Matériels utilisés pour la production en masse de Metarhizium anisopliae

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Choix et description du site

Trois critères déterminent le choix du site : les onditionsc pédoclimatiques, l’impact local des vers blancs (l’infestation d’ Heteronychus y est importante) et le développement du système de couverture végétale (SCV) dans cetterégion.
Notre étude a été effectuée sur une parcelle expérimentale du CRR du ME, se trouvant à AMBATOFOTSY, commune d’ AMBOHITSILAOZANA, environ à deux kilomètres au Nord-Est du centre. AMBATOFOTSY est situé à 48° 27’ 22,8’’ longitude Est à 17° 41’ 1, 1’’ latitude Sud, et à 795 m d’altitude. C’est un terrain plat de baiboho à sol ferralitique zone

Parcelle expérimentale

La grande parcelle, d’une superficie d’un hectare, a été divisée en quatre blocs, lesquels sont séparés l’un de l’autre par une alléede deux mètres (Fig. 2). Chaque bloc est encore subdivisé en quatre parcelles élémentairesElles. sont séparées les unes des autres par une allée de 2 mètres pour pouvoir limiter le déplacement des insectes. En tout, la parcelle expérimentale est formée de seize parcelles élémentaires d’une dimension de 18m x 26m chacune.

Matériels biologiques

Heteronychus plebejus

Le genre Heteronychus a été décrit pour la première fois par BURMEISTERen 1847. La biogéographie et la description des 6 espèces malgaches (Annexe1) ont été faites par DECHAMBRE (1986). Le Projet « Lutte intégrée sur la riziculture du Lac Alaotra » (PLI) a permis aux chercheurs d’inventorier les espèces ubiquistes des sols de cultures du LAC ALAOTRA (Rapport d’activités PLI, 1990) et d’étudier la bioécologie des Heteronychus sp. (RAJAONARISON, 1993). Ainsi, trois espèces ont alors été déterminées : Heteronychus plebejus KLUG (1833), Heteronychus arator rugifrons ENDROIDI (1974), et Heteronychus bituberculatus KOLBE (1833) (Annexes2-3-4). Notre étude est focalisée surHeteronychus plebejus car c’est l’espèce la plus nuisible à la culture de riz pluvial (PLI, 1990) de la région.
Heteronychus plebejus est un insecte holométabole et univoltin. Ses œufs sont déposés isolément dans le système racinaire chevelu pour lecas du riz. Dans la région du Lac Alaotra, Heteronychus plebejus commence à pondre vers le mois de février. Cette période de ponte dure environ 6 mois (ponte échelonnée). Les larves sont de type vers blancs et caractérisées par un corps cylindrique arqué et charnu. Elles passent par trois stades bien différenciés et mènent une vie endogée en se nourrissant des matières végétales organiques du sol.
Le développement larvaire se passe pendant la saison sèche, il dure environ 155 jours pour les femelles et 159 jours pour les mâles. Après les trois stades larvaires, la nymphose, qui dure environ 19 jours, se déroule dans une logette (Rajaonarison, 1993) Fig.3. Les adultes de couleur brune noirs présentent un abdomen légèrement évasé vers l’arrière (DECHAMBRE 1986). Ils mènent une vie souterraine pendant le jour et volent le soir dès le coucher du soleil. Ce vol est corrélé avec l’arrivée des grosses pluies de la saison chaude (FOFIFA/PLI 1988 et 1990b). Les adultes rongent les collets des jeunes plants, ce dégât apparaît au moment de la levée des plants.

Metarhizium anisopliae

Metarhizium anisopliae est un Hyphomycète appartenant à la classe des Deutéromycètes (responsables de muscardines) ou champignon imparfait, dans l’ordre des Moniliales et de la famille des Moniliaceae d’après AINSWORTH (1993). Il fut décrit par METSCHNITKOFF en 1879 à partir d’un isolement effec tué sur Anisoplia austraiaca. C’est un microorganisme hétérotrophique. Il est constitué d’un appareil végétatif ou mycélium et des spores de forme oblongue de couleur verte (Fig4.), d’où le nom de muscardine verte. La reproduction sexuée est absente. Le cycle de développement(Fig.5) comprend la phase parasitaire et la phase non parasitaire ou saprophytique. La phase parasitaire commence par les processus tégumentaires caractérisés par l’adhérence du conidiospore à l’épicuticule du tégument de l’insecte donnant ensuite des tubes germinatifs très minces ou hyphes. Ces derniers traversent la cuticule ou serpentent à la surface de l’épicuticule formant les appressoriums (organe de fixation). Puis viennent les processus intra-hémocoeliens une fois que les hyphes atteignent la cavité générale. Pour cela les hyphes se développent et forment des blastopores, organites capables d’entraîner la mort de l’insecte.
La phase non parasitaire intervient après la mort de l’insecte. Cette phase s’achève par l’apparition du germe à la surface de l’hôte et par une sporulation intense si les conditions physiques du milieu sont favorables (température de25°C et humidité relative supérieure à 90%).

Matériels de prélèvements

Cylindre (Fig. 6)

C’est un matériel métallique cylindrique de 20cm dediamètre et de 30cm de hauteur avec 2 plans parallèles. L’une des bases comporte un trou permettant de soulever le cylindre lors de l’échantillonnage, tandis que l’autre est ouverte. Le cylindre est utilisé pour prélever des échantillons de terre. Pour le prélèvement, on enfonce le cylindre dans le sol à une profondeur de 10 à 20 cm à l’aide d’un bâ ton puis on le retire pour récupérer l’échantillon de terre.

Matériels de conservation de pathogène fongique utilisé

Pour conserver un pathogène fongique, il faut préparer les matériels suivants :
· Boîtes de Pétri munies de coton humidifié, utilisée comme chambre humide, mais servant également de récipients pour esl cultures de champignons
· Milieu Sabouraud : milieu de culture de champignon entomopathogène (Voir composition et préparation en annexe 5)
· Milieu K.S.A : milieu de culture de champignon entomopathogène (Voir composition et préparation en annexe 6)
· Anse de platine servant de pinceau pour l’ensemencement
· Autoclave de marque LEQUEUX (Fig.9) utilisé pour la stérilisation des matériels (milieux de cultures, des verreries etc.… ).
· Tube à essai pour mettre les milieux des cultures
· Parafilm
· Hotte à flux laminaire CYTAIR 125 (Fig.10) : les manipulations microbiologiques sont effectuées sous hotte afin d’éviter toute contamination.
· Alcool pour stériliser le matériel métallique et slepaillasses avant toutes manipulations microbiologiques
· Tween 80(1/000),qui aide à la dispersion des spores
· des billes de verres nécessaires aussi à la dispersion des spores ou conidies
· Une balance de précision de type Mettler P.E 600 pour peser les ingrédients nécessaires à la préparation des milieux des cultures.
· Réchaud Bunsen, cuisinière ou réchaud à gaz utilisépour la stérilisation de l’anse de platine ou d’autres matériels.
· Verrerie de laboratoire générale(béchers à 500, erlen-meyer, entonnoirs) utilisée pour la préparation des milieux de culture.
· Un microscope optique (de marque Zeiss) pour les observations des spores.
· Matériel pour l’utilisation du microscope(lamelle, cellule hématimétrique (hématimètre) (Fig.11) : avant l’observation au microscope et pour la titration des spores, quelques gouttes de solution des spores préalablement préparées sont déposées sur la cellule hématimétrique puis recouvertes d’une lamelle
· Pipette stérile (pipette Pasteur à embout stérilisé et à usage unique) pour prélever et mesurer la quantité des solutions ou liquides utilisés pendant la manipulation
· Casserole pour préparer les milieux de culture.

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Table des matières

INTRODUCTION
I-MATERIELS ET METHODES
1-1. Matériels
1.1.1 – Zone d’étude
1.1.2 – Parcelle expérimentale
1.1.3 – Matériels biologiques
1.1.4 – Matériels de prélèvements
1.1.5 – Matériels de conservation de pathogène fongique utilisé
1.1.6 – Matériels utilisés pour la production en masse de Metarhizium anisopliae
1.1.7 – Matériels de traitement
1- 2. Méthodes
1.2.1 – Préparation du champignon entomopathogène
1.2.2 – Expérimentations aux champs
1.2.3 – Méthode d’évaluation de l’efficacité biologique de la souche fongique
1.2.4 – Analyse statistique des résultats
II– RESULTATS ET INTERPRETATIONS
2.1- Réactivation de la souche
2.2- Isolement monospore
2.3- Taux de viabilité
2.4- Production de champignon
2.5- Données climatiques durant la campagne 2005- 2006
2.6- Observations aux champs
2.6.1- Estimation de la levée des plants
2.6.2- Evaluation de l’efficacité biologique de la souche utilisée
2.7 – Elevage d’insecte au laboratoire
III- DISCUSSIONS
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
RESUME
ABSTRACT