Soutenance mémoire
Marqueurs pour la détection de protéines sur gel d’électrophorèse
La « détection » de protéines est nécessaire, et, est un pré-requis aussi bien pour l’obtention de données qualitatives que quantitatives sur un protéome donné. En protéomique sur 2-DE, la « détection » est souvent liée à la fixation, c’est-à-dire à la création d’une liaison réversible ou irréversible entre la protéine et un colorant organique ou inorganique. Ainsi, différentes approches ont été développées et optimisées pour divers types de révélations de protéines ; la détection colorimétrique ou par émission de fluorescence des adduits marqueurs/protéines faisant intervenir des interactions de nature covalente ou non-covalente.
Aux prémices de l’analyse protéiques, les marquages de type covalents ont longtemps été considérés comme meilleurs car induisant une plus grande sensibilité (pas de perte de signal lors des lavages effectué post-migration). Cependant, l’essor de la spectrométrie de masse permettant en routine, de déterminer la nature des protéines séparées sur gel d’électrophorèse, est venu inverser la tendance. La dernière décennie a donc vu l’apparition d’une nouvelle classe de marqueurs de protéines non covalents.
Un compromis entre la sensibilité du signal et la compatibilité avec les nouvelles techniques analytiques représentant un réel défi dans le cadre d’étude bio-analytiques, un bref rappel des méthodes existantes prend à ce stade de l’étude toute son importance.
Par détection colorimétrique
Les Marqueurs covalents
Les protocoles au nitrate d’argent
Le premier marquage au nitrate d’argent remonte au début des années 1980. Cette technique de révélation de protéines est basée sur la saturation des gels en sels d’argent. Une seconde étape consiste au lavage du gel afin de casser les interactions faibles avec les ions métalliques présent dans la matrice. Une dernière étape permet alors de faire apparaitre les bandes par réduction au formaldéhyde des ions argent présentant des affinités avec les protéines.
De nos jours, il existe plus de cent façons de marquer des protéines aux sels d’argent sur gel de polyacrylamide. Cependant, il existe deux grandes catégories de protocoles : en milieu alcalin ou en milieu acide. Les marquages aux sels d’argent sont des procédures multiétapes. Voici les quatre étapes majeures (outre les étapes de lavages) :
1. Fixation, pour insolubiliser les protéines et éliminer les composés interférant dans les gels
2. Sensibilisation, pour améliorer la formation de l’image.
3. L’imprégnation de l’argent, avec du nitrate d’argent ou de l’argent ammoniacal.
4. Développement de l’image, avec du carbonate de sodium (pour les marquages acides) ou avec de l’acide citrique (pour les marquages alcalins) et une faible mais essentielle quantité de formaldéhyde (réducteur des ions argent dans les deux cas).
La sélection se fait alors en fonction de besoins spécifiques. En effet, les marquages en milieu basique sont dits être plus sensibles pour les protéines basiques mais la quantité d’ammoniaque semble être un point crucial dans la reproductibilité. De plus, ce type de procédé n’est pas compatible avec les gels en conditions dénaturantes.
En ce qui concerne les protocoles de marquage en conditions acides, ils sont eux, compatibles avec des gels aussi bien dénaturés que non-dénaturés mais ne montrent pas une grande reproductibilité en fonction des conditions utilisées. De ce fait, malgré une sensibilité pouvant atteindre 100 pg, les problèmes de reproductibilité et la faible gamme de linéarité (10² ) limitent l’utilisation de ce type de marquage pour les analyses quantitatives en 2-DE. Enfin, notons que le marquage aux sels d’argent ne révèle généralement que les protéines sur la surface du gel, rendant possible des analyses ultérieures.
Les protocoles au chlorure de dabsyl 1
En 1983 l’équipe du Pr. Tzeng a mis en évidence l’utilisation de chlorure de dabsyl 1 pour la révélation de protéines sur gel d’électrophorèse de type SDS-PAGE. Dans ce cas, c’est l’utilisation d’une fonction chlorure de sulfonyl qui a permis de rendre ce composé très réactif vis à vis des fonctions amines conduisant à un sulfonamide 2. Cette grande réactivité a alors conduit à un mode opératoire très rapide et d’une bonne sensibilité.
Détection UV des protéines par réaction des unités tryptophane sur des composés trihalogénés
Une nouvelle technique de révelation des protéines par détection UV a récemment été introduite par le Pr. Edwards par utilisation de composés trihalogénés présents sur dans le gel de polyacrylamide. Dans ce cas, le gel est imprégné soit de chloroforme, soit d’acide trichloroacétique (TCA) puis irradié par une lumière polarisée de 300 nm qui permet alors l’obtention de bandes de protéines fluorescentes. Le mécanisme de la réaction induite par photoactivation, a été proposé par ce même groupe et suppose une réaction de formylation radicalaire des indoles présents sur les protéines (unités tryptophanes ). Cette réaction conduit alors à un aldéhyde aromatique fluorescent 3.
Cependant, la visualisation des protéines est très dépendante de la quantité d’unités tryptophane dans les protéines analysées.
Une extension de cette méthode a finalement été décrite en 2004 par ce même groupe en additionnant les composés trihalogénés préalablement à la migration . Ainsi, 20 µg de protéines globulaires typiques peuvent être observées en 5 minutes et jusqu’à 20 ng de protéines riches en tryptophanes telles que les anhydrases carboniques sont détéctées par marquage pré migratoire. Enfin, la volatilité du chloroforme a finalement amener cette équipe à un protocole optimisé et répétable par utilisation de trichloroéthanol.
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Table des matières
1. INTRODUCTION
1.1. Gels d’électrophorèse
1. 1. 1. Gels en conditions natives (non-dénaturantes / 1 dimension)
1. 1. 2. Gels en conditions dénaturantes
1. 1. 3. Gels d’électrophorèse bidimentionnelle
1. 2. Marqueurs pour la détection de protéines sur gel d’électrophorèse
1. 2. 1. Par détection colorométrique
1. 2. 1. 1. Les Marqueurs covalents
1. 2. 1. 1. 1. Les protocoles au nitrate d’argent
1. 2. 1. 1. 2. Les protocoles au chlorure de dabsyl 1
1. 2. 1. 1. 3. Détection UV des protéines par réaction des unités tryptophane sur des composés trihalogénés
1. 2. 1. 2. Les Marquages non-covalents
1. 2. 1. 2. 1. Les protocoles Coomassie Brilliant Blue (CBB) et Fast-green
1. 2. 2. Par détection de fluorescence
1. 2. 2. 1. Fluorescence
1. 2. 2. 2. Les Marquages covalents
1. 2. 2. 2. 1. Les sondes fluorescamines et autres MDPF :Addition d’une amine sur un acétal
1. 2. 2. 2. 2. Les sondes CBQCA : Addition d’une amine sur un aldéhyde
1. 2. 2. 2. 3. Le monobromobimane : Attaque des résidus cystéines sur halogénoalkane
1. 2. 2. 2. 4. Les cyanines Cy3 et Cy5 : Attaque nucléophile sur des esters activés
1. 2. 2. 2. 5. Les marqueurs Py-1, Py-3 et Py-5 : Formation d’ions pyridinium à partir d’ions pyriliums
1. 2. 2. 3. Les Marquages non-covalents
1. 2. 2. 3. 1. Les sondes de comportant une aniline conjuguée : les sondes SYPRO orange, red et tangerine
1. 2. 2. 3. 2. Les sondes SYPRO ruby et rose : les sondes de type sels de terres rares
1. 2. 2. 3. 3. Les sondes de type fluorescéine
1. 2. 2. 3. 4. les DCM : Les sondes de type tetrahydropyranique
1. 2. 2. 3. 5. Les marqueurs Flamingo et Krypton : les sondes hybrides coumarines-cyanines
1. 2. 2. 3. 6. Révélation par lecture de l’absorbance native des protéines
1. 2. 2. 4. Un marqueur de type dihydropyranique : Lavapurple
2. SYNTHESE D’AZAPHILONES – BIBLIOGRAPHIE
2. 1. Synthèse de Whalley
2. 2. Synthèse de Suzuki
2. 3. Synthèse de Porco
2. 4. Synthèse de Yao
2. 5. Synthèse de Pettus
3. VERS LA SYNTHESE D’ANALOGUES DE L’EPICOCCONONE
3. 1. Vers la synthèse de l’alcool 95
3. 1. 1 Obtention du lactol 91
3. 1. 1. 1. Synthèse des amides 84 et 85
3. 1. 1. 2. Alkylation du cycle aromatique par orthométallation
3. 1. 1. 3. Synthèse de la lactone 90
3. 1. 1. 4. Réduction de la lactone 90 en lactol 91
3. 1. 1. 5. Condition de déprotection désaromatisante
3. 1. 1. 5. 1. Alcool primaire protégé par TBDPS
3. 1. 1. 5. 2. Alcool primaire protégé par un pivaloate
3. 2. A partir du lactol modèle en série desoxygéné
3. 2. 1. Obtention du lactol modèle
3. 2. 2. Désaromatisation oxydante
3. 2. 2. 1. Rappels Bibliographiques
3. 2. 2. 1. 1. Désaromatisation de phénols et de naphtols
3. 2. 2. 1. 2. Synthèse d’azaphilones par désaromatisation oxydante de phénols
3. 2. 2. 2. Screening des conditions de désaromatisation oxydante
3. 2. 2. 3. Etude mécanistique par suivi RMN
3. 2. 2. 4. Optimisation du rendement
4. FORMATION D’ACYLFURANONE ET D’ACYLPYRANONE PAR OUVERTURE DE DIOXINONES
4. 1. Etude la réactivité d’acylcétène sur des α-hydroxycétones (formation de cycle à 5 chainons)
4. 1. 1. Rappels Bibliographiques
4. 1. 1. 1. Furanones par utilisation d’acylcétènes ou équivalents synthétiques
4. 1. 1. 2. Utilisation de dioxinones comme précurseurs aux acylcétènes
4. 1. 2. Etude méthodologique
4. 1. 2. 1. Essais préliminaires
4. 1. 2. 2. Influence de la quantité de base nécessaire
4. 1. 2. 3. Influence de la quantité de dioxinone nécessaire
4. 1. 2. 4. Influence de la concentration du milieu réactionnel
4. 1. 2. 5. Influence de la base et du solvant utilisé
4. 1. 2. 6. Influence du substrat de départ
4. 1. 3. Application à la synthèse d’acylfuranones pour l’obtention d’analogues de l’épicocconone
4. 1. 3. 1. Analogues de première génération
4. 1. 3. 2. Analogues de deuxième génération
4. 1. 3. 3. Evaluation des analogues pour la détection de protéines sur gel d’électrophorèse
4. 1. 4. Application à la synthèse de la cadiolide B
4. 1. 4. 1. Rappels Bibliographiques
4. 1. 4. 2. Synthèse proposée basée sur une réaction monotope de cyclisation en acylfuranone – condensation sur un aldehyde
4. 2. Etude la réactivité d’acylcétène sur des β-hydroxycétones (formation de cycle à 6 chainons)
4. 2. 1. Rappels Bibliographiques
4. 2. 2. Etude méthodologique
4. 2. 3. Application à la synthèse de dictyopyrones
4. 2. 3. 1. Rappels Bibliographiques
4. 2. 3. 2. Synthèse proposé de la dictyopyrone C – ouverture d’un époxyde enantiopur
5. CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
6. PARTIE EXPERIMENTALE
6. 1. Généralités
6. 2. Abbréviations des données spectroscopiques
6. 3. Appareillage
6. 4. Mode opératoire et données spectroscopiques
6. 5. Mode opératoire pour la détermination des propriétés physico-chimiques analogues en solution
6. 5. 1. Appareillage
6. 5. 2. Solution mère
6. 5. 3. Absorbance et fluorescence sans butylamine
6. 5. 4. Absorbance et fluorescence avec butylamine
6. 5. Mode opératoire pour l’évaluation des analogues sur gel SDS-PAGE
7. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
8. ANNEXE
