Mécanismes de défense du pois chiche Cicer arietinum L.

Mécanismes de défense du pois chiche Cicer arietinum L.

Le matériel fongique:

La souche d’Ascochyta rabiei utilisée, provient d’une culture monospore du champignon obtenue à partir de gousses, des tiges ou des feuilles de plantes atteintes d’anthracnose prélevées dans la région d’Ain Témouchent. Le champignon est conservé à 4 °C dans des tubes à essai contenant de l’huile de vaseline stérile sous forme d’explantats de 0,5 cm découpés dans des colonies pures d’Ascochyta rabiei obtenues sur le milieu de culture PC (Pois Chiche) .

Culture du champignon:

Sous des conditions aseptiques, les explantats du mycélium d’Ascochyta rabiei,conservés dans l’huile de vaseline, sont soigneusement séchés sur du papier filtre stérile pour absorber toute l’huile. Ils sont mis en culture dans des boites de Pétri contenant du milieu pois chiche (PC) à raison d’un explantat par boite de telle façon que le mycélium soit en contact avec le milieu. Les boites scellées avec du parafilm, sont incubées à température ambiante, sous une photopériode de 12 heures .

Préparation de la suspension de spore du pathogène
La suspension de spores est préparée à partir d’une culture fongique de 14 jours. La méthode suivie et celle décrite par Gustine et Sherwood (1978). Les spores sont délicatement grattées de la surface de la culture fongique avec une spatule stérile puis suspendues dans 10 ml d’eau distillée stérile. La suspension est filtrée à travers du papier filtre stérile, puis sa concentration ajustée à 106 spores /ml après comptage sur la cellule de Malassez .

Obtention et maintien des cals hôtes
L’initiation de la callogenèse est établie à partir de folioles, de segments de tiges et de cotylédons. Sous des conditions aseptiques, les explants foliaires et des entrenœuds de 5 mm de longueur prélevés de plantes âgées de 03 semaines, sont désinfectés par immersion dans de l’éthanol à 70° pendant 30 secondes, puis dans une solution d’hypochlorite de sodium à 5 % pendant une minute et enfin rincés trois fois avec de l’eau distillée stérile. Pour les cotylédons, les graines sont lavées à l’eau courante puis désinfectées sous hotte à flux laminaire dans une solution d’hypochlorite de sodium à 2 % pendant 5 minutes et rincées 3 fois avec de l’eau distillée stérile. Elles sont conservées dans l’eau distillée stérile pendant 12 h à 4 °C pour imbibition tout en évitant leur germination. Sous conditions stériles, le tégument est ôté et les cotylédons sont séparés des embryons puis récupérés.

Analyse statistique
Les pourcentages de cals formés à partir des deux types d’explants des différents génotypes sont analysés grâce au logiciel SPSS (Statistical Package for Social Science software, version 17.0). Une analyse de variance est d’abord effectuée pour évaluer la significativité des effets testés, puis les moyennes sont comparées par le test de Duncan afin de déterminer les groupes homogènes à α <0,05.

Préparation du pathosystème cal de Cicer arietinum / spores d’Ascochyta rabiei
Le pathosystème utilisé regroupe un cal ou amas cellulaire de cellules indifférenciées obtenu par culture in vitro de tissus végétaux de la plante hôte.

Étude de la confrontation du pathosystème cal/ suspension de spores
L’interaction entre l’hôte et son parasite est suivie sur le plan macroscopique, histologique et biochimique.
₋ Le suivi macroscopique des cals inoculés pour évaluer les modifications extérieures.
₋ L’étude microscopique par des observations cytologiques et histo-cytostohimiques permet d’une part le suivi de l’infection et aussi la mise en évidence de substances accumulées de novo inhérentes à la réaction.
₋ L’étude biochimique permet d’analyser l’évolution de quelques marqueurs choisis, à savoir les sucres solubles totaux, protéines totales, polyphénols et flavonoïdes, ayant un rapport direct avec les réactions de l’hôte et du parasite suite à la confrontation. Des échantillons sont prélevés pour l’étude histologique après 0, 12, 24, 48, 72 heures puis 7 et 14 jours après inoculation (Kadiri et al., 2012). Pour l’étude biochimique, des échantillons témoins et inoculés sont prélevés à 0, 5, 10, 15 et 20 jours de l’inoculation (Kumar et al., 2010).

Étude histologique des cals
L’étude histologique et histochimique des cals traités ou non traités nécessite une fixation des échantillons dans un état aussi proche que possible du vivant par un fixateur approprié puis leur inclusion dans la paraffine.

Confection et collage des coupes
Des coupes sériées de 7 à 10 µm sont confectionnées avec un microtome de type « Spencer 820 ». Les rubans obtenus sont collés sur des lames porte-objets en verre avec de l’eau albuminée. Les lames ainsi préparées sont placées sur une plaque chauffante à 40 °C ce qui permet l’étalement des rubans et la fixation des échantillons.

Déparaffinage et réhydratation des coupes
Avant leur coloration les coupes doivent être débarrassées de la paraffine pour permettre la pénétration des colorants aqueux dans les échantillons. Le déparaffinage se fait selon les étapes suivantes :
– Bain de toluène pur pendant 20 min sur plaque chauffante à 50 °C
– Bain de toluène pendant 10 min
– Bain de toluène pendant 10 min
– Bain d’éthanol 100° pendant 15 min
– Bain d’éthanol 100° pendant 15 min
– Bain d’un mélange d’éthanol absolu et de formol (4 :1) 5 min
– Rinçage à l’eau courante.
Ainsi préparées, les lames sont conservées à l’abri de la poussière puis colorées.

Discussion:

Initiation de la callogenèse

La mise en place d’un protocole de callogenèse rapide et reproductible est importante pour toute transformation chez le pois chiche Cicer arietinum de nature récalcitrante à la culture in vitro. Dans cette perspective, l’étude de l’effet de quelques facteurs régissant la callogenèse est entreprise chez des explants de folioles, d’entrenœuds et de cotylédons de sept génotypes de Cicer arietinum L. mis en culture sur le milieu MS modifié additionné de régulateurs de croissance. Après 1 mois de culture, un taux variable de callogenèse est obtenu. Cette différence est sous l’influence des effets individuels et interactifs de trois facteurs à savoir le génotype, la source d’explant mis en culture et les régulateurs de  croissance ajoutés au milieu. Ces trois éléments réunis, sont décisifs pour l’expression du potentiel callogène chez Cicer arietinum L. (Arora et Chawla. 2005; Khan et al., 2011; Kadiri et al., 2013; Kadiri et al., 2014).

Les résultats montrent que le taux de callogenèse diffère significativement selon le génotype utilisé. Zouaoui présente une réactivité plus élevée par rapport aux autres génotypes INRA 199, Bousahla, ILC483, Flip82 150C, ILC200 et ICC3996C. Khan et al (2011) rapportent que la réponse de deux génotypes indigènes de pois chiche, KK1 et Hassan-2 K cultivés in vitro sous les mêmes conditions, expriment des aptitudes différentes à la callogenèse. Cette spécificité dans l’expression du potentiel callogène selon le génotype utilisé est souvent rapportée aussi bien chez le pois chiche (Rao et Chopra, 1987; Islam et al., 1998; Arora et Chawla, 2005; Mirakabad et al., 2010; Khan et al., 2011) que chez d’autres dicotylédones herbacées comme la laitue (Mohebodini et al., 2011); le tabac (Ali et al., 2007); le coton (Zouzou et al., 2008), des ligneuses, tels le noyer (Avilès et al., 2009), le citronnier (Label et al., 2015) ou des monocotylédones comme le palmier dattier (Sané et al., 2012), le blé (Rashid et al., 2009) et la canne à sucre (Gandounou et al., 2005).

Histologie
La mise en culture des explants sur les milieux initie une déspécialisation ou dédifférenciation de certaines cellules appelées cellules cibles (Gueye et al., 2009). Ces dernières indifférenciées, prolifèrent pour donner naissance à un cal dont la composition cellulaire peut être hétérogène (cellules méristématiques, parenchymes, tissus de conduction, etc.). Cette dédifférenciation peut être suivie par une organogenèse, une embryogenèse ou callogenèse.

Les protéines
Les plantes possèdent des mécanismes préformés et induits pour résister à l’invasion du pathogène. Une fois le contact établi, les éliciteurs produits par le pathogène induisent entre autres la synthèse de protéines reliées (PR) la pathogenèse (Davar et al., 2012). Les protéines représentent une classe de composés utilisés comme marqueurs biochimiques de l’infection. L’interaction entre l’hôte et le parasite exerce un effet sur la synthèse des protéines de l’hôte et son activité enzymatique. La vitesse d’une telle réaction peut être décisive dans la sensibilité ou la résistance de l’hôte (Sudha et Ravishankar, 2002). Selon Subba Rao (1987), l’évolution quantitative du contenu protéique lors d’infection par des champignons est relative à la résistance où la sensibilité des plantes.

Les composés phénoliques
Les plantes utilisent des mécanismes non spécifiques pour éliminer le champignon comme l’augmentation du taux des composés phénoliques (Misra et al. 2008). De tous les composés biochimiques chez l’hôte ces derniers sont identifiés comme responsables de la résistance chez plusieurs plantes. Ils peuvent entrainer le ralentissement de l’infection ou l’arrêt total de la propagation (Chatterjee et Gosh, 2008 ; Kumar et al., 2011) ou seraient aptes à inhiber les toxines des pathogènes (Subba Rao, 1987).

Les flavonoïdes
Les flavonoïdes sont des métabolites secondaires produits par les plantes présents à travers le règne végétal. Plus de 9000 composés de ce groupe sont connus et participent à la protection des plantes contre les stress biotiques et abiotiques (Lattanzio et al., 2006). Ils ont une propriété antioxydante. Ils contribuent à l’épaississement des structures de la plante en modifiant l’activité de l’acide indole acétique ce qui engendre un déclenchement de dédifférenciation de tissus et formation de callose et de tylose qui obstruent le système vasculaire pour stopper l’infection. Les flavonoïdes sont transportés au site de d’infection et induisent une réaction d’hypersensibilité et la mort cellulaire. Ils peuvent aussi être directement impliqué dans l’inhibition des enzymes du pathogène spécialement ceux responsables de la dégradation de la paroi de l’hôte. Ils peuvent empêcher l’adhésion du pathogène et le transport transmembranaire des protéines. Ils peuvent également déstabiliser la membrane du pathogène, change sa fluidité et peut également déstabiliser la chaine respiratoire (Mierziak et al., 2014). Les résultats obtenus montrent que le taux de flavonoïdes augmente sous l’effet de l’inoculation plus particulièrement chez les génotypes résistants et diminue avec le temps. La même observation est rapportée chez le soja infecté par Macrophomina phaseolina (Bellaloui et al., 2012). Cependant, le taux de flavonoïdes n’est pas toujours corrélé au développement des symptômes (Scarpari et al., 2005) et leur taux peut diminuer chez l’inoculé (Mathpal et al., 2011).

Conclusion générale et perspectives:

Le pois chiche est une légumineuse d’importance capitale dans l’alimentation et l’économie dans plusieurs régions. Cette plante est soumise à des stress biotiques dont le champignon Ascochyta rabiei agent de l’anthracnose qui peut causer la perte totale de la récolte. L’étude de cette maladie présente un intérêt particulier pour les phytopathologistes, les sélectionneurs et les services de protections de cultures. Bien que des techniques de lutte existent, leur utilisation reste insuffisante et la sélection de variétés résistantes présente ainsi la solution de choix. Sa mise en pratique par le biais de la culture de tissus in vitro constitue une alternative prometteuse pour la sélection de clones à caractères intéressants. Ainsi, il est donc nécessaire de connaitre les mécanismes accompagnant la pathogénèse chez l’hôte, en particulier ceux liés à la réaction de la plante à l’action du parasite. Le test de pathogénicité sur des folioles détachées réalisé in vitro, confirme le type de réaction des différents génotypes de pois chiche utilisés à l’agent pathogène et révèle que Zouaoui est un génotype sensible à Ascochyta rabiei. Le pathosystème utilisé nécessite la production de cals par la culture de tissus in vitro à partir de différents génotypes de pois chiche. A cet effet, dix-sept différentes balances hormonales additionnées au milieu de Murashige et Skoog sont testées. Seuls cinq semblent favorables à l’initiation de la callogenèse chez Cicer arietinum. La nature récalcitrante du pois chiche à la culture in vitro et le brunissement des cals observé. sont contournés par l’utilisation du MS modifié par la diminution du saccharose. La production de cals utilisés comme hôte nécessiterait de tester d’autres milieux nutritifs tel le milieu Gamborg avec de plus faibles concentrations de saccharose et d’autres types de régulateurs de croissance pour optimiser l’initiation puis la prolifération des cals.

Table des matières

Introduction 
Analyse bibliographique
Le pois chiche
Origine et domestication
Taxonomie
Caractéristiques botaniques de Cicer arietinum L
Importance du pois chiche
Importance économique
Importance écologique et agronomique
Valeur nutritive
Stress biotique et abiotique du pois chiche
Étude de l’agent de l’anthracnose du pois chiche Ascochyta rabiei (Pass.) Labr.
Historique
Taxonomie
Description du pathogène 
L’anthracnose
Distribution et impact économique
Symptomatologie de l’anthracnose
Les sources de l’infection, son développement et cycle de la maladie
Le processus infectieux et l’histopathologie de l’anthracnose
La défense des plantes
Les défenses passives/constitutives
Les défenses actives
Voies métaboliques primaires des plantes et leur rôle dans la défense
Métabolisme des sucres
Métabolisme des acides Aminés
Métabolisme des lipides
Mécanismes de défense du pois chiche Cicer arietinum L.
Les mécanismes constitutifs passifs
Mécanismes actifs, induits
Les méthodes de lutte
Méthodes culturales 
La lutte chimique
La lutte biologique
La lutte génétique
Apport des biotechnologies à l’amélioration des plantes
La culture in vitro
Le criblage in vitro
Application de la culture in vitro pour l’amélioration du pois chiche
Matériel et méthodes
Le matériel végétal
Le matériel fongique
Culture du champignon
Préparation de la suspension de spore du pathogène
Test de pathogénicité du champignon
Obtention et maintien des cals hôtes
Analyse statistique 
Préparation du pathosystème cal de Cicer arietinum/spores d’Ascochyta rabiei
Étude de la confrontation du pathosystème cal/ suspension de spores
Étude histologique des cals
Fixation
Déshydratation
Imprégnation
Inclusion finale dans la paraffine
Confection et collage des coupes
Déparaffinage et réhydratation des coupes
Coloration des coupes
Coloration au bleu de toluidine O
Localisation histochimique des phénols
Mise en évidence des flavonoïdes
Étude de l’effet de l’inoculation par la suspension de spores d’Ascochyta rabiei sur le profil biochimique des cals
Estimation quantitative des sucres solubles totaux
Estimation quantitative des protéines solubles totales
Estimation des polyphénols
Estimation des flavonoïdes
Analyse statistique
Étude qualitative des composés phénoliques des cals
Détection d’activité antifongique dans les extraits de cals par bioautographie directe
Résultats 
Initiation de la callogenèse
Influence du génotype sur la callogenèse
Influence des régulateurs de croissance sur la callogenèse chez Cicer arietinum L.
Influence du type d’explant sur la callogenèse chez Cicer arietinum L.
Résultat du test de pathogénicité d’Ascochyta rabiei
Suivi macroscopique de l’interaction cals de Cicer arietinum/ Ascochyta rabiei
Suivi microscopique de l’interaction cals de Cicer arietinum/ Ascochyta rabiei
Étude Histologique des cals témoins
Étude histologique des cals inoculés
Localisation histochimique des phénols
Localisation histochimique des flavonoïdes
Études des modifications biochimiques
Évolution des protéines totales
Évolution des sucres solubles totaux
Évolution des composés phénoliques
Évolution des flavonoïdes
Corrélation entre les métabolites primaires et secondaires
Analyse qualitative des composés phénoliques des extraits de cals
La bioautographie directe par chromatographie sur couche mince CCM
Discussion 
Initiation de la callogenèse
Histologie
Effet De l’inoculation Par La Suspension De Spores d’Ascochyta Rabiei Sur Le Profil
Biochimique des Cals
Etude qualitative des composés phénoliques et bioautographie
Conclusion générale et perspectives

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