L’interaction eRF3-PABP et son implication dans la régulation de la stabilité des ARNm

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L’élongation

L’élongation correspond à un allongement de la chaîne polypeptidique par ajout d’acides aminés apportés au ribosome en cours de traduction par les aminoacyl-ARNt. Le processus d’élongation se fait de manière cyclique (Kapp and Lorsch, 2004). Au début de chaque cycle, le site A ribosomique est vide, le site P est occupé par l’ARNt chargé de la chaîne polypeptidique en cours de synthèse et le site E par l’ARNt déchargé. Un aminoacyl-ARNt est apporté au site A par le facteur d’élongation eEF1A lié au GTP. Le complexe eEF1A-GTP-aminoacyl-ARNt se place donc au site A. Il se produit un appariement entre le codon placé au site A du ribosome et la boucle anticodon de l’ARNt correspondant. Cette première étape est suivie d’une activation du centre peptidyl-transférase du ribosome. La chaîne polypeptidique portée par l’ARNt au site P est alors transférée sur l’acide aminé porté par l’ARNt au site A grâce à l’établissement d’une liaison peptidique dont la formation est catalysée par l’ARN ribosomique du centre peptidyl-transférase. La translocation de l’ARNt à l’intérieur du ribosome est alors amorcée. Ainsi l’ARNt déchargé de la chaîne peptidique est transféré du site P vers le site E du ribosome et l’ARNt chargé de la chaîne néosynthétisée est transféré du site A vers le site P, laissant libre le site A pour l’arrivée d’un nouvel aminoacyl-ARNt. Un nouveau cycle d’élongation peut ainsi se mettre en place et ce, jusqu’à ce qu’un codon stop soit rencontré.

La terminaison

Mécanisme général

La traduction s’achève lorsqu’un des trois codons stop, UAA, UAG ou UGA, entre au site A du ribosome. Chez les eucaryotes, la terminaison de la traduction est assurée par le facteur eRF1 et son partenaire eRF3. Les deux facteurs, eRF1 et eRF3 s’associent en un complexe qui se fixe au site A du ribosome. Le facteur eRF1 reconnaît les trois codons stop et active le centre peptidyltransférase du ribosome. Celui-ci catalyse l’hydrolyse de la liaison ester entre la chaîne polypeptidique et l’ARNt du peptidyl-ARNt fixé au site P du ribosome, libérant ainsi la chaine polypeptidique néosynthétisée (Frolova et al., 1994). Après cette étape, le ribosome 80S reste fixé à l’ARNm, avec un ARNt dans le site P et le facteur eRF1 dans le site A. Le facteur eRF1 doit alors être relâché du ribosome et le ribosome lui-même doit être dissocié afin de permettre un nouveau cycle de traduction. Un modèle proposé par Pisarev et coll. en 2010 montre que le recyclage du ribosome est médié par le complexe ABCE1 (Pisarev et al., 2010) ; Revue dans (Jackson et al., 2012). Le complexe ABCE1, une ATPase membre de la famille des protéines ‘ATP-binding cassette’ (ABC) vient s’associer au facteur eRF1 pour permettre la dissociation des sous unités ribosomiques (Figure 2).

Le facteur de terminaison de la traduction eRF1

Le facteur eRF1 est responsable de la reconnaissance des codons stop. Sa structure tridimentionnelle montre qu’il mime un ARNt (Figure 3A) et se compose de trois domaines fonctionnels (Song et al., 2000). Le domaine N terminal d’eRF1 (en bleu sur la figure 3A) permet le décodage des différents codons stop. Il est formé d’une pointe qui imite la boucle anticodon de l’ARNt. Cette pointe porte le motif conservé NIKS impliqué dans le contact avec les codons stop. Figure 3 : Le facteur de terminaison de la traduction eRF1. (A) Structure tridimentionnelle d’eRF1, ses différents domaines et leurs relations avec le décodage des codons stop. (B) Terminaison de la traduction par eRF1. Le codon stop est reconnu par eRF1 associé à eRF3. Après hydrolyse du GTP, eRF3 est relâché et remplacé par ABCE1 ce qui induit des changements de la conformation du domaine N-terminal d’eRF1. Ces changements structuraux permettent au codon stop d’interagir avec la poche P1 et le motif GGQ d’eRF1. Ceci place le motif GGQ à proximité de l’extrémité CCA du peptidyl-ARNt au site P du ribosome et permet le déclanchement du relargage du polypeptide puis la dissociation du ribosome (Blanchet et al., 2014).
Il a été montré récemment qu’une cavité proche de ce motif participe à la reconnaissance du codon stop (Wada and Ito, 2014). Selon cette étude, les résidus R65 et K109 de cette cavité sont importants pour le positionnement de l’ARNm dans la cavité et les résidus S33 et S70 sont impliqués dans la reconnaissance du codon stop. Il a été montré par des études de cristallographie des complexes de terminaison eucaryotes que l’interaction d’eRF1 avec eRF3 entraîne un changement conformationnel d’eRF1 (Cheng et al., 2009). Selon le nouveau modèle présenté par Blanchet et coll., la reconnaissance se passerait en 2 étapes (Figure 3B) : d’abord eRF1 interagit avec le codon stop au niveau du motif NIKS puis la libération d’eRF3 induit des changement conformationnels qui permettent l’interaction de la cavité avec le codon stop (Blanchet et al., 2015). A l’extrémité du domaine médian (en vert sur la figure 3A) le motif GGQ très conservé est responsable de l’activation du centre peptidyl transférase du ribosome. Le domaine C-terminal (en rouge, figure 3A) est le domaine d’association à eRF3.

Le facteur de terminaison de la traduction eRF3

Historique de l’identification d’eRF3

Les premières études génétiques sur la terminaison de la traduction ont été réalisées chez Saccharomyces cerevisiae lors de l’étude de mutants capables d’affecter la suppression des mutations non-sens. Parmi les suppresseurs génétiques identifiés, deux mutants ont été isolés : les mutants sup1 ou sup45 et sup2 ou sup35 (Inge-Vechtomov et Andrianova, 1970). Ces mutants ont le même phénotype : suppression des trois codons stop (ils sont dits omnipotents), allosuppression, déficience de la chaîne respiratoire, hypersensibilité aux variations de température, osmosensibilité accrue, hypersensibilité aux antibiotiques aminoglycosides comme la paromomycine affectant la fidélité de la traduction, et le défaut de croissance.
A température non permissive, ces mutations sont létales, conduisant à une inhibition de la synthèse protéique via un blocage des ribosomes sur l’ARNm. Ces phénotypes suggéraient que les protéines Sup45p et Sup35p codées par ces gènes étaient impliquées dans la traduction, et plus particulièrement dans la fidélité du ribosome. En 1988, le groupe d’Inge-Vechtomov clone le gène SUP35 (ou SUP2) à partir de S. cerevisiae. Il montre que les mutations dans le gène SUP35 entrainent une augmentation du niveau d’ambiguïté de la traduction et suggère que la protéine codée par ce gène pouvait être impliquée dans la fidélité de la traduction (Kushnirov et al., 1988). La même année, le groupe de Kikuchi au japon isole un gène qu’ils nomment gst1 pour G to S transition dans une souche mutante thermosensible de S. cerevisiae affectée dans la phase de transition des phases G1 à S du cycle cellulaire. Le produit du gène GST1 est une protéine de 76 kDa qui a une forte homologie avec le facteur d’élongation de la traduction EF1α (renommé eEF1A) et contient une séquence caractéristique des GTPases (Kikuchi et al., 1988).
Une année plus tard, le groupe japonais clone le gène homologue humain de GST1 de la levure à partir d’une banque d’ADNc de cellules humaines et le nome GSPT1. Il montre que ce gène code pour une GTPase et que son expression dépend de la prolifération cellulaire (Hoshino et al., 1989). En 1994, l’équipe de M. Philippe à Rennes identifie le facteur de terminaison de la traduction eucaryote eRF1 (Frolova et al., 1994) et l’année suivante montre que le produit du gène SUP35 s’associe avec eRF1 pour réaliser la terminaison de la traduction chez les eucaryotes, le produit du gène SUP35 (GST1) est alors nommé eRF3 pour son homologie de fonction avec le facteur de terminaison procaryote RF3 (Zhouravleva et al., 1995).

Structure du facteur eRF3

La protéine eRF3 est constituée de trois domaines principaux : le domaine amino-terminal N d’environ 200 résidus, le domaine médian M d’une cinquantaine d’acides aminés et le domaine carboxy-terminal C, constitué de 428 résidus. En 2004, Kong et collaborateurs ont déterminé la structure cristallographique des domaines M et C du facteur eRF3 de Schizosaccharomyces pombe (Figure 4A). Cette structure est fortement similaire à celle des facteurs d’élongation de la traduction EF-Tu bactérien et eEF-1A eucaryote (Figure 4B) même si des changements structuraux localisés entraînent des différences affectant la liaison aux nucléotides et au Mg2+ (Kong et al., 2004). Ainsi, le complexe de terminaison de la traduction eRF3-eRF1 a une structure similaire à celle du complexe eEF1A-ARNt (Figure 4, C et D) et comme lui, il peut se fixer dans le site A du ribosome.

Mécanisme d’action d’eRF3 dans la terminaison de la traduction

L’étude in vitro des interactions du GTP et GDP, avec eRF3 seul ou avec le complexe eRF3-eRF1, montre que le GTP et eRF1 se lient à eRF3 avec une forte coopérativité qui dépend de la présence du Mg2+. Aux concentrations physiologiques en Mg2+, l’affinité du complexe eRF1-eRF3 pour le GTP est un peu plus haute que pour le GDP et la dissociation du GTP du complexe est beaucoup plus lente que celle du GDP. Ainsi, dans les cellules eucaryotes eRF3 est en majorité sous la forme d’un complexe ternaire eRF1-eRF3-GTP à longue durée de vie. Lorsque le facteur eRF3 n’est pas associé à eRF1, il est sous sa forme liée au GDP à courte durée de vie (Hauryliuk et al., 2006; Pisareva et al., 2006). Ainsi, la dissociation rapide du GDP d’eRF3 ne nécessite pas de facteur d’échange GDP/GTP (GEF) contrairement à la plupart des facteurs liant le GTP.
Le facteur eRF3 a une influence sur l’interaction d’eRF1 avec le ribosome. Il joue le rôle d’escorte d’eRF1 jusqu’au ribosome (Eyler et al., 2013) et stimule son activité. Des travaux sur la relation entre l’activité GTPase d’eRF3 et la terminaison ont montré que l’activité GTPase est essentielle pour la terminaison de la traduction. Chez la levure, des mutations dans un des sites GTPase qui réduisent l’hydrolyse du GTP ont montré que l’activité GTPase d’eRF3 est indispensable pour coupler la reconnaissance des codons stop avec le relargage de la chaîne peptidique (Salas-Marco and Bedwell, 2004).
Dans des cellules humaines déplétées en une des isoformes d’eRF3 (eRF3a) responsable de la terminaison de la traduction, il a été montré qu’eRF1 est dégradé lorsqu’il n’est pas associé à eRF3. Ceci explique la forte corrélation entre l’abondance d’eRF1 et celle d’eRF3a, observée dans différentes lignées de cellules humaines (Chauvin et al., 2005). En utilisant des formes d’eRF3a portant des mutations dans le site de liaison à eRF1, il a été montré que le facteur eRF3a était ubiquitinylé et dégradé par le protéasome lorsqu’il n’était pas associé à eRF1 (Chauvin and Jean-Jean, 2008). L’ensemble de ces résultats suggèrent que la formation du complexe de terminaison est contrôlé par des mécanismes de dégradation protéolytique qui permettent d’adapter l’abondance des facteurs de terminaison aux modifications du taux global de synthèse protéique qui surviennent lors du passage des cellules de l’état quiescent à l’état de prolifération et inversement.

Les gènes GSPT1 et GSPT2 humains

En 1998, un gène homologue à GSPT1 est isolé dans des cellules humaines et nommé GSPT2. Le produit de ce gène s’associe à eRF1 (Hoshino et al., 1998) et la protéine codée par ce gène possède une activité de terminaison de la traduction(Jakobsen et al., 2001). La protéine codée par le gène GSPT1 est alors nommé eRF3a et celle codée par GSPT2, eRF3b. Ces deux isoformes d’eRF3 ne sont trouvées que chez les mammifères.
Le gène GSPT1 est localisé sur le chromosome 16 (16p13.1), il possède 15 exons et s’étend sur 47,79 kb alors que GSPT2 est localisé sur le chromosome X (Xp11.21-23), n’a qu’un seul exon de 2,84 kb (génome NCBI37, aout 2010). Il a été supposé que GSPT2 a été généré par retrotransportation de l’ARN messager du gène GSPT1 (Zhouravleva et al., 2006). La différence la plus importante entre les deux gènes GSPT1 et GSPT2 est la présence d’une expansion de triplet GGC dans le premier exon codant du gène GSPT1. Cette expansion est absente dans GSPT2. Pour ce qui concerne les ARNm, GSPT1 et GSPT2 diffèrent par leur distribution tissulaire et par leur expression au cours de la prolifération cellulaire (Hoshino et al., 1989, 1998). En effet, l’ARNm de GSPT1 est abondant dans tous les tissus testés, le coeur, le cerveau, la rate, le poumon, le foie et le rein, alors que l’ARNm d’eRF3b est nettement plus faiblement exprimé dans tous ces tissus, sauf le cerveau. De plus, l’ARNm d’eRF3a est exprimé assez faiblement dans les cellules en quiescence et son niveau augmente après stimulation de l’entrée des cellules en phase G1 du cycle cellulaire. A l’inverse, l’abondance de l’ARNm d’eRF3b est faible et ne varie pas au cours du cycle cellulaire (Hoshino et al., 1998). Au niveau des protéines, eRF3a est abondante dans tous les tissus alors qu’eRF3b est très faiblement exprimée voire absente dans la majorité des cellules humaines (Chauvin et al., 2005). Ainsi, eRF3a a un rôle majeur dans la cellule, non seulement dans la terminaison de la traduction mais dans les autres fonctions qui lui sont attribuées. Même si des expériences de complémentation ont montré qu’eRF3b peut assurer les mêmes fonctions qu’eRF3a (Chauvin et al., 2005, 2007), le rôle d’eRF3b est encore inconnu. Les protéines isoformes eRF3a et eRF3b des mammifères présentent une homologie de séquence de 88%. La grande majorité des différences se situe dans le domaine N (Figure 6).

Les formes alléliques d’eRF3a

L’extrémité du domaine N terminal d’eRF3a comprend une expansion stable de polyglycine qui est codée par une répétition de codons GGC présente dans le premier exon du gène GSPT1 (Figure 6). En 2005, une étude sur le polymorphisme de la répétition des trinucléotides GGC sur une population portugaise a permis de détecter la présence de 5 allèles d’eRF3a; 7-GGC, 9-GGC, 10-GGC, 11-GGC et le 12-GGC (Figure 7). Cette étude a permis de mettre en évidence l’association entre la répétition de trinucléotide polymorphe dans le facteur eRF3a et la susceptibilité au cancer (Brito et al., 2005).

La susceptibilité génétique au cancer

Dans le développement d’un cancer deux ensembles distincts de gènes jouent un rôle essentiel. Ils interviennent directement dans le contrôle de la division des cellules. Les oncogènes stimulent la division cellulaire. Le premier oncogène a été isolé en 1976. En 20 ans, une centaine d’oncogènes ont été isolés et la liste n’est pas close. L’action des oncogènes est dominante, c’est à dire qu’une mutation sur une seule copie du gène suffit à déclencher une division cellulaire anormale. Les gènes suppresseurs de tumeur ou anti-oncogènes ont pour fonction de freiner le déclenchement de la division cellulaire. Contrairement à la situation des oncogènes, ces gènes ont une action dite récessive, c’est à dire que les deux copies du gène doivent être mutées pour qu’il n’y ait plus la fonction de frein à la division cellulaire. On connaît une vingtaine de gènes qui sont des suppresseurs de tumeurs. Le plus connu, le gène p53, est muté dans la moitié des cancers humains.
Durant ces dernières années, un effort important a été entrepris dans l’identification des sources de la susceptibilité génétique du cancer. Dans ce contexte des projets internationaux ont été menés tels que the Human genome Squencing et le projet HapMap. Ces projets ont généré de nombreuses informations sur la localisation, la quantité, le type et la fréquence des variants génétiques dans le génome humain. Un grand nombre d’études sur l’association entre les variants des gènes candidats et le risque de cancer a été réalisé. Compte tenu de leurs abondances et de leurs stabilités, les polymorphismes d’un seul nucléotides ou SNP (single nucleotide polymorphism) sont des marqueurs intéressants pour cartographier les loci de susceptibilité au développement de maladies tels que le cancer. Ainsi, il a pu être montré que certains cancers sont d’origine monogénique comme par exemple le cancer du sein et de l’ovaire provoqués par les variations des gènes BRCA1 et BRCA2 (Narod and Foulkes, 2004), le cancer colorectal héréditaire provoqué par Mlh1 et Mlh2 (Silva et al., 2009).

Le cancer et la machinerie de la traduction

Des progrès remarquables ont été réalisés dans la compréhension du rôle de la traduction de l’ARNm dans le développement du cancer humain. Le contrôle de la traduction est un élément crucial dans le développement et la progression du cancer. Ce contrôle permet d’une part de diriger la synthèse globale des protéines mais aussi la traduction d’ARNm spécifiques qui favorisent la survie des cellules tumorales, l’angiogenèse, l’invasion et le développement des métastases. Le contrôle de la traduction dans le cancer présente de multiples facettes. Il a été montré qu’il implique l’altération des facteurs de la traduction et de leurs activités dans différents stades de la maladie (Silvera et al., 2010).
La synthèse des protéines est un processus cellulaire vital qui régule la croissance et le métabolisme de la cellule. Elle est sous le contrôle de réseaux de signalisation qui répondent à des changements de l’environnement de la cellule. La plupart des cancers sont dus à un dérèglement des voies de signalisation qui contrôlent la croissance et la prolifération des cellules. Ces voies affectent aussi la traduction. Le cancer est associé à des modifications dans les taux des facteurs d’initiation et de régulation de la traduction. Une relation cause-effet a été établie pour le facteur eIF4E dont la surexpression provoque la transformation maligne des cellules humaines en culture (Sonenberg and Hinnebusch, 2009). Sur le plan clinique, la surexpression du facteur de l’initiation de la traduction eIF4E est corrélée avec la progression de certains cancers et avec la résistance à la chimiothérapie. De plus, la phosphorylation d’eIF4E est élevée durant les premiers stades de développement des cancers de sein, de l’estomac et du poumon et diminuée dans les cancer de prostate (Bhat et al., 2015). D’autres facteurs de l’initiation de la traduction sont mutés, ont subi des modifications post-traductionnelles ou sont exprimées différemment et agissent comme des oncogènes dans les cellules cancéreuses. Ces altérations de la traduction font augmenter le taux de la synthèse des protéines et aussi la traduction des ARNm spécifiques codant pour des protéines qui favorisent la progression du cancer (Grzmil and Hemmings, 2012).
Par ailleurs, des études ont mis en évidence une association entre l’expression des facteurs de terminaison de la traduction et le développement du cancer. Il a été montré que l’expression de l’isoforme eRF3b est augmenté dans le cancer du sein (Thakur et al., 2005). De plus, une étude récente a montré qu’eRF3b dont l’expression est différente dans l’hépatite B chronique, le carcinome hépatocellulaire et la cirrhose du foie, serait un marqueur important de l’hépatite B chronique (Li et al., 2014). Il a été montré une augmentation de l’expression de l’ARNm d’eRF3a dans la forme histologique intestinale du cancer gastrique mais pas dans la forme diffuse (Malta-Vacas et al., 2005).

Le facteur eRF3a et le cancer

Les répétitions de GGC dans l’exon 1 du gène GSPT1 peut être considéré comme un microsatellite. Les microsatellites aussi appelés ‘Short Tandem Repeats’ (STR) sont des séquences nucléiques composées d’une répétition de di, tri ou tétranucléotides qui sont très abondants dans certaines régions du génome humain. Des changements dans ces séquences répétitives peuvent engendrer des effets délétères sur l’expression des gènes et leur présence peut induire certaines maladies, comme par exemple les maladies par expansions instables de trinucléotides (maladies à triplets) qui regroupent certaines maladies neurodégénératives dont l’autisme, l’arriération mentales. Une étude a montré la relation entre le polymorphisme de la répétition CAG et GGC au niveau de l’exon 1 du gène du récepteur aux androgènes (RA) et la variation de l’activité transcriptionnelle du gène RA. Le risque de cancer de la prostate est considérablement augmenté lorsque la longueur des répétitions CAG et GGC augmente (Silva Neto et al., 2008). Afin de discerner les effets des variants du gène Reelin (RELN) sur les troubles du spectre de l’autisme (TSA), une étude récente sur la relation entre les variants du RELN dans la répétition GGC et la TSA a montré qu’un seul des variants étudiés pouvait significativement contribuer à la TSA (Wang et al., 2014).
En ce qui concerne le facteur eRF3a, l’étude menée sur des patient présentant un cancer de l’estomac par Brito et coll. en 2005 a permis de mettre en évidence l’association entre la répétition stable du trinucléotide GGC et la susceptibilité au cancer. Cette étude montre d’une part que l’allèle 10-GGC est le plus fréquent dans la population portugaise étudiée et d’autre part que l’allèle 12-GGC est présent seulement dans la population malade avec une fréquence de 5 % (Figure 8). Ce résultat révèle une corrélation entre l’allèle 12-GGC et le cancer de l’estomac : les personnes porteuses de l’allèle 12-GGC ont un risque de cancer gastrique 20 fois plus élevé (Malta-Vacas et al., 2005). Les auteurs suggèrent qu’une altération de la conformation d’eRF3a due à la présence des 12 répétitions du triplet GGC pourrait avoir un effet sur la fonction de la protéine et son rôle dans l’efficacité de la traduction.

La région « linker » de PABP

La région « linker » fait partie du domaine C-terminal de PABP, elle riche en acide aminées proline et méthionine et permet à PABP de se multimériser. Cependant le mécanisme moléculaire mis en place lors de la multimérisation n’est pas encore connu (Simón and Séraphin, 2007). Des expériences de spectroscopie de force par nanopore et de retard sur gel ont montré récemment que l’interaction entre les domaines C-terminaux de deux PABP voisines augmente la coopérativité de l’interaction à la queue Poly(A) (Lin et al., 2012). Selon leur positionnement, les protéines PABP auraient deux façon de se fixer sur la queue Poly(A) : soit avec un mode non coopératif qui correspond à un détachement progressif des PABP de la queue Poly(A), soit sur un mode coopératif qui correspond à un détachement simultané des molécules PABP et à un temps de dissociation plus long. Ces expériences ont aussi montré que ces domaines C-terminaux consécutifs de PABP sont responsables de cette interaction coopérative entre les PABP et la queue Poly(A) (Figure 13). De plus, les auteurs proposent qu’environ 50% des complexes Poly(A)-PABP présentent une conformation de liaison non coopérative ce qui serait concordant avec le fait que leurs domaines C-terminaux puissent être engagés dans d’autres liaisons (Lin et al., 2012). Cependant, ces expériences ont été réalisées avec une queue Poly(A) d’une longueur de 50 A qui ne portait qu’une ou deux PABP au maximum.

Rôle dans la polyadénylation de l’ARNm

La queue Poly(A) se trouve dans l’extrémité 3’ de l’ARNm de tous les eucaryotes. Elle est contrôlée par deux PABP, PABPN1 dans le noyau et PABPC1 dans le cytoplasme. PABPN1 est impliqué dans la synthèse des queue Poly(A) en augmentant l’activité de la Poly(A) polymérase nucléaire (PAP) par stimulation de sa synthèse et elle contribue ainsi à la définition de la longueur des queues Poly(A) fraichement synthétisés (Kühn and Wahle, 2004). PABPN1 protège aussi la queue poly(A) naissante contre la dégradation. Les interactions consécutives de PABPN1 induit la formation d’une sphère signifiant que la taille requise de la poly(A) est atteinte. Par ailleurs, PABPC1 a été détectée dans le noyau en complexe avec PAP et l’ARN non épissé (Hosoda et al., 2006). Il a été considéré que la substitution de PABPN1 par PABC1 provoque la terminaison de la polyadénylation et ainsi l’exportation de l’ARNm du noyau vers le cytoplasme. Récemment, il a été montré que des cellules déplétées en PABPN1 ne montrent pas de perturbation dans la transcription ni dans la polyadénylation. Ce qui signifie que sa fonction est assurée par ses homologues cytoplasmiques. La déplétion de PABPN1 entraine une translocation nucléaire de PABPC4 qui joue le rôle de PABPN1 et le taux de PABPC5 augmente dans le cytoplasme afin de compenser le rôle de PABPC4. Ce qui suggère que les PABP cytoplasmiques sont transférés au noyau pour participer à la maturation de l’ARNm. De plus, la déplétion de PABPN1 provoque une augmentation des cellules apoptotiques ce qui prouve son rôle anti-apoptotique (Bhattacharjee and Bag, 2012).
PABP utilise les domaines RRMs pour son interaction avec la queue Poly(A). La taille minimale pour qu’un Oligo(A) porte une molécule de PABP est de 12 nucléotides mais la mesure de la densité de PABP sur du poly(A) a montré que PABP occupait environ 25 nucléotides (Sachs et al., 1987).

Rôle dans la traduction

Il a été supposé que la PABP cytoplasmique s’associe avec la queue Poly(A) et stimule l’initiation de la traduction. Dans le cytoplasme, PABPC1 interagit avec la coiffe m7GppG et l’extrémité 5’ de l’ARNm. PABP interagit avec le facteur d’initiation de la traduction eIF4G à travers les domaines de reconnaissance RMM1-2 (Gray et al., 2000). La protéine eIF4G est membre du complexe eIF4F (coiffe, eIF4E et l’ARN hélicase eIF4A), agit comme un lien pour permettre l’association d’autres membres à ce complexe. Le facteur eIF4G interagit aussi avec eIF3 qui lui-même recrute la sous unité ribosomique 40S. L’interaction de PABP avec eIF4E par l’intermédiaire eIF4G augmente ainsi son affinité pour la coiffe d’environ un ordre de grandeur (von Der Haar et al., 2000) et contribue à la formation d’une structure circulaire de l’ARNm (Figure 14).

L’étape limitante de la dégradation : la désadénylation

La queue Poly(A) des ARNm joue un rôle important dans la stabilité de l’ARNm et dans l’efficacité de la traduction. Après sa synthèse et son export dans le noyau, l’ARNm porte une queue Poly(A) d’une taille de 200 à 250 nucléotides (nt). L’élimination cytoplasmique de la queue Poly(A) des ARNm se fait sous l’action d’exonucléase 3’5’, cette désadénylation est l’étape limitante du processus de dégradation des ARNm normaux. Deux complexes exonucléases contribuent majoritairement à l’activité de désadénylation chez les eucaryotes : les complexes PAN2-PAN3 et CCR4-Caf1-NOT (plus couramment nommé CCR4-NOT). Ces complexes sont très conservés des levures aux mammifères. Le processus de désadénylation est réversible et serait un point de contrôle permettant de réguler l’expression de certains ARNm intervenant dans la croissance cellulaire et la différenciation au moment de l’embryogenèse (Standart and Minshall, 2008).

Les complexes de désadénylation PAN2-PAN3 et CCR4- NOT

Les complexes PAN2-PAN3 et CCR4-NOT sont des complexes exclusivement cytoplasmiques. La nucléase Poly(A) (PAN) est la première enzyme de désadénylation qui a été découverte (Sachs and Deardorff, 1992). Chez les mammifères comme chez la levure, PAN est constituée de deux sous unités PAN2 et PAN3 où PAN2 porte l’activité enzymatique de désadénylation. La désadénylase PAN2 contient un domaine nucléase de DEDD/RNaseD de la famille des exonucléases 3’5’. PAN3 est une sous-unité régulatrice qui interagit à la fois avec PAN2 et avec PABP. La sous-unité PAN3 contient un motif nommé ‘PAM2’ affin pour le domaine C-terminal de PABP (Siddiqui et al., 2007). L’activité désadénylase de PAN2 est stimulée par PABP en présence de PAN3 (Uchida et al., 2004).
La désadénylation résulte cependant de l’action consécutive des deux désadénylases PAN2 et CCR4-Caf1 (Yamashita et al., 2005). Le complexe CCR4- Caf1-NOT a été décrit comme le complexe de désadénylation majoritaire dans la cellule. Ce complexe contient plusieurs sous-unités. Les deux seules sous-unités catalytiques sont CCR4 et Caf1. Elles ont une activité exonucléase 3’->5’. NOT est une protéine qui s’associe au complexe mais n’a pas d’activité catalytique.
Ces deux complexes peuvent être recrutés à la queue Poly(A) des ARNm par deux mécanismes indépendants : un premier mécanisme général où les complexes sont recrutés à l’ARNm via les interactions avec PABP (par l’inetrmédiaire de PAN3 et TOB) et un mécanisme alternatif de désadénylation où le recrutement se fait via les interactions avec des protéines interagissant sur des séquences spécifiques en 3’UTR de l’ARNm ou bien à travers la machinerie de microARN (Figure 15).

Le mécanisme général de dégradation des ARNm normaux

La queue Poly(A) à l’extrémité 3’ de l’ARNm subit la désadénylation dès que l’ARNm mature arrive dans le cytoplasme. Elle se réalise indépendamment du fait que le transcrit contienne ou pas des éléments de déstabilisation. Chez la levure, le complexe PAN2-PAN3 qui intervient dans un premier temps nécessite la Pabp1 pour la suppression de la queue Poly(A). De même, le complexe humain homologue est aussi fortement stimulé par PABP. Il est généralement admis que PABP est exigé pour le recrutement du complexe in vivo, donc cela suggère que PAN2-PAN3 n’est actif que sur un complexe Poly(A)-PABP. L’activité enzymatique de désadénylation de PAN2 est distributive (Yamashita et al., 2005). Son action réduit la longueur de la queue Poly(A) à une centaine de nucléotides. Dans une seconde étape, le complexe CCR4-NOT dégrade le reste de la queue Poly(A), ne laissant subsister qu’une dizaine de nucléotides. L’action de ce complexe est processive. Quand la queue est suffisamment courte (quelques résidus adénosine), l’ARNm peut être dégradé à partir de son extrémité 3’ par un complexe exonucléasique 3’5’, l’exosome. Cette voie de dégradation par l’exosome n’est cependant pas la voie la plus fréquemment utilisée. Il est généralement admis que les ARNm désadénylés sont majoritairement sujet au décoiffage de leur extrémité 5′ qui est assuré par le complexe Dcp1-Dcp2 (Decaping protein 1/2). Une fois la coiffe mG7 enlevée, l’extrémité 5’ de l’ARNm est accessible à l’exoribonucléase XRN1 qui dégrade l’ARNm à partir de son extrémité 5’ (revue dans Garneau et al., 2007) (Figure 16). L’étape de décoiffage est sous le contrôle de l’interaction PABP-eIF4G. PABP semble à lui seul gêner les protéines Lsm1p-7p qui activent les enzymes de décoiffage (Parker and Song, 2004).
Par ailleurs, il a été décrit que les facteurs TOB/BTG peuvent avoir une influence importante sur la désadénylation. Ces protéines appartiennent à la famille des protéines antiprolifératives dont l’expression est altérée dans différents cancers. Les protéines TOB ont la capacité d’inhiber la prolifération cellulaire (Wahle and Winkler, 2013) et régulent le cycle cellulaire (Winkler and Balacco, 2013). Elles peuvent interagir, d’une part, avec la désadénylase Caf1 ((Mauxion et al., 2009) et, d’autre part, avec PABP par l’intermédiaire de leur motif PAM2 (Ezzeddine et al., 2007). Il a été montré que les protéines TOB/BTG peuvent activer la désadénylation des ARNm des cellules en culture (Ezzeddine et al., 2007, 2012). Cette activation est due à 2 rôles de TOB : d’une part, le recrutement de Caf1 par TOB augmente son activité désadénylase et, d’autre part, le recrutement sur PABP lié à la queue Poly(A) du complexe TOB-CCR4–NOT initie la désadénylation de l’ARNm (Funakoshi et al., 2007).
L’affinité de TOB pour PABP n’affecte pas son interaction avec Caf1 (Ruan et al, 2010). D’après ces descriptions, TOB fait partie des éléments importants pour la régulation globale des ARNm par la désadénylation. Ainsi TOB est intégré dans le mécanisme du recrutement général des désadénylases sur la queue Poly (A).

La dégradation par miRNA

Dans les cellules mammifères, 60% des ARNm sont régulés par des microARN (Friedman et al., 2009). Le participant majeur de cet événement est le complexe RISC. Ce complexe comprend le micro-ARN, la protéine Ago (Argonaute) et la protéine GW182. Il interagit avec l’ARNm cible, conduisant à l’inhibition de la traduction et éventuellement à la dégradation de l’ARNm. La protéine GW182 interagit avec PABP et recrute les complexes de désadénylation CCR4–NOT, PAN2-PAN3 et l’ubiquitine ligase E3. Les protéines PAN3, NOT et PABP peuvent interagir au niveau du domaine C-terminal de GW182. GW182 interagit avec PABP, en particulier par son site PAM2, mais le rôle de cette interaction reste peu clair. (Fabian and Sonenberg, 2012). GW182 semble aussi stimuler l’activité des désadénylases (Fabian et al., 2011). Certains auteurs pensent que PABP joue le rôle d’un médiateur de la répression de la traduction par micro-ARN (Moretti et al., 2012). Il pourrait apporter à l’ARNm les protéines du complexe RISC à travers son interaction avec la protéine GW182. La protéine GW182 pourrait entrer en compétition avec eIF4G et probablement avec la queue Poly(A) pour se fixer à PABP, interférant avec la circularisation de l’ARNm et menant à sa dégradation (Zekri et al., 2009). L’interaction du complexe RISC avec l’ARNm pourrait aussi entrainer le déplacement de PABP ce qui déclencherait le mécanisme de répression de la traduction et la dégradation (revue dans Eliseeva et al., 2013). Le recrutement du complexe CCR4-NOT par GW182 pourrait enfin perturber l’interaction de PABP et la conformation circulaire de l’ARNm et donc inhiber l’initiation de la traduction et conduire à la dégradation de l’ARNm (Zekri et al., 2013)(Figure 17).

La dégradation par la voie NMD

La voie NMD (Nonsense-Mediated mRNA Decay) est un mécanisme de surveillance qui dégrade les ARNm contenant un codon stop prématuré (PTC). La terminaison prématurée de la traduction rend les ARNm cibles de la NMD ( revue dans Amrani et al., 2006). Dans les cellules mammifères, la reconnaissance des PTCs nécessite la présence du complexe EJC (Exon Junction Complex) sur l’ARNm. La présence de ce complexe en aval d’un codon stop va permettre de discriminer entre un codon stop naturel et un codon stop prématuré. Le facteur Upf1, une ATPase/hélicase ARN-dépendante et la protéine kinase SMG1 (phosphatidylinoditol kinase-related serine/threonine) s’associent avec le complexe de terminaison eRF1 et eRF3 pour former le complexe SURF. (Kashima et al., 2006). Une fois la terminaison de la traduction achevée au codon stop prématuré, Upf1 est phosphorylé par SMG1 et recrute le complexe SMG6, 5 et 7 sur l’ARNm. L’ARNm est dégradé d’abord par l’action endonucléolytique de SMG6 et les fragments résiduels sont dégradés par les complexes exonucléasiques décrits plus haut: exosome 3’->5’ et XRN1 5’->3’ (Figure 18). Le facteur eRF3 est très impliqué dans la NMD. Certaines mutations de eRF3 entraînent l’accumulation de transcrits contenant des PTC tels que les ARNm his7-1 et CYH 2. Ces mutations diminuent l’efficacité de la traduction mais, paradoxalement, augmentent la stabilité de ces ARNm (Murina et al., 2010). Cet effet serait dû à un défaut du complexe SURF. Plus généralement, l’interaction PABP-eRF3 serait impliquée dans le processus déterminant si l’ARNm va être dégradé par la voir normale ou par la NMD. En effet, la longueur de la partie 3’UTR est déterminante pour la NMD et la distance entre le codon de terminaison et la queue Poly(A) est cruciale pour déterminer si l’ARNm va être dégradé par la voie NMD ou la voie générale de dégradation-désadénylation-dépendante. La voie NMD permet donc d’éliminer non seulement les ARNm portant un codon stop
prématuré mais aussi ceux ayant une longue région 3’UTR (Kebaara and Atkin, 2009; Zaborske et al., 2013). Pour expliquer cela, les modèles récents de la NMD suggèrent que une grande distance physique entre la queue Poly(A) et le codon de terminaison de la traduction réduit l’interaction entre PABP et eRF3 pendant la traduction. Ce qui mène eRF3 à recruter le facteur de la NMD Upf1 et la NMD est déclenchée, le codon stop naturel étant reconnu comme un codon stop prématuré. Dans le cas où la distance codon stop-queue Poly(A) favorise l’interaction d’eRF3 avec PABP, la dégradation désadénylation-dépendante est déclenchée. Etant donné que PAN3 comme eRF3 est une protéine qui interagit avec PABP, l’absence d’une interaction entre eRF3 et PABP peut augmenter l’interaction de PAN3 avec PABP, ce qui favorise le recrutement des complexes de désadénylation PAN2-PAN3 et CCR4-NOT aux complexe PABP-Poly(A). Ainsi, la protéine PABP a été définie comme un facteur bloquant la NMD (Singh et al., 2008). Autrement dit, Upf1 entre en compétition avec PABP pour l’interaction avec eRF3. Par ailleurs, il a été montré que l’interaction de PABP avec eIF4G (qui permet la circularization de l’ARNm) est essentielle pour l’inhibition de la NMD par la PABP. De plus, le recrutement d’eRF3 ou d’eIF4G à proximité du codon stop prématuré bloque la NMD. eIF4G est un antagoniste à la NMD, ce qui suggère un lien entre la terminaison de la traduction, la circularisation de l’ARNm et le blocage de la NMD (Fatscher et al., 2014).
Pour conclure ce chapitre, les protéines PABP, eRF3, PAN3 et TOB sont impliquées dans le mécanisme général de désadénylation. La capacité des deux complexes PAN2-PAN3 et CCR4-NOT à interagir avec PABP peut induire le mécanisme général de la désadénylation qui pourrait également être impliqué dans la terminaison de la traduction (Funakoshi et al, 2007).
La terminaison de la traduction à elle seule ne déclenche pas la dégradation des ARNm. eRF3 serait un médiateur qui, par son interaction avec PABP, fait transiter le signal de la terminaison vers la dégradation (Kobayashi et al., 2004). Comment est formée l’interaction de PABP avec eRF3 ? Comment cette interaction est-elle impliquée dans la stabilité des ARNm? Ces questions feront l’objet du chapitre suivant.

Table des matières

Introduction
Chapitre I : La traduction des ARN messagers
I. L’ARN messager
II. La traduction des ARN messagers
II.1. Les étapes de la traduction chez les eucaryotes
II.1.1. L’initiation
II.1.2. L’élongation
II.1.3. La terminaison
II.1.3.1. Mécanisme général
II.1.3.2. Le facteur de terminaison de la traduction eRF1
II.2. Le facteur de terminaison de la traduction eRF3
II.2.1. Historique de l’identification d’eRF3
II.2.2. Structure du facteur eRF3
II.2.3. Mécanisme d’action d’eRF3 dans la terminaison de la traduction
Chapitre II : Le facteur eRF3 en dehors de la terminaison de la traduction
I. Les gènes GSPT1 et GSPT2 humains
II. Les formes alléliques d’eRF3a
III. La traduction et le cancer
III.1. La susceptibilité génétique au cancer
III.2. Le cancer et la machinerie de la traduction
III.3. Le facteur eRF3a et le cancer
III.4. Rôle d’eRF3 dans l’apoptose
Chapitre III : La régulation de la stabilité de l’ARN messager
I. La protéine d’interaction à la queue Poly(A) : PABP
I.1. Identification de PABP
I.2. Structure et fonction de PABP
I.2.1. Les domaines RRMs de PABP
I.2.2. La région « linker » de PABP
I.3. Rôles de PABP
I.3.1. Rôle dans la polyadénylation de l’ARNm
I.3.2. Rôle dans la traduction
II. Stabilité et dégradation de l’ARNm
II.1. La dégradation par la voie de dégradation désadénylation-dépendante
II.1.1. L’étape limitante de la dégradation : la désadénylation
II.1.2. Les complexes de désadénylation PAN2-PAN3 et CCR4- NOT
II.2. Le mécanisme général de dégradation des ARNm normaux
II.3. La dégradation par miRNA
II.4. La dégradation par la voie NMD
Chapitre IV : L’interaction eRF3-PABP et son implication dans la régulation de la stabilité des ARNm
I. L’interaction eRF3-PABP
I.1. Identification de l’interaction eRF3-PABP
I.2. L’interaction MLLE-PAM2
I.2.1. La reconnaissance PAM2-MLLE
I.2.2. La stoechiométrie de l’interaction PABP-eRF3
II. Le motif PAM2 dans d’autres protéines
III. L’interaction MLLE de PABP et PAM2 d’eRF3 et la stabilité des ARN messagers
IV. L’interaction eRF3-Pab1 chez la levure S. cerevisiae
V. Rôle des deux motifs PAM2 d’eRF3
Le projet de la thèse
Résultats
I. Mise au point du système d’étude
I.1. Surexpression des facteurs protéiques
I.2. Mise au point des expériences de résonance plasmonique de surface (SPR)
I.4. Choix de la densité et du flux d’injection de l’analyte eRF3
II. Mesure des paramètres cinétiques de l’interaction eRF3-PABP sur Sensor Chip CM5
II.1. L’affinité de la forme 12-GGC d’eRF3a pour PABP est la plus faible par rapport aux autres formes alléliques d’eRF3
II.2. La faible affinité de l’allèle eRF3a 12-GGC avec PABP est due essentiellement à la faible association du complexe
III. Etude des interactions des formes alléliques d’eRF3a sur le complexe PABP-Poly(A) – Sensor Chip SA
III.1. Etude de l’interaction PABP-Poly(A)
III.2. La forme 12-GGC d’eRF3a semble interagir plus faiblement avec le complexe PABP-Poly(A)
IV. Mesure des paramètres cinétiques par la stratégie ‘multiple cycles’
VI. Le motif PAM2-N est le plus impliqué dans l’interaction d’eRF3 avec PABP
VII. Etude de la compétition entre les facteurs de désadénylation et eRF3
Discussion et perspectives
Bibliographie

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