Matériels, équipements, consommables et réactifs des techniques de PCR 

Définition de la PCR

   La PCR (Polymerase by Chain Reaction) est une technique de biologie moléculaire, d’amplification génique in vitro. Elle permet de copier en grand nombre (avec un facteur de multiplication de l’ordre du milliard), une séquence d’ADN connue, à partir d’une faible quantité (de l’ordre de quelques pictogrammes). En moins de dix ans, cette technique, maintenant capable de faire plus d’un milliard de copie en moins d’une heure, s’est imposée dans les laboratoires. Ainsi elle a révolutionné la biologie moléculaire [12].

L’ADN

  L’acide désoxyribonucléique est une macromolécule contenant l’ensemble de l’information génétique et est ainsi, le support de l’hérédité. Il permet de constituer le génome des êtres vivants et se transmet lors de la reproduction. [12] Il se compose d’un sucre, d’une base azotée et d’un phosphate ; l’ensemble est appelé nucléotide. Le sucre et le phosphate forment le « squelette » de la molécule d’ADN tandis que les bases azotées se succèdent pour former le brin d’ADN. Il existe deux types de bases azotées : les bases pyrimidiques (Cytosine et Thymine) et les bases puriques (Adénine et Guanine). La complémentarité des brins est possible grâce à la liaison entre l’adénine et la thymine (par deux ponts d’hydrogène) et entre la cytosine et la guanine (par 3 ponts d’hydrogène) donnant à l’ADN une structure alors bicaténaire . L’ADN est aussi hélicoïdal. Pour former cette double hélice, deux chaines de nucléotides complémentaires s’enroulent autour du même axe. L’appariement des deux chaines entre elles, se font dans une position antiparallèle, c’est à dire que les 2 chaines ont un sens inverse l’une par rapport à l’autre : Sens 5’3’ et Anti sens 3’ 5’. Les propriétés de synthèse enzymatique et d’initiation in vitro, spécifiques à l’ADN double brin sont assurées par l’ADN polymérase ADN dépendante thermostable. Les propriétés de dénaturation et d’hybridation des brins complémentaires d’ADN sont assurées in vitro grâce à des transitions de température (assurées par un thermocycleur) répétées de manière cyclique lors de l’amplification.

Principe de la PCR  

   Le principe de la PCR repose sur l’extraction de l’acide nucléique, l’amplification de l’acide nucléique extrait et la détection de l’amplicon.
Étapes de réalisation de la PCR  
– Extraction [15]
L’extraction peut être manuelle ou automatisée. Une lyse préalable des cellules est effectuée ; elle est couramment faite par des produits chimiques ou par variation thermique. Les produits les plus fréquemment utilisés en lyse chimique sont : le sulfate de guanidine et le
chloroforme. Le reste du principe d’extraction consiste à capter les acides nucléiques et éliminer les éléments non nécessaires par purification. Les acides nucléiques sont le plus souvent captés par la silice magnétique, le fer et les résines échangeuses d’ions. La lyse thermique, effectuée par choc thermique ou variation thermique consiste à passer brusquement de -20°C à 100°C provoquant aussi une lyse de la paroi bactérienne et la libération de l’ADN.
– Amplification
La PCR est une technique basée sur une répétition de cycles de  transition de température. A l’exception de certaines méthodologies utilisant des sondes d’hydrolyse, chaque cycle contient trois étapes .
o Les Composantes
Matrice : la matrice est constituée de l’ADN obtenu par extraction.
Amorces : Dans la mise au point de la réaction PCR, le choix des amorces est crucial. Elles jouent un rôle en s’hybridant à l’ADN matrice. Elles délimitent également la région de l’ADN à amplifier avec leur extrémité 3’OH libre servant d’amorce pour l’ADN polymérase. Les séquences nucléotidiques des amorces doivent être spécifiques des séquences complémentaires de l’ADN simple-brin auxquelles elles vont s’apparier ; la complémentarité parfaite n’étant par ailleurs pas obligatoire. De plus, la spécificité de la séquence est importante dans le sens où celle-ci ne doit pas pouvoir s’apparier à une autre séquence de l’ADN que l’on ne souhaite pas répliquer. Les séquences des amorces doivent être choisies de sorte à minimiser les possibilités d’appariement entre elles. De même, chaque amorce est choisie pour ne pas pouvoir former une structure secondaire. Le procédé même de la PCR reposant, entre autres, sur des équilibres thermodynamiques, les amorces doivent avoir des températures de fusion le plus proche possible, autrement dit le rapport entre les bases A-T et G-C des deux amorces ne doit pas être trop différent. dNTP (desoxynucleotide triphosphate) : est un mélange de quatre nucléotides triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Il est utilisé au cours d’une PCR comme élément de synthèse des brins d’ADN.
Cofacteur : Le cofacteur est une substance dont la présence est nécessaire en plus d’une enzyme pour qu’une réaction se déroule. Le magnésium (Mg) est le cofacteur le plus couramment utilisé.
Tampon : Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH du milieu réactionnel au niveau optimal pour la Taq polymerase. Il contient souvent des cations bivalents Mg2+ servant de cofacteur.
o Conditions natives (voir étape 0, figure 3)
Cette étape se fait généralement à température ambiante. L’ADN bicaténaire adopte sa conformation en double hélice. Dans cet exemple, nous considérerons qu’il n’y a qu’une molécule initiale d’ADN double brin dans la solution, la zone colorée (rose et orange) correspondant à notre amplicon.
o Dénaturation initiale (voir étape 1’, figure 3)
Avant de commencer les cycles de PCR proprement dit, une étape de chauffage (généralement 10 à 15 minutes à 95 °C) est réalisée. Cette étape permet de dénaturer les ADN double brin, de casser les structures secondaires, d’homogénéiser le milieu réactionnel par agitation thermique, d’activer les polymérases de type « Hot start », de dénaturer d’autres enzymes qui pourraient être dans la solution (Transcriptase Inverse, Uracil-N-Glycosylase).
o Phase de dénaturation (voir étape 1, figure 3)
Cette étape (généralement 0 à 1 minute à 95 °C) permet de dénaturer l’ADN, de « décrocher » les polymérases qui seraient encore liées à une matrice et d’homogénéiser le milieu réactionnel. L’ADN initial adopte une conformation « linéaire » (sans structure secondaire) et simple brin. Les amorces, les dNTPs et les polymérases sont en large excès et répartis de façon homogène dans la solution.
o Phase d’hybridation ou d’appariement des amorces (voir étape 2, figure 3) .Cette étape (généralement 2 à 60 secondes à 56-64 °C) permet aux amorces sens et anti-sens de s’hybrider aux ADN matrice grâce à une température qui leur est thermodynamiquement favorable. Certaines des amorces dites « sens » s’hybrident avec leur séquence complémentaire sur le brin anti-sens (en rose) ; d’autres amorces dites « anti-sens » se lient aux brins sens (en orange). Deux polymérases peuvent alors interagir avec les deux complexes amorces/ADN matrice. Peu de brins d’ADN matrice peuvent s’hybrider avec leur brin complémentaire, ce qui empêcherait la fixation des amorces, car ces dernières sont bien plus courtes et en concentration bien plus importante.
o Phase d’élongation (voir étape 3, figure 3)
Cette étape (généralement 4 à 120 secondes à 72 °C) permet aux polymérases de synthétiser le brin complémentaire de leur ADN matrice à une température qui leur est optimale. Ce brin est fabriqué à partir des dNTPs libres présents dans le milieu réactionnel. La durée de cette étape dépend normalement de la longueur de l’amplicon. Les polymérases parcourent leur brin matrice de son extrémité 3’ vers son extrémité 5’ tout en synthétisant le brin complémentaire. Elles s’arrêteront au bout de leur ADN matrice, décrochées par la phase de dénaturation du cycle suivant. Les ADN néo-synthétisés sont donc précisément définis à leur extrémité 5’ mais pas à leur extrémités 3’ (parties noires). Les ADN sont alors bicaténaires sur une longueur plus ou moins importante ; nous obtenons alors deux brins d’ADN matrice,deux brins (un sens et un anti-sens) d’ADN précisément définis à leur extrémité 5’ uniquement.
– Détection
La détection des produits de PCR varie selon le mode de PCR. Dans la PCR classique, la détection est faite en end-point (à la fin des réactions de PCR) soit en couplant un test ELISA, soit en réalisant une migration électrophorétique sur gel d’agarose. Dans la migration électrophorétique, un agent intercalant comme le bromure d’éthidium (BET) ou le Syber®Green est associé pour la visibilité des bandes. Un marqueur de poids moléculaire (Bande 1, figure 4) est utilisé comme échelle aidant dans l’identification de nos bas d’intérêt. Une bande contrôle de la taille de notre bande d’intérêt doit être utilisée. Dans certains cas, des témoins faibles sont utilisés (Bandes 2 et 3, figure 4). Dans la PCR en temps réel, la détection est faite en même temps que les PCR par utilisation de sondes fluorescentes. Ce sont des oligonucléotides couplés à leurs extrémités à des fluorophores. Les sondes les plus connues sont : les sondes Taqman, les sondes FRET, les sondes scorpions, les balises moléculaires.
Variantes associées à la PCR
PCR multiplex La PCR multiplex (multiplex PCR) est un protocole destiné à amplifier plus d’un amplicon à la fois, par l’utilisation d’au moins trois amorces par réaction de PCR. Les produits de PCR ne seront alors compétitifs que pour la polymérase, les dNTP et, éventuellement, le marqueur d’ADN. Il est également possible d’amplifier différents types d’ADN reconnus par un même couple d’amorces, tels les mimics. La PCR multiplex peut se faire en point final (les produits de PCR étant usuellement différenciés par leur taille ou la présence d’un site de restriction) elle peut aussi se faire en temps réel (chaque produit étant mesuré par une sonde spécifique couplée à un fluorophore dont le spectre d’émission est différent des autres). Ses applications qualitatives sont nombreuses (détection de souche virale, de mutations, etc.).
PCR asymétrique C’est l’amplification par PCR en présence d’une faible quantité d’une des amorces. Elle permet le séquençage direct des fragments amplifiés. Pendant les 20 à 25 premiers cycles, l’ADN double brin est généré, jusqu’à épuisement de l’amorce limitant et de l’ADN simple brin est produit pendant les 5 à 10 derniers cycles. Les rapports d’amorces utilisés sont de 50 pmole/1-5 pmoles/100 µL (1-3 pmoles simple brin après 30 cycles).
PCR en gradient de température Il s’agit d’une technique aidant à la mise au point d’un nouveau protocole de PCR. Elle nécessite des thermocycleurs capables d’assurer des températures différentes, pour une même étape, aux différents échantillons. Elle est surtout utilisé pour optimiser l’étape d’hybridation, notamment en PCR multiplex.
PCR quantitative ou PCR en temps réel La PCR en temps réel (Real-time PCR) est une révolution dans l’utilisation de la PCR. Cette technique consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle (temps réel) grâce à un marqueur fluorescent. Elle permet par son principe de faire des mesures quantitatives (expliquant l’appellation PCR quantitative, qPCR) mais elle nécessite des thermocycleurs particuliers. Il ne faut surtout pas la confondre avec la RT-PCR (Reverse Transcription PCR), on préférera donc les appellations PCR quantitative ou qPCR. Certaines expériences en PCR compétitive ou PCR radioactive permettent l’obtention de mesure quantitative exploitable. RT-PCR en une étape La RT-PCR en une étape (single step RT-PCR). Elle est un protocole mélangeant les réactifs de RT et de PCR afin que les deux étapes puissent se faire sans avoir à ouvrir le tube. Cela permet de réduire le risque de contamination ou d’inversion d’échantillon mais il est plus difficile d’optimiser le milieu réactionnel pour chaque étape. Cela induit en outre un risque de biais pour normaliser l’étape de RT car cela implique d’utiliser la PCR multiplex. RT-PCR quantitative La RT-PCR quantitative (qRT-PCR) est une technique destinée à pouvoir quantifier un type d’ARN initialement présent dans un échantillon. Ce terme désigne l’utilisation de deux techniques successivement, une transcription inverse suivie d’une PCR en temps réel. Elle nécessite l’utilisation de calibrateur externe ou interne (gène de ménage).

Description du service de Bactériologie

   Le service de bactériologie-virologie relève du Département de diagnostic et recherche biomédicale. Il a servi de cadre de travail à notre étude. Il comprend :
– Une section de bactériologie générale où sont réalisées les analyses sur les prélèvements de frottis vaginal, de pus (liquide d’ascite, prélèvement urétral, liquide d’épanchement etc.), d’urines, de sang (hémoculture), de coprocultures et les des prélèvements pathologiques divers ;
– Le laboratoire de référence pour la tuberculose ;
– Une section de stérilisation et de préparation des matériels de travail (milieux de culture, eau distillée, etc.).
– Un laboratoire de référence pour la méningite doté d’équipements permettant l’identification des espèces bactériennes responsables de la méningite ;
– Un Laboratoire de PCR pour la détermination de la charge virale du VIH et le diagnostic précoce du VIH chez le nouveau-né de mère séropositive. Par ailleurs, l’INRSP entretient des relations étroites avec des laboratoires africains et occidentaux. Il reçoit souvent de ces laboratoires, dans le cadre du partenariat, des échantillons pour analyse (étude de confirmation ou d’identification). Il arrive que pour les mêmes raisons, l’INRSP aussi adresse à ces laboratoires des échantillons de produits pathologiques. De même, plusieurs laboratoires de l’INRSP sont inclus dans des réseaux de contrôle de qualité. Les partenaires de l’INRSP dans le cadre de la méningite sont : CQNICD ; Centre de Recherche pluri pathologique de Ouagadougou, CDC Atlanta branche méningite ; le centre collaborateur de l’OMS pour la méningite à Oslo (Norvège) ; Unité Bactériologie l’hôpital Charles de Gaule de Ouagadougou.

Provenance, matériel de transport, et période de prélèvement des LCR

   Les prélèvements de LCR provenaient de toutes les localités du Mali. Sur les 217 LCR recensés, la majorité provenait du district de Bamako soit 60,80%, de Sikasso (17,50%) suivi de la région de Koulikoro (14,30%). Cela peut s’expliquer par le fait que le laboratoire de référence de bactériologie est situé à Bamako ; cette proximité des districts sanitaires de Bamako rend l’accès au LNR plus facile ; et la taille de la population élevée de Bamako avec 1.926.748 habitants en 2012 suivi Sikasso 213977 habitants. D’autres études réalisées au Mali ont montré les mêmes tendances. C’est le cas de celle réalisée par Coulibaly et coll. durant les douze mois de l’année 2012 avec 68% de LCR provenant de Bamako [44]. Guindo en 2012 avaient une provenance des LCR moins élevée que la nôtre à Bamako avec 45%, mais nettement plus élevée à Gao avec 28% [45]. Un faible taux de provenance des échantillons des districts éloignés seraient sans doute dû aux difficultés liés au circuit d’acheminement ; il faut cependant noter que tous les cas notifiés ne sont pas accompagnés de prélèvements de LCR. La proportion des LCR acheminée dans les tubes secs à été supérieure à celle des T-I soit respectivement 77,0% et 23,0%. Vu le pourcentage élevé de cas de Bamako et la possibilité d’acheminer rapidement le LCR sans besoins de T-I, le service reçoit beaucoup de LCR acheminés en tube. Le non disponibilité des T-I dans la plupart des centres périphériques pourrait également être un facteur augmentant la fréquence d’utilisation des tubes secs. Nos résultats sont proches de ceux de Cissouma qui a trouvé que sur 125 échantillons de LCR traités en 2008, 102 (81,6%) ont été acheminés en tube sec et 23 en T-I (18,4%) . Nous avons constaté que les méningites sévissent pendant toute la période de notre étude. Une proportion élevée a été enregistrée pendant quatre mois (Février, Mars, Avril et Mai) avec un pic en Mars soit 34,60% (voir figure 20). Cela peut s’expliquer par le fait que les conditions climatiques pendant ces périodes marquées par la poussière, la chaleur et la sécheresse de l’air, facilitent l’infection par les germes de la méningite bactérienne comme rapporté dans la littérature [7]. C’est le cas de l’étude faite par Seydi et coll. [47] au Sénégal en 2002 qui ont monté que les méningites purulentes sévissent en toute saison mais culminent un pic pendant le mois les plus chaud de l’année

Table des matières

LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
DEDICACES
REMERCIEMENT
HOMMAGES AUX MEMBRES DU JURY
INTRODUCTION
PREMIÈRE PARTIE : GENERALITES 
1. La technique de PCR 
1.1. Définition de la PCR
1.2. L’ADN
1.3. Historique
1.4. Principe de la PCR [15]
1.4.1. Étapes de réalisation de la PCR [16]
1.4.1.1. Variantes associées à la PCR
2. Les méningites bactériennes aigues 
2.1. Agents fréquemment responsables des méningites bactériennes aigues
2.1.1. Neisseria meningitidis : [17,18, 19]
2.1.2. Haemophilus influenzae de type b [18]
2.1.3. Streptococcus pneumoniae [18]
2.2. Formes cliniques : [23, 24, 25,26]
2.2.1. Période de début
2.2.2. Période d’état
2.2.3. Évolution
2.3. Diagnostic biologique
2.3.1. Modalité de recueil du LCR [27]
2.3.2. Moyen de transport du LCR [9, 25]
2.3.3. Techniques de diagnostic
2.3.4. Le traitement [32, 24, 33, 34, 35]
DEUXIÈME PARTIE  
1. JUSTIFICATION 
2. OBJECTIFS 
2.1. Objectif général   NRSP Thèse de pharmacie 2013 Page 7
2.2. Objectifs spécifiques
3. METHODOLOGIE 
3.1. Cadre et Lieu de l’étude
3.2. Type et période de l’étude
3.3. Matériels de l’étude
3.3.1. L’échantillon utilisé
3.3.2. Patients
3.3.2.1. Définition des cas
3.3.2.2. Critères d’inclusion et de non inclusion
3.3.2.3. Échantillonnage
3.3.2.4. Taille de l’échantillon
3.3.3. Matériels de ponction
3.3.4. Matériel de conservation et de transport du PCR
3.3.5. Matériels, réactifs, consommables et milieux de culture de la bactériologie classique
3.3.6. Matériels, équipements, consommables et réactifs des techniques de PCR
3.4. Méthodes de l’étude
3.4.1. Méthode de conservation et de transport du LCR
3.4.2. Méthodes de diagnostic
3.4.2.1. Méthodes de diagnostic de bactériologie classique
3.4.2.2. Les méthodes de diagnostic par la PCR
3.4.2.2.1. Technique de la PCR classique [42]
3.4.2.2.2. Technique de la PCR en temps réel
3.4.3. Phase de collecte des données
3.4.4. Saisie et analyse des données
3.4.5. Considérations éthiques
3.4.6. Chronogramme des activités
4. RESULTATS 
4.1. Description de la population étudiée
4.2. Répartition des LCR analysées à l’INRSP en 2012 par Région et par district sanitaire
4.3. Répartition des LCR selon l’aspect, le conditionnement et la qualité du prélèvement
4.4. Résultat de la bactériologie classique et de la PCR
4.5. Analyse comparée des résultats de la bactériologie classique et des deux PCR
5. COMMENTAIRE ET DISCUSSION 
6. RECOMMANDATIONS
7. CONCLUSION  
8. REFERENCES 
9. ANNEXES

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