LOCALISATION CELLULAIRE DU TYLCV-MLD

Définition et classification des satellites

Le terme « satellite virus » a été utilisé pour la première fois en 1962 par Kassanis pour décrire un petit virus de plante dépendant du tobacco necrosis virus (TNV) pour sa multiplication (Kassanis, 1962). Depuis, le terme «satellite» a été très largement utilisé dans la sphère des virologues. Pour l’International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), les satellites sont des agents qui s’avèrent déficients pour les gènes codants pour des fonctions nécessaires à la réplication ; ils dépendent d’un virus assistant pour leur multiplication (Briddon et al., 2012). On les différencie des génomes défectifs de virus car les séquences nucléotidiques des satellites ne présentent pas ou très peu d’homologie avec celles de leur virus assistant et de leur hôte. L’ICTV distingue 2 classes de satellites. Les « virus-satellites » qui codent pour leur propre protéine de capside et les « acides nucléiques satellites » qui dépendent du virus assistant pour leur encapsidation car ils ne codent pour aucune protéine structurale (Murant and Mayo, 1982 ; Hu et al., 2009). A l’intérieur de chacun de ces groupes, les satellites sont classés sur la base de la nature de leur génome qui peut être de type ARN ou ADN, simple ou double brin (Figure 1). Cette définition restreinte des satellites est souvent élargie à de nombreuses exceptions. En plus des satellites dits « vrai », il existe d’autres agents qui interagissent avec le virus assistant pour des fonctions autres que la réplication. Ainsi, les « acides nucléiques satellite-like » dépendent du virus assistant pour la réplication mais codent pour une fonction nécessaire au virus assistant. C’est par exemple le cas de l’ARN satellite associé au groundnut rosette virus (GRV) qui est indispensable à la transmission par puceron de son virus assistant (Robinson et al., 1999).

De même des satellites de type betasatellites sont indispensables à certains begomovirus pour une infection efficace et symptômatique de l’hôte (Kon et al., 2009; Saunders et al., 2000); Briddon et al., 2001). Il existe aussi des agents qui sont autonomes pour leur réplication mais qui dépendent du virus assistant pour d’autres fonctions. C’est le cas par exemple des alphasatellites associés à certains begomovirus (Briddon et al., 2004) ou de l’ARN satellite du polerovirus beet western yellow virus (BWYV), souche ST9 (Passmore et al., 1993) ; ils dépendent du virus assistant pour leur encapsidation, leur mouvement à courte et longue distance et leur transmission. Les satellites ne forment donc pas un groupe taxonomique homogène. Pour alléger l’écriture du manuscrit, a été considéré comme satellite, tout agent qui dépend d’un virus dit assistant pour l’une au moins de ses fonctions vitales (réplication, encapsidation, transmission vers un nouvel hôte…), et qui partage peu ou pas d’homologie de séquence avec le virus assistant. Les satellites ont été décrits avec des virus de l’ensemble des règnes du vivant, mais la grande majorité des satellites a été décrite avec des virus de plantes. Ce qui est commun à tout satellite et qui le définit, c’est l’assistance indispensable que lui apporte le virus assistant. A l’inverse il serait bien difficile de dire d’une façon générale le bénéfice, si tant est qu’il y en ait, qu’apporte le satellite au virus ; chaque satellite semble être un cas particulier et dans de nombreux cas cette question n’a pas été abordée. C’est pourtant un élément important pour tenter de comprendre comment une association virus-satellite peut se maintenir au cours du temps. C’est la raison pour laquelle je propose d’examiner parmi les associations virus-satellites les plus étudiées, l’effet du satellite sur le virus et si possible de discerner si l’effet est potentiellement positif, neutre ou négatif sur la valeur sélective du virus.

Les ARNs satellite du cucumber mosaic virus (CMV, genre Cucumovirus, famille Bromoviridae)

Les ARNs satellites du CMV ont été les satellites les plus étudiés. Leur première description a été faite à la suite d’un travail d’étiologie sur une épidémie de nécrose de la tomate en Alsace (Marrou et al., 1973). Depuis, plus d’une centaine de satellites ont été décrits en association avec le CMV qui est un des virus les plus répandus au monde. Le CMV infecte plus de 1200 espèces de plantes et est transmis efficacement par plus de 75 espèces de pucerons (Kouadio et al., 2013). Les ARNs satellites des cucumovirus appartiennent à la catégorie des petits ARNs linéaires de plantes, généralement inférieurs à 700nts (Figure 1). Ils ont un génome de 330 à 450 nts portant une coiffe en 5’ mais n’ont pas d’activité messager. Ils présentent une forte structure secondaire avec 50% de nucléotides (nt) appariés et ne présentent pas ou très peu d’homologie avec leur virus assistant.

Il existe 2 variants naturels qui ont des propriétés biologiques bien différenciées selon les symptômes qu’ils provoquent chez la tomate. La plupart des ARNs satellites du CMV sont dits non-nécrogènes car ils atténuent l’expression des symptômes du virus assistant alors que d’autres sont dits nécrogènes en raison des sévères nécroses et chloroses qu’ils induisent chez la tomate (Kaper and Waterworth, 1977). Cet effet des satellites sur la pathogénie de leur virus assistant dépend aussi de l’espèce hôte et de la souche du virus assistant (Collmer and Howell, 1992). Par exemple, il a été montré que le satRNA D qui provoque des symptômes de nécroses sur tomate en présence du CMV, atténue les symptômes du CMV sur tabac (Kouadio et al., 2013). La réplication des ARNsat induit généralement une réduction de l’accumulation des ARNs du CMV (Palukaitis and García-Arenal, 2003). Il a été suggéré que la réduction de l’accumulation du CMV pouvait être à l’origine de l’atténuation des symptômes. Ce n’est cependant pas une règle générale car il a été montré que des ARNs satellites qui induisent des nécroses sur tomate ont également un impact négatif sur l’accumulation du CMV et cet impact peut même être supérieur à celui des satellites non nécrogènes (Escriu et al., 2000a).

Un domaine situé dans la partie 3’ terminale du satellite a été identifié comme un déterminant de la propriété nécrogène du satellite même si d’autres régions, en dehors de ce domaine, influencent l’intensité de la nécrose (Palukaitis and García-Arenal, 2003). L’expression d’un ARN satellite nécrogène dans une tomate transgénique n’induit pas le symptôme de nécrose en l’absence de CMV (McGarvey et al., 1990). Par contre l’expression de l’ARN satellite à partir d’un vecteur viral (potato virus X, PVX) induit les symptômes de nécrose en absence du CMV (Taliansky et al., 1998). Comme le CMV est un virus d’importance économique mondiale, diverses méthodes ont été proposées pour contrôler ce pathogène. Les travaux pionniers de Mireille Jaquemond (INRA, Avignon) ont montré qu’une pré-inoculation de la tomate, par un isolat de CMV et un ARNsat non nécrogène, lui permettait de bénéficier d’un effet protecteur contre les attaques d’une souche sévère de CMV (avec ou sans ARNsat nécrogène) (Jacquemond and Leroux, 1982). Divers essais en serre et au champ ont confirmé le potentiel de la pré-inoculation avec des satellites non-nécrogènes pour atténuer les attaques de CMV. Des résultats concluants ont également été obtenus avec des plants transgéniques exprimant des ARNsat. Jacquemond et al. (1988) ont montré que l’expression monomérique du transgène dans le tabac était suffisante pour assurer une protection et que des plantes présentant différents niveaux d’expression du transgène, exprimaient un niveau de protection comparable (Jacquemond et al., 1988).

Les ARNs satellite du Turnip crinckle virus (genre Carmovirus, famille Tombusviridae)

Des ARNs satellites au sein de la famille Tombusviridae, ne se limitent pas à des virus du genre Tombusvirus car de tels ARNs ont également été identifiés chez au moins un virus du genre Carmovirus, à savoir, le turnip crinckle virus (TCV). Contrairement au CMV dont la distribution est mondiale, le TCV n’a été détecté qu’en Europe. Tout comme les ARNs satellites des autres tombusvirus, les ARNs satellites du TCV appartiennent également à la catégorie des petits ARNs linéaires (Figure 1). Le TCV assiste des satellites tels que l’ARNsat D (230 nts) qui n’a pas d’effet détectable sur la réplication et les symptômes du TCV et des satellites issus de la recombinaison entre l’ARNsat D et le TCV tels que l’ARNsat C (356 nts) qui diminue l’accumulation du virus assistant tout en amplifiant ses symptômes (Simon et al., 2004). Le SatC contient deux régions dérivées du génome du TCV.

La modulation des symptômes dépend de l’hôte (Li and Simon, 1990). Dans les hôtes où l’infection par le TCV n’est pas associée à des symptômes, la présence de l’ARNsat C n’a aucun effet sur la symptomatologie de la plante (Li and Simon, 1990). A l’inverse, chez les plantes qui développent des symptômes en réponse à l’infection du TCV, les symptômes sont renforcées par l’addition du satellite. Contrairement aux ARNsat nécrogènes du CMV qui induisent eux-mêmes les symptômes de nécrose chez la tomate, l’ARNsat C du TCV ne fait qu’amplifier les symptômes de son virus assistant. Le phénomène d’amplification des symptômes serait lié à un effet positif de l’ARNsat C sur le mouvement de cellule à cellule et le mouvement à longue distance du virus qui sera explicité ci-dessous.

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Table des matières

RESUME
ABSTRACT
REMERCIEMENTS
TABLE DES MATIERES
LISTE DES ILLUSTRATIONS
LISTE DES ABREVIATIONS
INTRODUCTION GENERALE
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
1.Définition et classification des satellites
2.Effet du satellite sur le virus assistant
2.1. Effets des satellites sur la pathogénie
2.2. Effets des satellites sur la fitness du virus
3.Facteurs impliqués dans le maintien d’un satellite par un virus
3.1. La réplication du satellite
3.2. La co-infection cellulaire
3.3. Le mouvement de cellule à cellule et à longue distance des satellites
3.4. La transmission
4.Un modèle d’étude original : le TYLCV et les satellites de begomovirus
4.1. Le TYLCV
4.2. Les satellites des begomovirus
5.Objectifs de la thèse
CHAPITRE I : ANALYSE QUALITATIVE ET QUANTITATIVE DES ADN DU TYLCV ET DES SATELLITES MAINTENUS DANS LES PLANTES AU COURS DU TEMPS
Introduction
2.Infectivité des satellites avec le CLCuGV et le TYLCV
2.1. Matériel et méthodes
2.2. Résultats
2.3. Discussion
3.Article 1: Assessing the capacity of Tomato yellow leaf curl virus Mild strain to maintain two alphasatellites and a betasatellite
4.Analyse qualitative des formes d’ADN viral et de satellites accumulées au cours de l’infection
4.1. Matériel et méthode
4.2. Résultats
4.3. Conclusion
Discussion
CHAPITRE II : COMPARAISON DE L’EFFET D’UN BETASATELLITE SUR DEUX SOUCHE DU TYLCV PRESENTES EN MEDITERRANEE (LE TYLCV MLD ET TYLCV-IL)
Contexte et objectif
Article 2 Differential impact of Cotton leaf curl Gezira betasatellite on within-host DNA accumulation of Israel and Mild strains of Tomato yellow leaf curl virus
Comparaison des dynamiques d’accumulation du TYLCV-Mld, du TYLCV-IL et du CLCuGB dans la tomate entre 18 et 150 dpi.
Conclusion
CHAPITRE III: LOCALISATION CELLULAIRE DU TYLCV-MLD, DES SATELLITES BETA ET ALPHA PAR LA METHODE D’HYBRIDATION IN SITU EN FLUORESCENCE (FISH)
Introduction
2.Matériel et méthodes
2.1. Le matériel végétal, et les conditions d’inoculation
2.2. Quantification des ADN du virus et des satellites par qPCR
2.3. Préparation des sondes
2.4. Préparation des tissus
2.5. Détection et visualisation des cibles
2.6. Mise au point des conditions d’acquisition des images
3.Résultats
3.1. La spécificité des sondes
3.2. Identification des tissus infectés par le TYLCV et les satellites
3.3. Mise en évidence des différents profils d’infection au niveau cellulaire
3.4. Test de la corrélation de l’intensité des marquages TYLCV et satellite au niveau cellulaire.
3.5. Fréquence de détection des différents profils d’infection dans les cellules infectées
Discussion
CHAPITRE IV : MISE AU POINT DES OUTILS POUR LE CALCUL DE LA MOI DU TYLCV
Introduction
2.Matériel et méthodes
2.1. Construction des variants de TYLCV
2.2. Infectivité des variants
2.1. Équicompétitivité des variants
2.2. Mise au point des sondes et observation au microscope confocal
3.Résultats
3.1. Mutagénèse des clones TYX
3.2. Spécificité des amorces de détection par qPCR
3.1. Infectivité des variants
3.2. Equicompétitivité des variants
3.3. Mise au point des sondes et observation au microscope confocale
Discussion et perspectives
CHAPITRE V : MISE AU POINT D’AMORCES GENERIQUES POUR LA DETECTION DE BETASATELLITES
1.Introduction
2.Matériel et méthodes : Définition du jeu de séquences de betasatellites
3.Résultats
3.1. Un jeu de séquences comportant beaucoup d’erreurs
3.2. Une grande diversité des effectifs pour chaque espèce
3.3. La capacité de détection des amorces de Briddon.
3.4. Définition de nouvelles amorces universelles pour la détection des betasatellites
3.5. Le design des amorces pour les espèces du « out group »
Discussion et perspectives
DISCUSSION GENERALE
ANNEXE
BIBLIOGRAPHIE