Mécanismes antioxydants des systèmes phénoliques

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Rôle écologique

Cette espèce est très utile pour lutter contre l’érosion et la désertification car elle se régénère naturellement après les incendies en émettant de nouveaux drageons.

Exigences écologiques du taxon

Bien que le palmier nain ait été décrit par Herrera (1989) comme une plante sans préférences évidentes quant au type de sol ou de substrat, de récentes études ont constaté une préférence au sol généralement sablonneux et que les basses terres et les marais susceptibles d’être inondés manquaient de palmiers nains (Miguel Jácome-Flores et al., 2016).
Selon Giovino et al., (2014), C. humilis est l’une des espèces de palmiers les plus tolérantes au froid (jusqu’à -12°C). Cette espèce tolère très bien le calcaire. La plante préfère des pentes dépassant même les 15%, des sols rocheux, pauvres ou semi-arides méditerranéens dont le pH ne dépasse pas 7. De plus, C. humilis préfère des pluviométries assez élevées (450 – 900 mm) ainsi qu’un ensoleillement et une chaleur élevée.

Utilisation du C. humilis

Utilisation artisanale et industrielle

Les feuilles de cette plante, récoltées en été et séchées au soleil, sont utilisées pour fabriquer des paniers, des sièges de chaises et des balais (Pinto & Pernes, 2010). Les fibres des feuilles sont utilisées dans l’industrie du papier (Pinto & Pernes, 2010). Au niveau alimentaire, il est fait référence à l’utilisation des fruits bien qu’ils aient un goût rugueux. Les feuilles tendres et les bourgeons terminaux sont utilisés en salade (Pinto & Pernes, 2010).

Utilisation médicinale

D’après Benmehdi et al., (2012), C. humilis est utilisée dans le traitement de la diarrhée, spasmes et troubles gastro-intestinaux, probablement, en raison de sa richesse en tanins. En médecine traditionnelle marocaine, Gaamoussi et al., (2010) signalent son utilisation dans le traitement du diabète, à travers un mélange aqueux fait à partir de ses feuilles qui ont des effets hypoglycémiants.

Données phytochimiques de la plante

Les informations concernant les constituants chimiques de C. humilis sont rares, et les travaux existants sont préliminaires. Les travaux de Benhamadi (2012) ; coelho (2017) ont montré que les extraits des feuilles et des fruits étudiées contiennent plusieurs composés chimiques, notamment, tannins galliques, dérivées alcaloïdiques, flavonoïques, composées réducteurs, saponines, stéroïdes et terpènoïdes.
Dans une étude récente portant sur l’analyse chimique de l’huile extraite de la graine d’une variété tunisienne de C. humilis, Nehdi et al. (2014) ont démontré la présence de composés bénéfiques pour la santé tels que les acides gras et les tocotriénols (forme rare de vitamine E).

Données pharmacologiques

Des extraits réalisés avec différentes parties de C. humilis ont montré des propriétés pharmacologiques significatives. Par exemple, les expériences faites sur les rats ont prouvé que l’extrait aqueux (décoction) des feuilles, possède une activité antidiabétique (Gaamoussi et al., 2010). Les extraits obtenus à partir de différents solvants organiques (hexane, chloroforme) et aqueux des feuilles et fruits de Chamaerops humilis ont présenté une activité antibactérienne sur les Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis et Listeria monocytogenes (Hasnaoui et al., 2013). Des activités antioxydante et antispasmodique ont aussi été mises en évidence (Benmehdi et al., 2012 ; Coelho et al., 2017).

Radicaux libres, stress oxydant et antioxydants

Dans ce chapitre, nous allons présenter les molécules responsables de l’oxydation et celles qui permettent de la combattre.

Les radicaux libres

Les radicaux libres sont des espèces chimiques instables, neutres ou chargées, qui possèdent un électron célibataire sur leur couche périphérique et dont la toxicité est importante (Halliwell, 1999). Pour retrouver un état plus stable, ils réagissent avec d’autres molécules (les substrats biologiques) dans le but de récupérer un électron.
On peut distinguer les radicaux primaires formés directement à partir de l’oxygène ou de l’azote et sont appelés Espèces Réactives de l’Oxygène (ERO) ou Espèces Réactives de l’azote (ERN) et les radicaux secondaires, issus de la réaction des radicaux primaires avec des entités biochimiques cellulaires (lipides, protéines, glucides…) (Gardès-Albert et al., 2003 ; Favier et al., 2003).
La formation des différents radicaux libres à partir de l’oxygène (O2) est résumée dans la figure 8

Le radical superoxyde, O2•-

L’anion superoxyde est une ERO primaire, formée par l’acquisition d’un électron par l’oxygène moléculaire ; Radical ayant la réactivité la plus faible parmi les radicaux libres du stress oxydant, il est généré à partir de différentes sources dans les conditions physiologiques et physiopathologiques (Gardès-Albert et al., 2005). Il est cependant hautement réactif avec certains métaux de transition comme le cuivre, le fer et le manganèse (Abreu et al., 2010).
Le radical superoxyde ne traverse pas rapidement la membrane plasmique et se dismute spontanément au pH physiologique en produisant du peroxyde d’hydrogène : 2 O2•- + 2 H+ → O2 + H2O2
L’anion superoxyde O2•- et sa forme acide ont une faible réactivité ; En revanche, en présence de cation métallique, l’anion superoxyde O2•- donne naissance au radical hydroxyle OH•, ou acide hypochloreux très réactif.

Le peroxyde d’hydrogène, H2O2

Ce n’est pas un radical libre, à proprement parler, mais une molécule car tous ses électrons périphériques sont appariés. Le peroxyde d’hydrogène est généralement considéré comme une ERO relativement faible mais hautement réactive, en particulier dans sa capacité à réagir avec les cations métalliques tels que Fe2+ (réaction de Fenton) ou Cu+2, ce qui génère des radicaux hydroxyles HO●. (Wardman et al., 1996). H2O2 + Fe2+→ HO● + OH- + Fe3+ (Réaction de Fenton)
Il se forme par dismutation de l’anion superoxyde O2 •- sous l’action d’une enzyme : la superoxyde dismutase (SOD) (Belkheiri, 2010).

L’acide hypochloreux, HOCl

Comme le peroxyde d’hydrogène, l’acide hypochloreux ne rentre pas dans la définition stricte du radical. Cependant, au cours de l’inflammation, la métabolisation du peroxyde d’hydrogène en acide hypochloreux, par une enzyme, est élevée et l’acide hypochloreux est un agent chlorant et oxydant fort. H2O2 + Cl-+ H+→ HOCl + H2O
L’acide hypochloreux est considéré comme 100 à 1000 fois plus toxique que le radical superoxyde ou le peroxyde d’hydrogène et a des cibles bien marquées : inactivation enzymatique, oxydation des groupements thiols de la membrane plasmique, diminution des propriétés d’adhésion de certains composés de la matrice extracellulaire (Lenoir, 2011).

Le radical hydroxyle, HO•

Le radical hydroxyle HO● est considéré comme l’ERO la plus réactive (toxique) (Lubec, 1996) ; il est particulièrement délétère vis-à-vis des matériaux biologiques. Il est formé à partir du peroxyde d’hydrogène au cours de la réaction de Fenton ou à partir de l’anion superoxyde dans la réaction d’Haber-Weiss ou sous l’effet de radiations ionisantes (rayons X ou gamma).
O2•- + H2O2 ⟶ OH- + OH• + O2 (Reaction d’Haber-Weiss)

Le Stress oxydant

La génération des espèces réactives de l’oxygène (ERO) se produit naturellement au cours de la respiration cellulaire. Les ERO désignent une appellation collective et comprennent les radicaux libres. Les ERO endommagent la vie cellulaire en causant l’oxydation des lipides, des protéines et de l’acide désoxyribonucléique (ADN).
Dans des conditions normales, ces radicaux libres sont physiologiquement en équilibre avec des composés antioxydants. Dans certaines conditions, au cours d’une inflammation ou en réponse à certains facteurs environnementaux comme les irradiations (UV ou rayons X), les carences nutritionnelles (en vitamines et oligo-éléments), le tabac, la pollution ou les intoxications aux métaux lourds (mercure, plomb, cadmium), la production de ces radicaux libres augmente générant un déséquilibre en faveur des entités oxydantes appelé « stress oxydatif » (Favier, 2003).En d’autres termes, « stress oxydant » ne signifie pas présence mais excès de ces agents oxydants ; Il apparaîtra si la production d’ERO est trop importante pour être régulée ou bien si le système antioxydant est défaillant (Dickinson & Forman, 2002).

Les cibles des ERO

La présence d’espèces activées de l’oxygène a des conséquences potentiellement graves pour la cellule

Oxydation des composés lipidiques

Les acides gras polyinsaturés ainsi que les phospholipides membranaires sont les cibles privilégiées des attaques oxydatives. Les membranes sont plus particulièrement visées par le radical hydroxyle capable d’arracher un atome d’hydrogène sur les carbones situés entre deux doubles liaisons (Lenoir, 2011).
La peroxydation lipidique provoque une désorganisation de la structure, une diminution de sa fluidité et une altération de son fonctionnement. Elle peut aussi participer au dépôt de lipides oxydés dans les vaisseaux et les tissus âgés, et contribuer à la genèse de dérivés carcinogènes (Techer, 2013).

Oxydation des composés protéiques

La modification structurale mineure d’une protéine peut induire une forte variabilité dans le fonctionnement de celle-ci. Les radicaux libres peuvent provoquer différents types de dégradation sur une protéine pouvant conduire à la perte de son activité : fragmentation au niveau des liaisons peptidiques, oxydation des chaînes latérales, formation de liaisons intra ou interprotéines. Les acides aminés soufrés (cystéine et méthionine) et aromatiques (tyrosine, tryptophane) sont les plus sensibles.
L’attaque des radicaux libres sur les fonctions thiols (SH) des cystéines conduit à la formation de ponts disulfures (S-S), ce qui modifie la protéine qui peut être éliminée par le protéasome (Techer, 2013). Comme pour les lipides, c’est le radical hydroxyle qui est le plus réactif pour induire les altérations. Les protéines modifiées par oxydation perdent leurs propriétés biologiques (enzyme, anti-enzyme, récepteur…) et deviennent beaucoup plus sensibles à l’action des protéases et notamment du protéasome. Les protéines oxydées deviennent aussi très hydrophobes, soit par suppression de groupements amines ionisables, soit par extériorisation de zones hydrophobes centrales. Elles vont alors former des amas anormaux dans ou autour des cellules. Ces amas, associés aux lipides, forment les dépôts de lipofuschines caractéristiques des tissus des sujets âgés (Favier, 2003).

Oxydation de l’ADN

Bien que l’ADN soit la mémoire de toute la composition biochimique des êtres vivants, il s’agit d’une molécule très sensible, à l’attaque par les radicaux de l’oxygène. Selon Favier (2003), HO● peut générer des dommages oxydatifs. Les bases qui composent l’ADN, et particulièrement la guanine, sont sensibles à l’oxydation. L’attaque radicalaire peut être directe et entraîner l’oxydation des bases, engendrant un grand nombre de bases modifiées. Mais le stress oxydant peut aussi attaquer la liaison entre la base et le désoxyribose (Valko et al., 2006), créant un site abasique, ou attaquer le sucre lui-même, créant une coupure de chaîne simple brin. Ces altérations du matériel génétique, si elles ne sont pas réparées, peuvent engendrer la mutagenèse, la carcinogenèse ainsi que le vieillissement (Favier ,2003).

Les antioxydants

Pour protéger ses tissus contre toute agression radicalaire, l’organisme humain possède des systèmes antioxydants : définis comme des substances capables, à des concentrations relativement faibles, de retarder ou d’inhiber l’oxydation de substrats (Halliwell, 1999).
Parmi les différents antioxydants, les plus connus sont les polyphénols, les vitamines A, C et E, et les enzymes superoxyde-dismutase (SOD), catalase (CAT) et glutathion peroxydase (GPX). D’autres antioxydants comme les caroténoïdes, le coenzyme Q10, les antioxydants minéraux (cuivre, zinc, manganèse et le sélénium) et les cofacteurs (les vitamines B1, B2, B6, B12) peuvent aussi défendre de façon synergique l’organisme contre le stress oxydant (Belkheiri, 2010). Les antioxydants peuvent être enzymatiques ou non enzymatiques. Ces derniers pourront alors être soit endogènes, soit exogènes.

Les systèmes antioxydants enzymatiques

Ces enzymes permettent de maintenir la concentration en espèces radicalaires à un taux basal (homéostasie physiologique) ; Elles possèdent, en effet, une grande affinité pour les ERO, avec lesquelles elles réagissent très rapidement pour les neutraliser.

La Superoxyde dismutase (SOD)

La superoxyde dismutase est une métalloprotéine présente sous deux formes chez les eucaryotes. La plus importante a pour cofacteurs le cuivre et le zinc (CuZn-SOD) et se situe dans le cytoplasme de toutes les cellules ; L’autre enzyme a pour cofacteur le manganèse (Mn-SOD) et pour localisation les mitochondries (Hadi, 2004).
La SOD est une des plus importantes enzymes cellulaires possédant une fonction antioxydante. C’est l’enzyme antioxydante “anti-O2 •- ” la plus importante dans toutes les cellules vasculaires car elle catalyse la dismutation de l’anion superoxyde en eau oxygénée. L’absence de cette enzyme peut être létale (Salvayre et al., 2003 ; Soulère et al., 2002). 2H++2O2•-→H2O2+O2

La catalase

La catalase est une enzyme intracellulaire, localisée principalement dans les peroxysomes. Elle catalyse la réaction de détoxification du H2O2 (généralement produit par la SOD). Elle est surtout présente au niveau des globules rouges et du foie. (Valko et al. 2006). 2 H2O2 →2 H2O + O2
Elle est formée de quatre chaînes polypeptidiques comportant, chacune, un groupement ferriprotoporphyrine avec un atome de fer à l’état Fe3+. Pour catalyser la réaction, l’atome de fer de l’hème de la catalase réalise une coupure hétérolytique de la liaison O-O du peroxyde d’hydrogène, créant de ce fait une molécule d’eau et un radical porphyrine nommé composé I hautement oxydant ; ce dernier peut ensuite oxyder une autre molécule de peroxyde d’hydrogène pour donner du dioxygène.
Catalase-Fe3+ + H2O2 → Composé I + H2O
Composé I + H2O2 → Catalase-Fe3+ + H2O + O2

La glutathion peroxydase (GPX)

La GPX est formée de quatre sous-unités contenant chacune un atome de sélénium sous forme de sélénocystéine. La glutathion peroxydase est présente dans les liquides extracellulaires et dans les cellules au niveau du cytosol et des mitochondries.
Les GPx sont des enzymes qui jouent le même rôle catalytique que la catalase, à savoir la réduction des hydroperoxydes (H2O2) et des peroxydes lipidiques (ROOH) en utilisant le glutathion réduit (GSH) (Thérond et al. 2005; Brigelius-Flohe et al. 2009).
La régénération du GSH réduit à partir du GSSG se fait par l’action de la GR, une enzyme à flavine qui fonctionne par oxydation du NADPH fourni par la voie des pentoses phosphates (Thérond et al., 2005). GSSG + NADPH, H+→ 2GSH + NADP+

Les systèmes antioxydants non- enzymatiques

Ce groupe d’antioxydants est constitué de plusieurs composés capables de réagir directement ou indirectement avec les ERO ; on distingue des composés endogènes (molécules issues de la biosynthèse) et des composés exogènes, (vitamines C et E, polyphénols…) principalement apportés à l’organisme par l’alimentation (Techer, 2013). Les polyphénols seront détaillés dans le chapitre suivant.

Les antioxydants endogènes

Le Glutathion

Le glutathion (GSH) est un tripeptide (acide glutamique-cystéine-glycine). Le glutathion est le thiol le plus abondant dans les organismes et les systèmes vivants (fig.11). Il est antioxydant par son caractère nucléophile et radicalaire (Baudin et al.,2006).
. GSH + HO• → GS• + H2O
. 2GS• → GSSG
Le GSH joue son rôle d’antioxydant en tant que substrat d’enzymes antioxydantes telles que les glutathion peroxydases (GPx), mais également par ses propriétés intrinsèques. En effet, le glutathion prévient l’oxydation des groupements thiols grâce à son pouvoir réducteur. Il peut également chélater les ions cuivreux Cu+ et limiter ainsi leur participation à la réaction de Fenton. Il est directement impliqué dans la réparation des atteintes oxydatives à l’ADN (Lenoir, 2011).

Table des matières

Introduction
Première partie : Étude bibliographique
Chapitre I : La famille des Palmacées et l’espèce Chamaearops humilis L
1. Présentation de la famille des Palmacées
1.1 Localisation géographique
1.2 Les habitats des palmiers
1.3 Aspect botanique général d’un palmier
1.3.1 Le stipe
1.3.2 Les feuilles
1.3.3 Les inflorescences et les fleurs
1.3.4 Les fruits et les graines
1.4 Utilisation des palmiers
1.5 Classification et relations phylogénétiques
2. L’espèce Chamaerops humilis L
2.1 Description botanique
2.2 Classification
2.3 Rôle écologique
2.4 Exigences écologiques du taxon
2.5 Utilisation du C.humilis
2.5.1 Utilisation artisanale et industrielle
2.5.2 Utilisation médicinale
2.6 Données phytochimiques de la plante
2.7 Données pharmacologiques
1. Les radicaux libres
1.1 Le radical superoxyde, O2•-
1.2 Le peroxyde d’hydrogène, H2O2
1.3 L’acide hypochloreux, HOCl
1.4 Le radical hydroxyle, HO•
2. Le Stress oxydant
2.1 Les cibles des ERO
2.1.1 Oxydation des composés lipidiques
2.1.2 Oxydation des composés protéiques
2.1.3 Oxydation de l’ADN
3. Les antioxydants
3.1 Les systèmes antioxydants enzymatiques
3.1.1 La Superoxyde dismutase (SOD)
3.1.2 La catalase
3.1.3 La glutathion peroxydase (GPX)
3.2 Les systèmes antioxydants non- enzymatiques
3.2.1 Les antioxydants endogènes
3.2.1.1 Le Glutathion
3.2.1.2 L’acide urique
3.2.1.3 Le coenzyme Q
3.2.2 Les antioxydants exogènes
3.2.2.1 La vitamine C (ou acide ascorbique)
3.2.2.2 La vitamine E (ou α-tocophérol)
3.2.2.3 Les antioxydants phénoliques
Chapitre III : Les composés phénoliques
1. Généralités sur les polyphénols
1.1 Les non flavonoïdes
1.1.1 Les acides phénoliques
1.1.2 Les Stilbènes
1.2 Les flavonoïdes
1.2.1 Classification des flavonoïdes
1.2.1.1 Les flavones
1.2.1.3 Les flavanones
1.2.1.4 Les anthocyanes
1.2.1.5 Les Isoflavonoïdes
1.2.1.6 Les tanins condensés
2. Mécanismes antioxydants des systèmes phénoliques
2.1 Transfert d’atome d’hydrogène (HAT, hydrogen atom transfer)
2.2 Transfert mono-électronique d’électron (SET, single electron transfer)
2.3 La chélation des métaux de transition (Transition Metals Chelation,TMC)
3. Effet de la structure des composés phénoliques sur l’action anti radicalaire
4. Propriétés biologiques des polyphénols
4.1 Activité antioxydante
4.2 Activités antibactérienne, antifongique et antivirale
4.3 Activité vasodilatatrice
4.4 Activité anti-inflammatoire
4.5 Activité anticancéreuse
Deuxième partie : Partie expérimentale
Chapitre IV : Matériels et Méthodes
1. Echantillonnage
2. Analyses phytochimiques préliminaires
2.1 Caractérisations des Tanins
2.1.1 Tanins catéchiques
2.1.2 Tanins galliques
2.2 Caractérisations des mucilages
2.3 Caractérisations de substances saponosides
2.4 Caractérisations des alcaloïdes
2.5 Caractérisations des composés réducteurs
2.6 Caractérisations des flavonoïdes
3. Extraction des composés phénoliques
3.1 Préparation des extraits bruts méthanoliques
3.1.1 Étape de dégraissage de la matière végétale
3.1.2 Étape d’extraction des polyphénols
3.2 Fractionnement des extraits bruts par Extraction Liquide-Liquide
4.1 Dosage des polyphénols totaux
4.2 Dosage des flavonoïdes totaux
4.3 Dosage des tanins condensés (proanthocyanidines)
4.4 Dosage des anthocyanes monomères totaux : méthode des pH différentiels
5. Identification des composés phénoliques
6. Evaluation de l’activité antioxydante
6.1 Piégeage du radical libre DPPH
6.2 Test du blanchissement du β-carotène
6.3 Pouvoir réducteur (FRAP, Ferric Reducing Antioxydant Power)
6.4 Test de réduction du radical-cation ABTS•+
7. Evaluation de l’activité antibactérienne
7.1 Technique de diffusion en milieu gélosé
7.2 Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)
Chapitre V : Résultats et discussions
1. Analyses phytochimiques
2. Rendement de l’extraction
3. Dosage des composées phénoliques
3.1 Dosage des polyphénols totaux (PPT)
3.2 Dosage des Flavonoïdes totaux (FVT)
3.3 Dosage des tanins condensés (TC)
3.4 Dosage des anthocyanes monomères totaux(AMT)
4. Identification des composés phénoliques
4.1 Chromatogrammes des étalons
4.2 Analyses des extraits de C.humilis
4.2.1 Analyses des fractions des feuilles
4.2.2 Analyses des fractions des baies
5. Etude des activités anti-oxydantes
5.1 Résultats du test DPPH
5.2 Résultats du test du blanchissement du β-carotène
5.3 Résultats du test FRAP (Ferric Reducing Antioxydant Power)
5.4 Résultats du test ABTS•+
6. Etude des relations entre teneurs en composés phénoliques et activités antioxydantes
7.1 Technique de diffusion en milieu gélosé
7.2 Technique de dilution en milieu liquide (CMI)
Conclusion et perspectives
Références bibliographiques

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