Soutenance mémoire
Homéostasie du fer chez les eucaryotes
Le fer est l’un des éléments les plus utilisés par les organismes vivants. Les deux raisons principales sont que c’est l’un des éléments les plus abondants sur Terre et qu’il présente des propriétés physico-chimiques très variées. Le fer existe sous différents états d’oxydation, les plus stables étant les états ferreux (+II) et ferriques (+III) (à noter que les chiffres romains sont utilisés pour décrire l’état d’oxydation d’un métal lorsque celui-ci est dans un site catalytique d’enzymes et que les chiffres 2+, 3+… sont utilisés pour décrire la charge des ions « libres » en solution). Mais au sein de sites actifs d’enzymes des états +I, +IV et même +V peuvent être obtenus qui sont extrêmement réactifs et permettent de catalyser un plus grand nombre encore de réactions. Grâce à ces différents états redox le potentiel redox du fer s’étend de -300 à + 700 mV, soit la quasi-totalité des potentiels redox accessibles en solution aqueuse qui sont limités par la réduction et l’oxydation de l’eau, soit de -400 à + 800 mV. Cette gamme de potentiels redox accessibles est beaucoup plus large que n’importe quel autre métal. De plus, le fer se présente sous différentes formes au sein des enzymes, soit complexé par une porphyrine (un macrocycle poly-pyrrolique) sous forme d’hème, soit associé à des ions sulfures sous forme de centre fer-soufre, soit directement lié à l’enzyme sous forme dite non-hème, ce qui diversifie d’autant ses possibilités réactionnelles. Le fer s’est vite rendu indispensable pour les organismes vivants notamment dans le transport de l’oxygène, la respiration mitochondriale, la synthèse d’une grande variété de métabolites, la signalisation cellulaire ou encore la synthèse d’ADN et de protéines. Chez les eucaryotes, l’homéostasie du fer est très finement régulée au niveau systémique et cellulaire car un défaut ou un excès de fer peut engendrer de nombreuses pathologies. La carence en fer est l’une des premières causes d’anémie (diminution des globules rouges) et représente un problème de santé mondiale (Camaschella, 2015). À l’inverse, un excès de fer peut se révéler toxique, car la capacité du fer à alterner entre une forme réduite Fe2+ et oxydée Fe3+, permet la formation d’espèces réactives dérivées de l’oxygène (ROS en anglais pour Reactive Oxygen Species) via la réaction de Fenton conduisant à un stress oxydatif par la formation de radicaux hydroxyles pouvant induire des voies de signalisation déterminantes dans la survie et la mort cellulaire (réaction 4) (D’autréaux et Toledano, 2007).
Stockage du fer
Une partie importante du fer est stockée au sein de la ferritine. La ferritine présente une structure sphérique formant une large cavité au centre de la protéine permettant de lier jusqu’à 4500 atomes de fer (Arosio & al, 2009). En stockant le fer en excès, la ferritine prévient la formation de ROS et jouerait donc un rôle d’antioxydant (Epsztejn & al, 1999). Il existe également une ferritine mitochondriale (Ftmt) mais dont l’expression semble restreinte à quelques types de tissus (Santambrogio & al, 2007). La ferritine est un hétérocomplexe de 24 sous-unités constitué d’un ratio variable de deux types de sousunités différentes: une sous-unité dite lourde, nommée FTH1, et une sous-unité dite légère, nommée FTL (Arosio & al, 2009). La sous-unité FTH1 possède une activité ferroxydase permettant l’oxydation du Fe2+ en Fe3+ par l’oxygène qui est une étape obligatoire afin de stocker le fer dans sa cavité (réaction 5). La sous-unité FTL contrôle la nucléation du fer sous forme de centre poly-nucléaire et permet le renouvellement de l’activité ferroxydase de la sous-unité FTH1 (Pantopoulos & al, 2012). Le ratio entre ces deux sous-unités varie selon le tissu où est présente la ferritine. Dans le foie, qui est le principal organe stockant le fer, il y a environ 90 % de sous-unité légère FTL (Hider & Kong, 2013). À l’inverse, dans le cœur, la sous-unité lourde est favorisée afin de limiter la formation de ROS par un excès de Fe2+ (Hider & Kong, 2013).
Acquisition du fer
L’acquisition du fer est un enjeu majeur pour les bactéries car sa disponibilité est totalement dépendante de leur milieu extracellulaire. Dans des milieux extracellulaires riches en oxygène avec un pH compris entre 7,0 et 8,0, le fer ferreux Fe2+ n’est pas stable et s’oxyde en fer ferrique Fe3+ qui est très peu soluble dans ces conditions de pH. Les bactéries ont ainsi mis en place plusieurs stratégies afin d’acquérir du fer : 1) via des chélateurs possédants une très haute affinité pour le fer ferrique libre ou des hèmes libres capables de capter le fer extracellulaire appelé sidérophores ou hémophores en condition aérobie ; (2) via un système d’acquisition de fer ferreux libre en conditions anaérobie ; (3) de même que chez les eucaryotes, les procaryotes possèdent des systèmes très efficaces de stockage du fer permettant de le mobiliser rapidement en condition de carence ; (4) le développement de systèmes de résistance au stress redox ; (5) une régulation des protéines contenant du fer ou impliquées dans l’homéostasie du fer.
Régulation du métabolisme systémique du fer
La régulation de l’homéostasie du fer est un processus central pour la plupart des organismes afin d’une part, de limiter la quantité de fer libre et d’autre part, de pouvoir activer les systèmes d’acquisition lorsque le niveau fer n’est pas suffisant. Dans les organismes pluricellulaires, le premier niveau de régulation est celui du fer systémique. L’acquisition du fer est principalement régulée de manière post-transcriptionnelle par l’hepcidine, une hormone peptidique de 25 acides aminés riche en cystéine qui est sécrétée par le foie (Pigeon & al, 2000). L’hepcidine circulante dans le plasma va se lier au transporteur FPN des entérocytes, macrophages et hépatocytes afin de promouvoir leur phosphorylation, ce qui va induire leur dégradation (Nemeth & al, 2004). Les transporteurs FPN sont les seuls transporteurs caractérisés capables d’exporter le fer. Leur dégradation conduit à une diminution drastique de l’export du fer par les entérocytes, macrophages et hépatocytes vers le plasma. L’hepcidine est régulée transcriptionnellement par différents stimuli tels que la disponibilité du fer, l’inflammation et l’hypoxie (Rishi & al, 2015).
Régulation du fer et des centres Fe-S dans les bactéries
La régulation du fer est effectuée dans les bactéries à Gram-négatif par la protéine Fur (FerricUptake Regulator) qui est un répresseur transcriptionnel (Hantke, 1984 ; Bagg & Neilands, 1987). L’équipe du Dr. Hantke a montré que Fur régulait près de 100 gènes chez E. coli dont 60 % sont impliqués dans l’acquisition du fer (Hantke, 2001). Fur est une protéine homodimérique de 2 x 17 kDa comportant un domaine N-terminal impliqué dans la liaison avec l’ADN et un domaine C-terminal possédant plusieurs sites de fixation pour des métaux (Bradley & al, 2020). Un site très proche du Cterminal permet de lier un atome de zinc qui est essentiel dans la stabilisation du dimère (D’Autréaux & al, 2007). Fur possède un second site, dit site de régulation, permettant la fixation d’un atome de fer lui conférant la propriété de se lier à des domaines spécifiques de l’ADN. En présence de forte concentration en fer dans la bactérie, Fur va lier un atome de fer par monomère (Fe-Fur) ce qui entraine un changement conformationnel augmentant par 1000 fois son affinité de liaison avec l’ADN. Fur se fixe à des séquences spécifiques appelées « Fur-Box » situées au niveau du promoteur des gènes cibles. Cette interaction bloque l’interaction de l’ARN polymérase et ainsi la transcription des gènes cibles (Escolar & al, 1997) (Figure 8a). Fur est aussi capable d’agir comme un régulateur positif en réprimant l’expression d’un petit ARN de 90 paires de bases appelé RyhB qui déstabilise les ARN messagers codant pour les protéines impliquées dans le stockage (ferritine et bactérioferritine) et dans l’utilisation du fer (protéines impliquées dans le cycle de Krebs : l’aconitase AcnA, la fumarase FumA, et les déshydrogénases SdhAB-C-D) ainsi que certaines protéines à fer telles que la superoxyde dismutase b (SodB) (Massé & Gottesman, 2002). RyhB est aussi impliqué dans la régulation de l’expression des machineries ISC et SUF qui réalisent la synthèse des centres Fe-S chez les procaryotes. Chez E. coli la machinerie ISC est exprimée en condition basale et la machinerie SUF en conditions de carence en fer ou lors d’un stress oxydatif (Roche & al, 2013). RyhB induit la dégradation des ARNm des gènes codant pour les protéines de la machinerie ISC, sauf celui de IscR, un régulateur transcriptionnel de la machinerie ISC, qui est stabilisé en présence de RyhB (Desnoyers & al, 2009). IscR fixe un centre [2Fe2S] qui lui procure une activité de répresseur transcriptionnel de l’opéron ISC. Sous forme apo protéine, IscR est un activateur de l’opéron SUF (Mettert & Kiley, 2014). Ainsi en condition de carence en fer, RyhB est exprimé et induit une diminution de la quantité de protéines de la machinerie ISC, sauf IscR. La machinerie ISC produisant aussi moins de centres Fe-S dans ces conditions, apo-IscR s’accumule et vient induire l’expression de l’opéron SUF. Ainsi, en condition de carence en fer, c’est la machinerie SUF qui assure la synthèse des centres Fe-S probablement en raison de sa meilleure capacité à fonctionner dans ces conditions. RyhB n’est pas essentiel à l’activation de la machinerie SUF en carence de fer, mais semble jouer un rôle crucial en accélérant le passage de la machinerie ISC à la machinerie SUF dans ces conditions (Figure 8b).
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Table des matières
PRÉAMBULE
CHAPITRE 1 INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
1. HOMEOSTASIE DU FER
1.1 Homéostasie du fer chez les eucaryotes
1.1.1 Métabolisme systémique du fer
1.1.1.1 Répartition du fer dans le corps
1.1.1.2 Absorption du fer au niveau du duodénum
1.1.1.3 Utilisation du fer
1.1.2 Métabolisme du fer intracellulaire
1.1.2.1 Acquisition du fer cellulaire
1.1.2.2 Distribution du fer cellulaire dans les organelles
1.1.2.3 Stockage du fer
1.1.2.4 Utilisation du fer cellulaire
1.2 Homéostasie du fer chez E. coli
1.2.1 Acquisition du fer
1.2.1.1 Acquisition du fer ferrique par les sidérophores
1.2.1.2 Acquisition du fer ferreux : le système Feo
1.2.2 Stockage du fer
1.3 Régulation du métabolisme du fer
1.3.1 Régulation du métabolisme du fer chez les eucaryotes
1.3.1.1 Régulation du métabolisme systémique du fer
1.3.1.2 La régulation du métabolisme du fer intracellulaire, le rôle clé de la biosynthèse des centres Fe-S chez les eucaryotes
1.3.2 Régulation du fer et des centres Fe-S dans les bactéries
2. LES CENTRES FER-SOUFRE (FE-S)
2.1 La diversité des centres Fe-S
2.2 Le rôle des centres Fe-S
2.2.1 Le transfert d’électron : exemple de la chaine respiratoire mitochondriale
2.2.2 La catalyse redox: exemple des enzymes à radical S-adénosyl méthionine (SAM)
2.2.3 La catalyse non redox: exemple de l’aconitase
2.2.4 L’interaction avec l’ADN : exemple de l’hélicase XPD
3. LA BIOGENESE DES CENTRES FE-S
3.1 Les différentes machineries de biosynthèse des centres Fe-S
3.2 Description de la machinerie ISC
3.2.1 La protéine d’échafaudage IscU/ISCU
3.2.1.1 Phénotypes cellulaires
3.2.1.2 Structure et fonction
3.2.2 Les cystéines désulfurase IscS et NFS1
3.2.2.1 Phénotypes cellulaires
3.2.2.2 Structure et fonction
3.2.3 La ferrédoxine Fdx/FDX2
3.2.3.1 Phénotypes cellulaires
3.2.3.2 Structure et fonction
3.2.4 La frataxine
3.2.4.1 Phénotypes cellulaires
3.2.4.2 L’ataxie de Friedreich
3.2.4.3 Localisation, maturation et structure
3.2.5 Les protéines de transfert
3.2.6 Les protéines relais
3.2.7 Protéines ISCA et protéines intervenant plus tardivement
3.3 Lien entre les machineries mitochondriale ISC et cytosolique CIA
3.4 Mécanisme de biosynthèse par la machinerie ISC
3.4.1 La source de fer
3.4.2 Insertion du soufre
3.4.3 Processus de réduction des persulfures en ions sulfure
3.4.4 Rôle de la frataxine dans la biosynthèse de centres Fe-S
3.4.5 Nature du centre Fe-S formé par ISCU, [2Fe2S] ou [4Fe4S] ?
4. OBJECTIFS DE LA THESE
CHAPITRE 2 MATÉRIELS ET MÉTHODES
1. MATERIELS BIOLOGIQUES
1.1 Plasmides utilisés pour la surexpression des protéines recombinantes
1.2 Souches bactériennes
1.3 Transformation bactérienne
2. PRODUCTION ET PURIFICATION DES PROTEINES RECOMBINANTES
2.1 Production des protéines recombinantes
2.1.1 Milieu de culture
2.1.2 Surexpression des protéines d’intérêts
2.2 Purification des protéines recombinantes
2.2.1 Extraction protéique
2.2.2 Chromatographie d’affinité métallique immobilisé
2.2.3 Clivage de l’étiquette 6xHis
2.2.4 Chromatographie d’exclusion de taille
2.2.5 Préparation des échantillons en conditions anaérobie
2.2.6 Détermination de la concentration des protéines
3. METHODES BIOCHIMIQUES
3.1 Cinétique d’assemblage des centres Fe-S
3.2 Méthode d’alkylation des persulfures
3.3 Quantification du zinc dans ISCU
4. METHODES BIOPHYSIQUES
4.1 Dichroïsme circulaire
4.2 La spectroscopie Mössbauer
4.3 La spectroscopie RMN
4.4 La spectrométrie de masse
4.5 La spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE)
CHAPITRE 3 PRÉPARATION DES PROTÉINES ET DES COMPLEXES
1. PURIFICATION DES PROTEINES
1.1 Purification de la cystéine désulfurase NFS1
1.2 Purification de la protéine échafaudage ISCU
1.3 Purification de la frataxine
1.4 Purification de la ferrédoxine
2. METHODE D’ALKYLATION ARBS
3. ARTICLE#1 : A FAST AND RATIOMETRIC METHOD FOR QUANTIFICATION OF CYSTEINE-BOUND PERSULFIDES BASED ON ALKYLATION AND GEL-SHIFT ASSAYS
CHAPITRE 4 MÉCANISME DE BIOSYNTHÈSE DES CENTRES FE-S PAR LA MACHINERIE ISC EUCARYOTE
1. MECANISME D’ASSEMBLAGE DES CENTRES FE-S PAR LA MACHINERIE ISC DE M. MUSCULUS
1.1 Contexte de l’étude
1.2 ARTICLE#2: Physiologically relevant reconstitution of iron-sulfur cluster biosynthesis uncovers persulfide processing functions of ferredoxin-2 and frataxin
1.3 Résumé de l’article #2
1.3.1 Caractérisation du site de fixation du fer d’ISCU
1.3.2 Activités catalytiques de Fe-ISCU et Zn-ISCU
1.3.3 Mécanisme de formation de centre Fe-S, rôle de FDX2
1.3.4 Mécanisme de stimulation de l’assemblage par FXN
1.3.4.1 Vitesse globale d’assemblage des centres Fe-S
1.3.4.2 Vitesse de transfert
1.3.4.3 Vitesses de réduction
1.3.5 Mécanisme de formation de centres Fe-S par la voie dépendante du DTT
1.3.6 Discussion intermédiaire
1.4 Etude des formes structurée et déstructurée d’ISCU et leur liaison au complexe NIA
1.5 Fixation de la frataxine sur le complexe NFS1-ISD11-ACP-ISCU
1.6 Formation du centre binucléaire [2Fe2S]
1.6.1 Cinétique à temps court pour détecter un dimère transitoire
1.6.2 Rôle d’ISD11-ACP dans la dimérisation potentielle d’ISCU
1.7 Études structurales des complexes NIAU et NIAUF
1.7.1 Cristallisation de Fe-ISCU
1.7.2 Cristallisation des complexes NIAU et NIAUF avec la forme Fe-ISCU
1.7.3 Microscopie électronique du complexe NIAUF
2. CARACTERISATION STRUCTURALE DE FE-ISCU, PRECURSEUR DE L’ASSEMBLAGE DES CENTRES FE-S
2.1 Contexte de l’étude
2.2 ARTICLE#3: Iron insertion in the assembly site of ISCU scaffold proteins is a conserved process for the initiation of Fe-S cluster biosynthesis
2.3 Résumé de l’article #3
2.3.1 Insertion du fer et effet du pH et de la nature du tampon
2.3.2 Localisation du centre métallique d’ISCU
2.3.3 Détermination du site de liaison du fer dans ISCU par spectroscopie XAS
2.3.4 Détermination des ligands du fer dans ISCU
2.4 Effet du GSH et de la L-cystéine sur l’insertion du fer dans ISCU
2.5 Etude de la séquence d’insertion du fer et de formation du complexe NIA
3. DISCUSSION GENERALE
CHAPITRE 5 CARACTÉRISATION DE LA MACHINERIE ISC CHEZ E. COLI
1. CONTEXTE DE L’ETUDE
2. RECONSTITUTION DE LA MACHINERIE ISC D’E. COLI
2.1 Mesure de zinc dans IscU
2.2 Réaction d’assemblage
3. INSERTION ET TITRATION DU FER DANS LA PROTEINE ECHAFAUDAGE ISCU
4. ETUDE DE LA REACTION DE TRANSPERSULFURATION ENTRE ISCS ET ISCU
5. EFFET DE FDX SUR LE PERSULFURE D’ISCU
6. MECANISME DE FORMATION DU CENTRE [2FE2S]
6.1 Recherche d’un intermédiaire [1Fe1S]
6.2 Études par réticulation protéique
6.3 Étude par spectrométrie de masse native
7. DISCUSSION
CHAPITRE 6 DÉPENDANCE EN FRATAXINE DES MACHINERIES ISC
1. ROLE DE LA FRATAXINE BACTERIENNE CYAY DANS LA MACHINERIE D’ASSEMBLAGE ISC
1.1 Contexte de l’étude
1.2 Effet de CyaY sur l’assemblage des centres Fe-S
1.2.1 Effet de CyaY en conditions pauvres en fer
1.2.2 Effet de CyaY sur l’assemblage en conditions riches en fer
1.3 Effet du fer et de CyaY sur la formation du persulfure d’IscS
1.4 Effet du fer et de CyaY sur le transfert de persulfure à IscU
1.4.1 Effet de CyaY sur le transfert de persulfure à IscU en conditions pauvres en fer
1.4.2 Effet de CyaY sur le transfert de persulfure à IscU en conditions riches en fer
1.5 Effet du fer et de CyaY sur la réduction de persulfure par Fdx
1.5.1 Effet de CyaY sur la réduction du persulfure d’IscU en conditions pauvres en fer
1.5.2 Effet du fer sur la réduction du persulfure d’IscU à 1 équivalent de L-cystéine
1.5.3 Effet du fer sur la réduction du persulfure d’IscU à 2 équivalents de L-cystéine
1.6 Effet du fer sur le complexe IscS-IscU
1.7 Assemblage en conditions stœchiométriques en présence d’un excès de fer
1.8 Effet de CyaY sur la distribution du persulfure d’IscS
1.8.1 Effet de TusA
1.8.2 Effet d’IscX
2. UNE COEVOLUTION ENTRE ISCU ET LA FXN A PERMIS DE RENDRE LA MACHINERIE ISC EUCARYOTE DEPENDANTE DE LA FXN
2.1 Contexte de l’étude
2.2 Effet de la mutation d’ISCU M106I sur la machinerie ISC eucaryote
2.3 Effet de la mutation d’IscU I106M sur la machinerie ISC procaryote
2.4 Effet de CyaY sur la machinerie ISC eucaryote
3. DISCUSSION
CHAPITRE 7 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
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