de créer des régions de basses pressions pour former des bulles de cavitation capables, lors de leur formation et leur effondrement, de lyser les cellules. La gamme de fréquences de 20 kHz à 50 kHz est souvent considérée comme la plus efficace pour induire de la cavitation (Canselier et col., 2002; Kim et col., 2013). Cependant les bulles de cavitation atténuent la transmissions des ultrasons (Greenly & Tester, 2015) et la fréquence de désintégration adaptée dépend des propriétés mécaniques de la cellule (Yamamoto et col., 2015). Cette technique entraîne souvent un échauffement de la solution qui peut dénaturer les protéines et elle consomme beaucoup d’énergie. C’est une méthode de lyse nécessitant plusieurs secondes de traitement qui peut en outre dégrader les molécules extraites. Cependant des travaux ont permis de montrer son efficacité sur des spores de bactéries (Marentis et col., 2005) et elle peut être introduite dans des dispositifs sur puce (Nan et col., 2014).

Approche au moyen d’aspérités

Dans leurs articles de revues, Brown & Audet (2008) et Nan et col. (2014) présentent des dispositifs qui engendrent le déchirement de la membrane cellulaire à l’aide de « micro‐ » ou « nanocouteaux » disposés sur une paroi le long de laquelle s’écoule la solution contenant les cellules à lyser.

Approche par agitation de billes solides

La méthode par agitation de billes (« bead milling » en anglais) repose sur la désintégration des membranes cellulaires dans une cuve contenant des billes agitées violemment. La rupture des membranes est liée à un broyage des cellules entre les billes, mais également de collisions avec les billes. L’efficacité du procédé dépend de nombreux paramètres tels que le diamètre des billes et leur concentration, la concentration en microorganismes, le mouvement et la vitesse d’agitation, le débit de solution et la température. La méthode de broyage par agitation de billes est considérée comme l’une des techniques les plus efficaces pour rompre les membranes cellulaires (Chisti & Moo‐Young, 1986) mais sa consommation énergétique intense fait obstacle à son utilisation à grande échelle.

Approche par homogénéisation haute pression

La cavitation peut être produite par la circulation d’un liquide passant dans un venturi. La vitesse du liquide augmente dans le col et ainsi la pression chute. Si la pression devient inférieure à la pression de vapeur saturante alors des bulles de cavitation apparaissent. Plus tard, lorsque la pression augmente ces bulles collapsent violemment et produisent des ondes de choc qui endommageront les membranes cellulaires (Günerken et col., 2015). Dans leurs travaux, Jubeau et col. (2013) mirent en évidence la sélectivité de cette méthode d’extraction d’un pigment sur la microalgue Porphyridium cruentum.

Lyse thermique

L’élévation de la température provoque la rupture de la chaîne phospholipidique constituant la membrane de la cellule chez certaines espèces. Cependant de nombreuses cellules dites thermorésistantes ne sont pas sensibles à cet effet. L’effet de l’élévation de température pour lyser les membranes est donc relativement limité ; néanmoins cette technique est intéressante car elle est simple à intégrer sur des laboratoires sur puces (Nan et col., 2014).

Lyse électrique

Les membranes de microorganismes peuvent être perméabilisées sous l’effet d’un potentiel transmembranaire d’environ 0,2‐1V (Chen, et col., 2006). Cette technique appelée électroporation permet à la fois la lyse de petites cellules (avec des champs électriques de l’ordre de 10 kV.cm‐1 pour lyser des microorganismes de 1 à 2 µm de diamètre) et celle de cellules plus grosses (avec des champs de l’ordre de 1,5 kV.cm‐1 pour ouvrir des protoplastes de 20 à 40 µm).
Afin de limiter les risques d’électrolyse et de chauffage par effet Joule, les champs électriques sont souvent pulsés. Lorsque l’intensité et la durée de l’exposition au champ électrique sont respectivement faibles et courts, les pores peuvent se refermer spontanément. En revanche, avec des intensités plus importantes et des temps d’exposition longs, la membrane cellulaire est détériorée de façon irréversible, ce qui conduit à la lyse de la cellule et à sa mort (Bao et col., 2010). Les trous formés dans la membrane peuvent favoriser les transferts de masse rendant ainsi l’électroporation une technique de lyse efficace. Cette technique est également facile à intégrer puisqu’elle ne nécessite que deux électrodes dans le dispositif.

Une technique innovante fondée sur des décharges haute tension

Similitudes avec la lithotripsie

Dans ce travail de thèse, une technique de lyse fondée sur la génération d’arcs électriques au sein d’une solution peu conductrice va être étudiée. Ces arcs vont être produits en appliquant une différence de potentiel de plusieurs kilovolts pendant quelques microsecondes entre deux électrodes pointues immergées dans la solution contenant les microorganismes à lyser. L’apparition d’un arc électrique dans la solution a pour conséquence notable la production d’ondes de choc (Hoffer, 2014). La technique de lyse envisagée dans cette étude reposera sur l’exploitation de ces ondes de choc pour détruire les membranes des microorganismes. De ce point de vue, ce procédé de lyse se rapproche de celui développé par Broyer et son équipe (1995) pour la lithotripsie. La technique envisagée peut également être comparée aux techniques de lyse utilisant un laser pour produire une bulle de cavitation dont l’effondrement va également entrainer la production d’ondes de choc. Cependant elle devrait être plus simple à concevoir et à fabriquer ; l’utilisation directe de l’énergie électrique devrait en outre permettre d’éviter des étapes de conversion d’énergie, dans le but de concevoir un système peu énergivore. A notre connaissance, aucun travail visant ces objectifs n’a encore été mené dans le cadre de la lyse de microorganismes par ondes de choc.

Une décharge électrique aux effets multiples…

Outre les effets mécaniques associés à la génération d’une onde de choc, la décharge électrique en milieu aqueux engendre une multitude d’autres effets de natures électrique, chimique ou encore thermique (Broyer, 1995). A partir de ce constat, la technique de lyse par décharges électriques devrait être davantage efficace puisqu’elle permettra le couplage de différents effets conduisant à la lyse. Nous attendons ainsi un rendement énergétique élevé.
Les différents effets engendrés par la décharge seront listés et leurs intensités seront évaluées dans le chapitre 3. Nous verrons alors quels effets ont de l’importance dans la lyse de microorganismes et lesquels peuvent être négligés. Ces effets seront ensuite testés sur les microorganismes d’intérêt dans les chapitres suivants.

Table des matières

Introduction
Chapitre 1
1. La membrane cellulaire
1.1. Description
1.2. Ouverture de la membrane
2. Valorisation des constituants de microalgues
2.1. Contexte
2.2. Produits potentiels
2.3. Deux approches
3. Analyse des constituants de bactéries
3.1. Différents types d’analyses
3.2. Développement de systèmes d’analyse d’échantillons bruts
4. Différentes techniques de lyse
4.1. Méthodes chimiques
4.2. Lyse mécanique
4.3. Lyse thermique
4.4. Lyse électrique
5. Une technique innovante fondée sur des décharges haute tension
5.1. Similitudes avec la lithotripsie
5.2. Une décharge électrique aux effets multiples…
5.3. … à une échelle millifluidique
Chapitre 2
1. Mécanismes de formation d’arcs électriques entre deux électrodes immergées
1.1. Etat de l’art
1.2. Choix d’une configuration
2. Matériels et méthodes
2.1. Fabrication de la « cuve infinie »
2.2. Conception et fabrication de la « cuve en U »
2.3. Générateur de haute tension
2.4. Générateur d’impulsion et oscilloscope numérique
2.5. Acquisition vidéo ultra‐rapide
2.6. Capteur de pression
2.7. Vue d’ensemble du banc d’étude
3. Phénoménologie de la décharge électrique : formation d’un arc
3.1. Formation d’un arc électrique
3.2. Etude du comportement électrique entre les électrodes
4. Comportement hydraulique en milieu non confiné
4.1. Formation et effondrement (collapse) d’une bulle
4.2. Rebonds de la bulle
4.3. Evolution des paramètres de la bulle
4.4. Observation des ondes dans la cuve
4.5. Aperçu sur la modélisation des phénomènes électrohydrodynamiques entres les électrodes
5. Comportement hydraulique en milieu confiné
5.1. Modification de la « cuve infinie »
5.2. Etude dans la cuve en U
Conclusion
Annexe 1 : Quelques limites du modèle isentropique
Chapitre 3
1. Bilan des différents postes de dépense de l’énergie du générateur électrique
2. Champ électrique
2.1. Simulation du champ électrique produit
2.2. Analyse de la cartographie
2.3. Conclusion
3. Rayonnement et production de radicaux libres et d’espèces oxydantes
3.1. Etude du rayonnement lumineux
3.2. Analyse chimique
4. Effets mécaniques
4.1. Effet du confinement sur le collapse
4.2. Cisaillement
4.3. Ondes de pression
5. Echauffement
5.1. Mesures
5.2. Conclusion
6. Stratégie mise en place pour la suite de l’étude
6.1. Mécanismes écartés pour la lyse
6.2. Mécanismes retenus pour la lyse
Chapitre 4
1. Matériels et méthodes
1.1. Amélioration de la cuve en U
1.2. Préparation des cultures de microalgues
1.3. Protocoles pour la préparation et la lyse des échantillons de microalgues
1.4. Ouverture des microalgues à l’aide du diméthylsulfoxyde
1.5. Protocoles d’analyse des échantillons
2. Validation des protocoles
2.1. Validation des méthodes de caractérisation optique
2.2. Vérification des relations entre les concentrations d’intérêt et les mesures optiques
2.3. Rendements d’extraction après traitement par des décharges haute tension : validation de la méthode
2.4. Observation au microscope des échantillons
3. Résultats
3.1. Impact du nombre de décharges sur le rendement de lyse
3.2. Effet de la concentration des microalgues
3.3. Effets de la hauteur de solution
3.4. Effets du chauffage et des oxydants produits au cours du traitement par décharges
4. Discussions
4.1. Démarrage d’une activité de traitement des microalgues
4.2. Des résultats en faveur d’une lyse par effets mécaniques
4.3. Récupération des composés d’intérêt
Chapitre 5
1. Matériels et méthodes
1.1. Fabrication des cuves
1.2. Préparation des cultures de bactéries
1.3. Traitement des échantillons
1.4. Analyse des bactéries traitées
1.5. Analyse de l’ADN en solution
2. Résultats
2.1. Preuve de concept
2.2. Comparaison entre plusieurs techniques d’extraction de l’ADN
2.3. Caractérisation du traitement par décharges haute tension pour libérer l’ADN par comparaison avec l’instrument Précellys 24
2.4. Caractérisation des pertes d’ADN au cours du traitement par décharges
2.5. Impact de l’écart entre les pointes des électrodes et ajout de BSA
3. Discussions
Chapitre 6
1. Conception d’un système de pompage pour la bioproduction
1.1. La vanne capillaire
1.2. Conception et fabrication d’une cuve
1.3. Résultats et discussions
1.4. Vieillissement de la cuve
2. Etude d’un système d’analyse in situ par amplification isotherme
2.1. Etude thermique
2.2. Faisabilité d’une détection in situ
Conclusion
Conclusion générale
Annexe 1 : Liste des contributions scientifiques
Annexe 2 : Schéma électrique complet du générateur haute tension
Bibliographie

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