Soutenance mémoire
Epidémiologie et santé publique
S. pneumoniae est une bactérie commensale du nasopharynx chez de nombreux mammifères (van der Linden et al., 2009). Présente de manière asymptomatique au niveau du nasopharynx, elle peut être un pathogène humain sévère l’homme lorsqu’elle envahit des zones normalement stériles.
D’après une estimation de l’organisation mondiale de la santé (OMS), 1.6 million de personnes meurent chaque année dans le monde de maladies liées au pneumocoque. Les populations à risque sont principalement les personnes ayant un système immunitaire faible (enfants de moins de 5 ans, personnes âgées) ou affaiblies par une infection (porteurs du VIH). En effet, l’incidence des infections dues au pneumocoque serait 20 à 40 foisplus élevée chez les adultes immunodéprimés par rapport aux adultes sains (Kyaw et al., 2005). La pneumonie, maladie dont le pneumocoque est l’agent principal (50% des cas), est la première cause de décès des enfants de moins de 5 ans (30% des décès de cette tranche d’âge). En 2006, l’OMS et l’Unicef ont publié conjointement un recueil intitulé« Pneumonia : The forgotten killer of children » pour alerter sur l’incidence et la mortalité de cette infection qui touche principalement les pays en voie de développement d’Afrique subsaharienne et d’Asie (Fig. 2).
Aspects caractéristiques du pneumocoque
Morphologie, croissance et autolyse
S. pneumoniae est une bactérie diplocoque de forme ovoïde, d’une taille comprise entre 1 et 2 µm et qui ne forme pas de spores (Fig.3A). Enlaboratoire, elle se cultive entre 30 et 37°C, préférentiellement en atmosphère anaérobie mais elle tolère toutefois l’oxygène. En milieu liquide (sans agitation) à 37°C, elle possède un temps de génération d’environ 40 minutes. Elle peut également être cultivée sur des géloses de sang, sur lesquelles elle forme des colonies caractérisées par une zone d’hémolyse incomplète (Fig. 3B). Le pneumocoque est en effet une bactérie dite alpha-hémolytique car elle ne dégrade pas totalement l’hémoglobine, contrairement aux bactéries bêtahémolytique qui dégradent les globules rouges grâce à l’enzyme streptolysine O.
Le pneumocoque possède une autre propriété particulière, l’autolyse. En milieu liquide, après une phase de croissance stationnaire courte, les bactéries perdent de leur viabilité (Mellroth et al., 2012), puis la densité optique commence à décroitre. Cette décroissance est due à la lyse de la population cellulaire par une enzyme de dégradation de la paroi, l’autolysine LytA.
LytA est présente dans le cytoplasme de la bactérie en phase de croissance exponentielle, elle est ensuite libérée dans le milieu extérieur lors de la mort de la cellule. Elle se lie sur des structures spécifiques de la paroi cellulaire (la choline portée par les acides téichoïques, voir lesous-paragraphe III.C.ii.1) pour cliver le composant majoritaire de cette dernière, le peptidoglycane, provoquant la lyse de la bactérie.
Le rôle de la protéine LytA est multiple. LytA est d’abord impliquée dans un système d’intégration d’ADN, la compétence. LytA permet au pneumocoque de lyser une partie de sa population (phénomène de fratricide), ce qui libère une grosse quantité d’ADN, potentiellement intégré au génome des bactéries survivantes en phase de compétence (Moscoso et al., 2006). L’intégration de cet ADN exogène confère au pneumocoque une forte capacité d’évolution. Cet avantage sélectif se traduit notamment par l’acquisition de marqueurs de résistance en présence d’antibiotiques. L’ADN libéré dans le milieu extérieur, en plus d’être récupéré par les bactéries compétentes, pourrait également participer à la formation de biofilms bactériens (Domenech et al., 2012). La lyse des bactéries entraine par ailleurs la libération de fragments de peptidoglycane et denombreuses protéines à caractère Figure 3 : A) Image de microscopie en contraste de phase de S. pneumoniae.
Barre d’echelle : 2 µm. B) Photographie d’une boite de pétri contenant des colonies de Streptococcus pneumoniae. La plage de lyse est visible autour de la colonie. immunogène (Royet and Dziarski, 2007). Ces éléments relachés dans le milieu extérieur ont la capacité de lier les molécules du complément et les cytokines, diminuant la disponibilité de ces molécules pour la reconnaissance et la phagocytose des cellules de pneumocoque (Hirst et al., 2008; Martner et al., 2009; Ramos-Sevillano et al., 2015). Par ailleurs, la toxine pneumolysine libérée au cours de la lyse va avoir un rôle important dans la virulence du pneumocoque en formant des pores dans les cellules hôtes.
La capsule
A sa surface, le pneumocoque possède deux structures majeures : la paroi cellulaire et la capsule. La paroi cellulaire sera détaillée ultérieurement dans la section III.C.
La capsule est la couche de l’enveloppe cellulaire la plus externe. Il s’agit d’une structure polysaccharidique, surplombant la paroi cellulaire à laquelle elle est liée de façon covalente (Sørensen et al., 1990). Elle a une épaisseur comprise entre 200 et 400 nm (Skov Sørensen et al., 1988), qui varie selon les souches de pneumocoque. Elle joue un rôle déterminant dans la virulence de la bactérie, notamment en limitant le dépôt de molécules du complément à sa surface, lui permettant d’échapper à la phagocytose (Abeyta et al., 2003; Avery and Dubos, 1931; Hyams et al., 2010). Les variations dans la composition saccharidique de la capsule permettent une classificationdes souches de pneumocoques en 97 sérotypes (pour revue, voir Geno et al., 2015).
Mécanisme d’intégration de l’ADN : la compétence
Une caractéristique particulièrement intéressante du pneumocoque est sa capacité à intégrer, dans son génome, de l’ADN étranger présent dans son environnement. Cette propriété, appelée compétence et conservée dans le genre Streptococcus (Berg et al., 2011), fut décrite en 1928 pour la première fois par Frederick Griffith chez S. pneumoniae (Griffith, 1928).
La compétence est retrouvée chez de nombreuses autres bactéries et a été principalement étudiée chez Bacillus subtilis, Neisseria Gonorrhoeae, Haemophilus influenzae (Solomon and Grossman, 1996) et bien entendu chez S. pneumoniae. Exceptée N.
Gonorrhoeae qui est constitutivement compétente (Jyssum, 1966), les bactéries ne sont transformable que pendant une courte durée (Claverys et al., 2006). La compétence est un phénomène transitoire qui apparait, chez le pneumocoque, en début de phase exponentielle et dure environ 20 minutes. L’entrée en compétence est déclenchée par un peptide de 17 acides aminés nommé Peptide de Stimulation de la Compétence (CSP) (Pakula and Walczak, 1963; Håvarstein et al., 1995). Le CSP se fixe sur le système de transduction de signal à deux composants ComD/ComE, entrainant une cascade transcriptionnelle et la synthèsede protéines impliquées dans le fratricide ainsi que dans l’entrée et la recombinaison d’ADN étranger (Johnsborg and Håvarstein, 2009a; Pestova et al., 1996).
En laboratoire, ce phénomène permet de manipuler facilement le génome du pneumocoque à des fins de recherche. Dans les conditions physiopathologiques, la compétence et la plasticité génétique du pneumocoque lui permettent d’utiliser l’ADN environnant pour s’adapter à son milieu. Ce potentiel d’évolution génétique lui permet par exemple de modifier la composition de sa capsule pour échapper au système immunitaire, ou de modifier la séquence codant pour les protéines cibles des antibiotiques, exprimant ainsi des protéines mutées, d’affinité réduite pour les antibiotiques, pour survivre à la présence d’antibiotiques (Johnston et al., 2014).
FtsZ chez Streptococcus pneumoniae
A la différence de la plupart des bactéries modèles, les gènes de la division chez S. pneumoniae ne sont pas regroupés au sein d’une région unique mais répartis entre trois îlots éloignés sur le chromosome (Massidda et al., 1998). Le gène ftsZ est présent dans l’îlot comprenant également ftsA, ylmE, sepF, ylmG, ylmH et divIVA. La nombre de molécules de FtsZ est estimé à 3000 par cellule (Lara et al., 2004).
MapZ
Le rôle de MapZ dans la localisation de FtsZ a été décrit dans leparagraphe précédent. Cette protéine est retrouvée dans la majorité de l’ordre des Lactobacillales et dans toutes les espèces de la famille des Streptococcaceae. MapZ est une protéine transmembranaire découverte dans le phosphoprotéome de la kinase StkP (Beilharz et al., 2012), se liant à la fois au PG et à FtsZ. A ce jour, le système MapZ représente le seul mécanisme connu de positionnement positif de l’anneau Z chez les bactéries.
FtsA
Le gène ftsA est localisé en amont du gène ftsZ et code pour une protéine hautement conservée de 50 kDa, appartenant à la famille de l’actine et de HSP70 (Bork et al., 1992; Szwedziak et al., 2012). Cette protéine cytoplasmique possède une hélice C-terminale amphipatique lui permettant de se lier à la membrane (Pichoff and Lutkenhaus, 2005). FtsA se lie au domaine C-terminal de FtsZ et ancre ainsi FtsZ à la membrane. Comme l’actine et ses homologues bactériens, elle est capable de former des protofilaments in vitro (Lara et al., 2004; Szwedziak et al., 2012). FtsA se localise au site de division et est présente au nombre de 2200 molécules par cellule chez S. pneumoniae (contre 3000 pour FtsZ) (Lara et al., 2004).
Il a été montré chez E. coli et B. subtilis qu’un ratio d’une molécule de FtsA pour 5 molécules de FtsZ était requis pour effectuer la division cellulaire (Rueda et al., 2003). Chez le pneumocoque, ce ratio est de 1:1.5 (FtsA:FtsZ) (Lara et al., 2004). SepF (ylmF)
Le gène ylmF, codant pour la protéine SepF, est localisé dans l’îlot génomique de division contenant ftsA, ftsZ et divIVA chez le pneumocoque (Fadda et al., 2003). Cette protéine fut découverte chez B. subtilis par deux groupes indépendants et elle est conservée chez les bactéries à Gram positif et les cyanobactéries (Hamoen et al., 2006; Ishikawa et al., 2006). Chez B. subtilis, SepF interagit avec les 16 derniers acides aminés de FtsZ et avec luimême (Singh et al., 2008). Chez B. subtilis, l’absence concomitante de FtsA et de SepF est létale, et la sur-expression de SepF permet de complémenter un mutant de délétion de FtsA.
Par ailleurs, SepF possède une hélice amphiphatique N-terminale. Ces observations suggèrent un rôle redondant de SepF et FtsA pour l’ancrage de FtsZ à la membrane. In vitro, SepF polymérise sous la forme d’une large structure en forme d’anneau. Lorsque les anneaux de SepF sont mis en présence de filaments de FtsZ, ces derniers sont capturés dans les structures formées par SepF (voir p. 30, ;Fig. 7, panneau 3) (Gündoğdu et al., 2011). Un modèle propose que SepF formerait des demi-anneaux au niveau de la zone d’invagination de la membrane, permettant l’ancrage de FtsZ à la membrane et un regroupement de ses filaments pour
stabiliser l’assemblage des machineries de division et de synthèse de la paroi (Duman et al., 2013). Chez le pneumocoque, l’inactivation du gène ylmFprovoque la formation de cellules allongées montrant en de nombreux endroits des septa avortés (Fadda et al., 2003).
EzrA
La protéine EzrA a été découverte comme étant un régulateur négatif de la polymérisation de FtsZ chez B. subtilis. EzrA n’est pas essentielle chez B. subtilis et E. coli mais elle est nécessaire au bon fonctionnement de la division cellulaire. Son absence est caractérisée chez B. subtilis par la formation de multiples anneaux Z localisés au centre et aux pôles de la cellule (Haeusser et al., 2004). EzrA est distribuée le long de la membrane cellulaire durant la croissance avant de se localiser au site de division, potentiellement recrutée par FtsZ (Levin et al., 1999). Elle se lie de façon stœchiométrique à la région Cterminale de FtsZ (Singh et al., 2007) et inhibe la polymérisation de FtsZ en diminuant l’affinité de cette dernière pour le GTP et en accélérant sa vitesse d’hydrolyse du GTP(Chung et al., 2007). EzrA n’est cependant pas capable de dépolymériser des polymères de FtsZ préassemblés in vitro (Haeusser et al., 2004). Cela suggère qu’une fois formés, l’anneau Z pourrait résister à son interaction avec EzrA et que cette dernièrepourrait jouer un rôledans l’organisation des filaments au sein de l’anneau. La résolution de la structure cristallographique de EzrA a par ailleurs montré que la protéine adopte un repliement en forme de demi-cercle, dont le diamètre serait suffisamment large pour accommoder un filament de FtsZ, voire même un filament de FtsZ associé à unfilament de FtsA (Fig. 13) (Cleverley et al., 2014). Dans ce modèle, l’association d’EzrA à FtsZ limiterait les interactions entre les filaments de FtsZ et constituerait un moyen supplémentaire d’ancrer l’anneau Z à la membrane. Il a par ailleurs été montré qu’EzrA connecte l’anneau Z à la machinerie de synthèse de la paroi chez S. aureus, B. subtilis et S. pneumoniae (Claessen et al., 2008; Steele et al., 2011; Fleurie et al., 2014a). Chez ces deux dernières espèces, il semblerait de plus qu’EzrA coordonnerait les phases d’élongation et de septation en connectant FtsZ à DivIVA et GpsB, elles-mêmes en interaction avec les machineries de synthèse de la paroi (Claessen et al., 2008; Fleurie et al., 2014a). Le rôle d’EzrA dans la division serait donc multiple et concernerait la dynamique d’assemblage, l’organisation et la stabilisation de l’anneau Z, ainsi que la connection de ce dernier avec les machineries de synthèse de la paroi.
Les acides téichoïques
Les acides téichoïques (du grec « teichos » signifiant « wall», i.e. la paroi) sont des unités polysaccharidiques présentes dans la paroi cellulaire des bactéries à Gram positif et ont été découverts dans les années 50 (Armstrong et al., 1959). D’après plusieurs études (Ellwood, 1970; Neuhaus and Baddiley, 2003), ils seraient la structure la plus abondante dans la paroi cellulaire, composant plus de 50% de sa masse totale sèche. Certains acides téichoïques s’étendent jusqu’en dehors du PG (Aasjord and Grov, 1980; Matias and Beveridge, 2006, 2007)alors que d’autres seraient présents seulement entre la membrane et la couche de PG (Aasjord and Grov, 1980; Matias and Beveridge, 2008). Ils sont retrouvés sous deux formes : liés de façon covalente à la paroi (Wall teichoic acid, WTA) ou liés via un glycolipide à la membrane lipidique (Lipoteichoic acid, LTA) (Fischer, 1997). Ils sont composés d’une unité de liaison disaccharide [ManNAc(β1→4)GlcNAc] conservée entre les espèces, puis d’unités de répétitions composées de ribitol-phosphate ou de glycérolphosphate. Les unités répétées sont hautement diversifiées entre différentes espèces et au sein
d’une même espèce, suggérant que cette diversité soit non seulement dépendante de l’espèce bactérienne, mais également des conditions de culture (Vinogradov et al., 2006). Malgré leurs ressemblances au niveau desunités répétées chez certains organismes, la voie de biosynthèse des WTA est différente de celle des LTA (Shockman and Slade, 1964), excepté chez S. pneumoniae.
Les acides téichoïques de S. pneumoniae font figure d’exception. Contrairement à la plupart des bactéries, la composition des WTA et des LTA du pneumocoque est identique, ce qui suggère une voie de biosynthèse des précurseurs commune, précédant la différenciation entre WTA et LTA (Denapaite et al., 2012; Seo et al., 2008). Le pneumocoque présente la particularité d’avoir des acides téichoïques décorés de résidus phosphocholines, provenant exclusivement de choline exogène (Fischer, 1997; Tomasz, 1967, 1968), et qui permettent l’ancrage de protéines liant la choline (choline-binding proteins, CBP) à la surface du pneumocoque. Les acides téichoïques jouent un rôle dans des mécanismes cellulaires telsque l’homéostasie en cations (via leurs charges anioniques), les interactions hôte-pathogène et la susceptibilité/résistance aux peptides antimicrobiens, la régulation de l’activité d’enzymes autolytiques telles que LytA ou encore la morphogénèse et la division bactérienne (Brown et al., 2013; Weidenmaier and Peschel, 2008).
Lorsque les bactéries S. aureus (Gründling and Schneewind, 2007)ou B. subtilis (Bhavsar et al., 2001; D’Elia et al., 2006) ne produisent pas d’acides téichoïques, des anomalies morphologiques sont observées, incluant une augmentation de la taille de la cellule et des défauts de positionnement du septum. Ceci démontre que les acides téichoïques ont un rôle dans la synthèse du PG. Chez S. pneumoniae, l’absence de la protéine impliquée dans la synthèse des acides téichoïques, LytR,provoque des aberrations morphologiques liées à un défaut de septation (Johnsborg and Håvarstein, 2009b). Ce phénotype suggère l’existence d’une interaction entre la machineries de synthèse de la paroi et celle des acides téichoïques, hypothèse vérifiée par plusieurs études chez B. subtilis et S. aureus (Atilano et al., 2010; Formstone et al., 2008; Kawai et al., 2011; Reichmann et al., 2014; Schirner et al., 2015).
Synthèse du peptidoglycane chez S. pneumoniae
Synthèse du précurseur et flippases
Le précurseurdu PG est le lipide II, un disaccharide MurNac-GlcNac associé à une chaîne pentapeptidique (L-Ala, D-isoGln, L-Lys, D-Ala, D-Ala) et lié à la membrane par un groupement undécaprényl phosphate. La synthèse du lipide II résulte d’une cascade de réactions catalysées dans le cytoplasme par les enzymes Mur. Chez le pneumocoque, la dernière étape consiste en l’amidation du résidu en 2 ème position de la chaîne peptidique, catalysée par le complexe amido-transferase MurT/GatD qui transforme un acide glutamique (D-Glu) en isoglutamine (D-isoGln) (Münch et al., 2012). La conversion de D-Glu en DisoGln est nécessaire à la reconstitution in vitro de la synthèse du PG par les PBPs de S. pneumoniae (Zapun et al., 2013). In vivo, l’absence d’amidation est à l’origine d’une croissance altérée et d’une augmentation de la résistance aux β-lactames et au lysozyme chez S. aureus(Figueiredo et al., 2012).
Suite à sa synthèse cytoplasmique, le lipide II est transloqué vers l’extérieur de la cellule par les flippasesRodA et FtsW, deux protéines respectivement essentielles à la synthèse de paroi dédiée à l’élongation et à la septation (Gérard et al., 2002; Thibessard et al., 2002; NoirclercSavoye et al., 2003; Land and Winkler, 2011 Noirclerc-Savoye et al., 2013). Dernièrement, un rôle dans l’export du lipide II a été mis en évidence pour une autre famille de flippases incluant la protéineMurJ (Ruiz, 2008; Sham et al., 2014). La séquence codante de MurJ est retrouvée dans le génome du pneumocoque mais aucune étude n’a pour le moment été effectuée pour déterminer son rôle dans cette bactérie(Meeske et al., 2015).
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Table des matières
REMERCIEMENTS
CONTRIBUTION AUX TRAVAUX
ABREVIATIONS
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION
I. INTRODUCTION GENERALE: DECOUVERTE DES BACTERIES ET DU PNEUMOCOQUE
A. Historique
B. Le cas du pneumocoque
II. LE PNEUMOCOQUE
A. Phylogénie et classification
B. Epidémiologie et santé publique
C. Aspects caractéristiques du pneumocoque
i. Morphologie, croissance et autolyse
ii. La capsule
iii. Mécanisme d’intégration de l’ADN : la compétence
III. LA DIVISION BACTERIENNE ET LA FORME DES BACTERIES
A. Généralités sur la division bactérienne
i. Duplication et séparation de l’ADN
ii. Synthèse du peptidoglycane et constriction de la membrane
iii. Fermeture du septum et séparation des cellules filles
B. Le cytosquelette bactérien6
i. Généralités ii. FtsZ
1. Polymérisation de FtsZ in vitro
2. Structure de l’anneau Z in vivo
3. Système de positionnement de l’anneau Z
4. FtsZ chez Streptococcus pneumoniae
a. Localisation et dynamique de l’anneau Z chez le pneumocoque
b. Protéines en interaction directe avec l’anneau Z chez S. pneumoniae
C. La paroi bactérienne
i. Gram positif et Gram négatif
ii. Composition de la paroi du pneumocoque
1. Le peptidoglycane
2. Les acides téichoïques
iii. Synthèse du peptidoglycane chez S. pneumoniae
1. Synthèse du précurseur et flippasses
2. Incorporations des précurseurs à l’ancien peptidoglycane
D. Remodelage et maturation de la paroi
i. Dégradation du peptidoglycane
ii. Les hydrolases de S. pneumoniae
1. Hydrolases impliquées dans l’autolyse et le fratricide
2. Hydrolases impliquées dans la division
3. Hydrolases de fonction inconnue
iii. Modification des chaines glycanes
1. N-déacétylation
2. O-acétylation
3 N-glycolylation
IV. MICROSCOPIE OPTIQUE DE FLUORESCENCE
A. Généralités
i. Historique
ii. Principes fondamentaux et limite de résolution
iii. Fluorescence
B. Nouvelles techniques d’imagerie super-résolue
C. Microscopie PALM/STORM .
i. Principes
ii. Applications chez les bactéries
iii. Artefacts en microscopie à molécules uniques
MATERIELS ET METHODES
Culture de S. pneumoniae et méthodes de fixation
Conditions d’acquisition
Localisation des molécules uniques et reconstruction de l’image PALM
Analyse de la géométrie de l’anneau Z et comptage du nombre de molécules
RESULTATS
PRESENTATION DE LA PUBLICATION N° I
Contexte et objectifs de l’étude
Résultats
Conclusion
Publication n° I
Remodeling of the Z-ring nanostructure during the Streptococcus pneumoniae cell cyle revealed by photoactivaed localization microscopy
PRESENTATION DE LA PUBLICATION N° II
Contexte et objectifs de l’étude
Résultats
Conclusion
Publication n° II
A new connection between cell wall metabolism and cell division in S. pneumoniae
A new connection between cell wall metabolism and cell division in S. pneumoniae
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
ANNEXES
Annexe n°I : Interaction of Penicillin-Binding Protein 2x and Ser/Thr protein kinase StkP, two key
players in Streptococcus pneumoniae R6 morphogenesis.
Annexe n°II : Scripts Matlab : calcul du diamètre de l’anneau Z
Annexe n°III : Scripts Matlab : calcul de la largueur de l’anneau Z
Annexe n°III : Scripts ImageJ : Destacking.txt
RÉFÉRENCES
RESUME / SUMMARY
