Mécanisme de liaison de l’apo-myoglobine aux membranes 

Les diacylphosphoglycérides

Les diacylphosphoglycérides ou phospholipides résultent de l’estérification en position 1 et 2 du glycérol par 2 chaînes d’acides gras. La position 3 est estérifiée par un acide phosphorique. La nature du substituantfixé sur l’acide phosphorique définit la nature du phospholipide. Les principaux sont représentés dans la figure I.3.
La nature des acides gras est extrêmement variée, environ un millier d’acides gras a été caractérisé. Pour les plus communs, la partie apolaire varie de 12 à 24 atomes de carbones. La chaîne hydrocarbonée sur la position 2 du glycérol contient en général une à six insaturations le plus souvent en configuration cis. Ces dernières ont un effet important sur la fluidité membranaire en ajoutant du désordre dans le cœur hydrophobe. Les acides gras les plus classiques, acide palmitique et acide oléique, sont représentés dans la figure I.3.
Le substituant et le groupe phosphoryle constituent la tête polaire du phospholipide (Fig. I.2). Le pKa du groupement phosphoryle dans un phospholipide est compris entre 1 et 2, et porte une charge négative à pH neutre. La charge globale est alors déterminée par la nature du substituant : les phospholipides seront zwitterioniques ou chargés négativement. Les systèmes lipidiques modèles utilisés dans ce travail sont composés uniquement des phospholipides qui permettent de faire varier la taille et la charge des têtes polaires.

Autres lipides

Bien qu’un nombre limité de phospholipides soit largement majoritaire, beaucoup d’autres lipides sont présents dans les membranes animales. Nous ne ferons que les citer.
Les sphingolipides sont dérivés de la sphingosine qui est un amino-glycol éthylénique. On retrouve dans cette famille des phospholipides comme les céramides ou les sphingomyèlines (Fig. I.4A), éléments essentiels de la conduction du potentiel d’action dans le tissu nerveux.

De la membrane biologique aux systèmes modèles

Les membranes artificielles sont des bicouches lipidiques le plus souvent composées de phospholipides. Elles ont fourni de précieux renseignements sur leurs comportements et leurs caractéristiques physico-chimiques. Elles sont aussi largement utilisées pour étudier les interactions protéine-membrane ou l’activité de transporteurs protéiques. Les deux principaux modèles classiquement utilisés sont les bicouches planes de lipides et les vésicules.
Les bicouches lipidiques planes sur support permettent d’étudier la structure et l’orientation des protéines insérées dans la bicouche. Elles sont utilisées pour des expériences de résonance plasmonique de surface [Alves et al., 2005], de spectroscopie infrarouge par réflexion totale atténuée [Goormaghtigh et al., 1999], de résonance magnétique nucléaire du solide [Watts et al., 2004] ou encore pour les expériences de diffusion de rayons X ou de neutrons[Miller et al., 2005].
Ce chapitre n’est pas un récapitulatif exhaustif des systèmes lipidiques modèles et nous nous attacherons à décrire seulement les vésicules lipidiques, modèle utilisé dans notre étude.

Les vésicules lipidiques

Les vésicules lipidiques sont les modèles de bicouches les plus utilisés pour étudier les interactions protéines-membranes. De nombreuses méthodes biochimiques et spectroscopiques permettent de sonder les mécanismes d’insertion membranaire et la structure des protéines liées auxmembranes. De plus, la synthèse de vésicules est indispensable pour étudier des protéines membranaires isolées et reconstituées dans des protéoliposomes. Cette approche a été appliquée avec succès pour détailler le mécanisme d’action d’enzymes impliquées dans les transferts d’énergie [Rigaud etal., 1995] telles que la bactériorhodopsine, l’ATP synthétase [Richard & Graber, 1992] et la pompe calcium hydrolysant de l’ATP pourtransporter le Ca 2+ [Levy et al., 1992].

Propriétés des membranes biologiques

La composition lipidique des membranes module un grand nombre de leurs constantes physiques :épaisseur, courbure, fluidité, élasticité, pression latérale et de surface, diffusion et polarité. Ces propriétés définissent leurs structures et influencent les interactions avec les protéines.

Polymorphisme lipidique et formes des membranes

Bien que les membranes biologiques soient organisées en bicouche plane, certains de leurs composants lipidiques peuvent former spontanément des assemblages non lamellaires. Ces structures intermédiaires sont observées transitoirement dans la cellule.
Du fait de leur caractère amphiphile, les lipides s’auto-associent de manière à établir le maximum d’interactions hydrophobes. Les structures formées dépendent alors de la teneur en eau (proportion du mélange lipide/eau), de la nature chimiquedes lipides, de la température, de la force ionique, du pH et de la présence de cations divalents.

Phases des lipides dans l’eau

Les travaux de Luzzati et al. ont permis de mettre en évidence les différentesstructures adoptées par les lipides dans l’eau [Luzzati et al, 1968]. On peut distinguer deux types de structures : (i) celles dites de type I ou « directes » (huile dans l’eau) où les agrégats de lipides se trouvent dans un milieu aqueux continu et (ii) celles de type IIou « inverses » (eau dans huile) dans lesquelles lestêtes polaires hydratées sont organisées au sein d’une matrice nonpolaire continue constituée de chaînes aliphatiques.
Nous ne ferons pas de description détaillée des différentes phases adoptées par les lipides dans l’eau qui sont largement exposées dans la littérature [Luzzati et al, 1968 ; Lindblom & Rilfors, 1989]. La figure I.7 présente les différents assemblages possibles pour un tensioactif tel que les lipides. De manière succincte, en présence d’un excès d’eau (structures de type I), une solution monocaténaire de lipide est obtenue. Lorsque la concentration en lipide augmente et passe au dessus de la concentration micellaire critique (cmc), les lipides s’auto-asocient sous formes de micelles sphériques (Fig. I.7a). La valeur de la cmc dépend de la nature chimique de chaque lipide et principalement de la balance hydrophile-liphophile du lipide (de l’ordre de 10 -3-10 -4 M pour la plupart des acides gras biologiques). Dans le cas des lipides monocaténaires, si la concentration augmente encore, les micelles s’allongent pour former une phase hexagonale (appelée H I , Fig. I.7b). Dans cette phase, les lipides sont organisés en cylindre dont la surface est constituée par les têtes polaires, les chaînes aliphatiques se rassemblant au niveau du cœur hydrophobe. Les cylindres sont disposés suivant un réseau hexagonal (Fig. I.7b’).
Enfin, au-delà d’une certaine concentration, les lipides monocaténaires s’organisent en phases lamellaires, c.à.d un empilement de bicouches séparées les unes des autres par le milieu aqueux (Fig. I.7c’).

Propriétés de fluidité et de diffusion dans les membranes

Nous avons souligné que les premières structures par diffraction de rayons X sur des bicouches déshydratées n’étaient pas satisfaisantes car exempt de caractère fluide. La fluidité des membranes est étroitement liée à la composition lipidique, la température et l’humidité du milieu.
La figure I.10 montre le diagramme de phase du système modèle DMPC/H 2O [Janiak et al., 1979]. Trois phases lamellaires sont observables pour ce système : Pβ’, L β’ et L α . Les deux premières, présentes à basse température, correspondent à des phases rigides (appelées phases gel), où les chaînes aliphatiques sont cristallisées dans le plan normal à la membrane. La dernière est une phase fluide appelée liquide-cristalline. Les chaînes des lipides sont désordonnées et les lipides peuvent diffuser latéralement dans le plan. Les bicouches sont alors libres de fluctuer.
La température de fusion (TM = 23°C pour le DMPC) est la température de transition entre une phase gel et la phase L α . Pour des températures supérieures à TM, les chaînes hydrocarbonées « fondent » ; des niveaux plus élevés d’énergie rotationnelle des liaisons C-C sont excités [Petrov & Radoev, 1981]. Dans une bicouche lipidique, les changements de direction des chaînes hydrocarbonées, via les configurations gauches et cis des doubles liaisons, rendent plus difficile le parallélisme des chaînes hydrocarbonées. Par conséquent, l’agencement de ces chaînes dans une phase gel est plus difficile et ledésordre moléculaire augmente.
Les lipides forment alors un liquide bidimensionneloù les chaînes aliphatiques sont dans une conformation désordonnée, mais en moyenne, normales au plan. TM dépend principalement de la longueur des chaînes etdu nombre d’insaturations. A longueur de chaîne hydrocarbonée égale, la fluiditéde la membrane augmente avec le nombre d’insaturations. Au contraire, à nombre d’insaturations égal, la fluidité est inversement proportionnelle à la longueur de lachaîne.

Les protéines extrinsèques

Les protéines périphériques sont localisées sur la surface membranaire. Elles sont associées à la membrane viades liaisons électrostatiques faibles avec les têtes polaires des lipides ou une portion hydrophile d’une chaîne polypeptidique sortant de la bicouche (Fig. I.12 ; g et h).
Les protéines à ancrage sont liées de manière covalente à une molécule de lipide ou un acide gras situé à l’intérieur de la bicouche (Fig. I.12 ; e et f). Les modifications les plus connues sont les myristoylations sur les glycines N-terminales, les palmitoylations et isoprénylations sur les cystéines, et enfin un ancrage par l’intermédiaire d’un lipide modifié, le glycosylphosphatidylinositol (GPI). Une partie des protéines intrinsèques possède aussi un ancrage lipidique sur un domaine cytosolique de manière à stabiliser l’ensemble (Fig. I.12 ; a).
Certaines protéines périphériques et à ancrage peuvent être considérées comme amphitropiques puisqu’un changement de structure et/ou un détachement régulé de la partie hydrophobe permet de solubiliser ces dernières. Ces protéines peuventalors exister sous forme soluble et sous forme membranaire. Nous ne détaillerons pas plus ce type d’association protéines-lipides où les interactions hydrophobes n’interviennent pas.

Les protéines intrinsèques

Les protéines membranaires intrinsèques sont en interaction à la fois avec lecœur hydrophobe et l’interface membranaire. Elles peuvent traverser la membrane de part en part ou y être partiellement insérées. La bicouche lipidique impose des contraintes environnementales et seulement deux motifs structuraux ont été observés : les structures en paquets d’hélices αtransmembranaires (Fig. I.12 ; a, b et d) et les structures en tonneau β(Fig. I.12 ; c).
Les structures en hélices α transmembranaires représentent une large majorité des structures connues. L’analyse des profils d’hydrophobicité de plusieurs séquences génomiques complètes indique que 20 à 30% des cadres ouverts de lecture codent pour ce type de motif [Wallin & von Heijne, 1998]. Toutefois, toutes les hélices liées à la membrane ne sont pas transmembranaires. Une hélice amphiphile, c.à.d possédant clairement une face hydrophobe et une face hydrophile en projection hélicoïdale, peut ancrer une protéine dans le plan de la membrane.
L’hélice établie alors des interactions électrostatiques avec l’interface, et des interactions hydrophobes avec les chaînes acyles (Fig. I.12 ; d).

Influence des têtes polaires

La diversité chimique de l’interface membranaire offre de nombreuses possibilités d’interactions avec les polypeptides. Ces interactions sont dépendantes de la taille et de la charge des groupements chimiques présents.
Les têtes polaires des phospholipides créent un réseau bidimensionnel dense de liaisons hydrogène entre elles et avec des molécules d’eau. Par ailleurs, les membranes biologiques sont en moyenne composées de 10 à 20% de lipides anioniques, ce qui correspond à un potentiel de surface entre -8 et -30 mV [Honig et al., 1986]. Les têtes polaires anioniques établissent alors des interactions électrostatiques avec des partenaires chargés positivement. De plus, la faible constante diélectrique du milieu (ε~ 30) renforce les contacts électrostatiques et les liaisons hydrogène entre les lipides et les protéines. Nous avons déjà relevé l’importance des lipides anioniques pour la liaisonà la membrane de la plupart des protéines amphitropiques.
Le potentiel de membrane créé par les charges négatives conduit à un recrutement de contre-ions positifs, augmentant la force ionique à proximité de la surface. Parmi ces cations, les protons sont recrutés et leur concentration locale augmente. Une baisse de 1 à 2 unités pH [Eisenberg et al., 1979] prend place sur une distance de 5 à 15 Å de la surface [Bychkova et al., 1996 ; Prats et al., 1989].
La stabilité des protéines membranaires est également particulièrement sensible à la charge globale, la force ionique et au pH de l’interface. Par exemple, l’équilibre conformationnel entre les deux intermédiaires majeurs de la photoactivation de la rhodopsine subit une forte influence du pH local [Wang et al., 2002]. Pour certaines protéines amphitropiques comme la toxine diphtérique, l’augmentation de l’acidité favorise la déstabilisation et l’insertion dans la membrane.

Repliement des protéines dans les membranes :aspects énergétiques

Les expériences de partition de peptides et de protéines entre la phase aqueuse et la phase membranaire ont fourni plusieurs modèles décrivant le repliement des protéines membranaires constitutives et transitoires dans les bicouches lipidiques.
Jacobs & White ont proposé un modèle en trois étapes : liaison du polypeptide, repliement à l’interface et insertion dans la bicouche. Parallèlement, Popot & Engelmanproposent le modèle en deux étapes pour l’assemblage de protéines en hélices α. Dans ce modèle, les hélices α transmembranaires sont des unités de repliement autonomes déjà présentes dans la bicouche et les interactions entre les hélices compactent la structure en une protéine fonctionnelle.
Le modèle en quatre étapes proposé par White & Wimleyest une combinaison logique des schémas précédents. Ce modèle est schématisé dans la figure I.18 pour la partition et le repliement d’une protéine en hélice α. C’est un modèle séquentiel où les quatre étapes : partition, repliement, insertion et association, ont lieu dans l’interface (Fig. I.18, interfacial path), l’eau (Fig. I.18, water path) ou une combinaison des deux. Ce modèle est utilisable pour les protéines membranaires constitutives et transitoires.
La figure I.18 met en évidence deux cycles thermodynamiques séquentiels.
Dans un premier temps, la partition du polypeptide dans l’interface membranaire est accompagnée par la formation des structures secondaires. Les différents états : le polypeptide déplié libre, le polypeptide déplié lié à l’interface membranaire, le polypeptide replié libre et le polypeptide replié lié à l’interface sont en équilibre dans un cycle thermodynamique. La partition dans lamembrane est par conséquent couplée au repliement (couplage partition / repliement). Dans une deuxième phase, l’insertion transmembranaire des hélices αdans le cœur hydrophobe de la bicouche est accompagnée de l’association des hélices. L’insertion transmembranaire est donc couplée à la formation de la structure tertiaire. Tous les équilibres possibles sont détaillés dans la figure I.18, cependant, chaque protéine empreinte la voie qui lui est la plus favorable.

Table des matières
Préambule 
Partie I : Introduction Générale 
CHAPITRE 1 : STRUCTURE ET PROPRIETES DES BICOUCHES LIPIDIQUES
1.1 Les lipides membranaires
1.2 Les diacylphosphoglycérides
1.3 Autres lipides
1.4 De la membrane biologique aux systèmes modèles
1.4.1 Les vésicules lipidiques
1.5 Structure de la bicouche lipidique
1.6 Propriétés des membranes biologiques
1.6.1 Polymorphisme lipidique et formes des membranes
1.6.1.1 Phases des lipides dans l’eau
1.6.1.2 Modélisation des assemblages lipidiques : approche géométrique
1.6.2 Propriétés de fluidité et de diffusion dans les membranes
1.6.3 Les membranes biologiques dans le contexte cellulaire
CHAPITRE 2 : LES INTERACTIONS PROTEINES-LIPIDES
2.1 Structure des protéines membranaires
2.1.1 Organisation et topologies
2.1.1.1 Les protéines extrinsèques
2.1.1.2 Les protéines intrinsèques
2.1.2 Structure tridimensionnelle des protéines membranaires
2.2 Protéines membranaires transitoires : amphitropisme
2.2.1 Définition et rôles biologiques
2.2.2 Mécanisme de liaison aux membranes
2.3 Comment les lipides affectent l’activité et la structure des protéines
2.3.1 Influence des têtes polaires
2.3.2 Influence des propriétés physiques des membranes
2.3.2.1 L’épaisseur de la bicouche
2.3.2.2 Effets de la viscosité membranaire
2.3.2.3 Effets de la courbure membranaire
2.4 Description thermodynamique des interactions protéines-lipides
2.4.1 Partition des protéines dans les membranes
2.4.2 Repliement des protéines dans les membranes : aspects énergétiques
2.4.2.1 Le couplage partition / repliement
2.4.2.2 Les interactions hélices-hélices
2.4.3 Partition ou liaison des protéines aux membranes ?
Partie II : Liaison de l’α-lactalbumine aux membranes
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION 
1.1 Fonctions biologiques de l’α-lactalbumine
1.2 Structure de l’ α -lactalbumine
1.3 Repliement de l’ α -lactalbumine
1.3.1 L’état molten globule de l’ α -lactalbumine à pH 2
1.4 Liaison de l’ α -lactalbumine aux membranes
CHAPITRE 2 : BUT DU TRAVAIL
CHAPITRE 3 : RESULTATS
Article 1
Partie III : Liaison de l’apo-myoglobine aux membranes 
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION 
1.1 Fonction physiologique de la myoglobine
1.2 Structure de l’apo-myoglobine
1.3 Le repliement de l’apo-myoglobine
1.4 Interaction des globines avec les membranes
1.4.1 Insertion membranaire des colicines
1.4.2 Cas de la toxine diphtérique
CHAPITRE 2 : BUT DE L’ETUDE
CHAPITRE 3 : RESULTATS : Mécanisme de liaison de l’apo-myoglobine aux membranes 
Article 2
CHAPITRE 4 : STRUCTURE DES ETATS LIES A LA MEMBRANE:
Expériences d’échanges H/D suivies par spectrométrie de masse
4.1 Objectifs
4.2 Matériels et méthodes
4.2.1 Principe général de l’expérience
4.2.2 Deutération de la protéine
4.2.3 Incubation
4.2.4 Cinétique d’échange D/H globale et « quenching »
4.2.5 Analyse par spectrométrie de masse
4.2.5.1 Principe
4.2.5.2 Protocole
4.2.6 Digestion enzymatique et cartographie peptidique
4.2.6.1 Principe
4.2.6.2 Protocole
4.3 Résultats et discussion
4.3.1 Cinétique d’échange D/H global
4.3.2 Digestion enzymatique et cartographie peptidique
Partie IV : Conclusion Générale et Perspectives 
Partie V : Annexes
Les échanges hydrogène/deutérium (H/D)
Préparation des vésicules lipidiques
Partie VI : Références bibliographiques
Remerciements

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