L’initiation du changement de type sexuel dépendante de l’expression de l’endonucléase HO

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Organisation du noyau chez S. cerevisiae

L’organisation de la fibre de chromatine dans le noyau est au cœur de la régulation des mécanismes de réplication, de transcription et de maintenance du génome. L’organisation du génome en domaines et territoires chromatiniens contribue à cette régulation. Ces territoires peuvent sensiblement varier selon la distribution et l’état de condensation de la chromatine.

Hétérochromatine vs Euchromatine

En 1871, Friedrich Miescher purifie pour la première fois de l’ADN de leucocytes et lui attribue le nom de « nuclein », dû à sa localisation dans le noyau. En 1879, W. Flemming décrit le comportement et la morphologie des chromosomes pendant la mitose et propose le terme de chromatine. Par la suite, l’organisation de la chromatine dans le noyau fut décrite pour la première fois sous les noms d’hétérochromatine et d’euchromatine selon des critères cytologiques (Heitz, 1928). La microscopie électronique permit de préciser une différence de structure et de répartition dans le noyau entre l’hétérochromatine et l’euchromatine (Tooze & Davies, 1967). Chez les eucaryotes supérieurs, l’hétérochromatine est localisée au niveau de la périphérie nucléaire : elle est plus dense aux électrons car la fibre est plus compacte. L’hétérochromatine est en général corrélée avec les gènes non transcrits. Au contraire, l’euchromatine, très peu contrastée, reflète une chromatine décondensée. Elle est associée aux gènes actifs en transcription. Ces états sont transitoires et des régions d’hétérochromatine peuvent devenir de l’euchromatine selon la position dans le noyau ou l’activation spécifique de la transcription de certains gènes. L’organisation de la chromatine est dynamique, elle peut être régulée au cours du cycle cellulaire par des modifications post-traductionnelles ou l’incorporation de variants d’histones (Grewal & Jia, 2007).
Chez la levure S. cerevisiae, l’hétérochromatine est difficilement observable par des approches cytologiques (Léger-Silvestre, Trumtel, Noaillac-Depeyre, & Gas, 1999). Ces observations sont cohérentes avec la proportion d’hétérochromatine observée chez S. cerevisiae d’environ 1% contre 95% chez les métazoaires. Néanmoins, l’étude de régions de « pseudo-hétérochromatine », chez la levure, a déterminé le fondement des mécanismes moléculaires sous-jacents à sa mise en place. Ces régions de « pseudo-hétérochromatine » sont présentes au niveau des télomères et des loci Hidden Mat (HM). Elles se retrouvent proches de la périphérie nucléaire, ne sont pas transcrites et révèlent une hypoacétylation des histones (Braunstein, 1996; Gotta et al., 1996;Rine & Herskowitz, 1987). Nous détaillerons le mécanisme de mise en silence des régions HM dans la partie concernant la régulation du choix du donneur lors du changement de type sexuel (section II 1 ; 1.2.).

Architecture du noyau chez S. cerevisiae

Chez S. cerevisiae, les chromosomes sont organisés selon une configuration dite Rabl, qui implique le regroupement des centromères au pôle de la cellule via des microtubules générés par le SPB (Spindle Pole Body) ainsi que la proximité des télomères vers la périphérie nucléaire (Bystricky, Laroche, Van Houwe, Blaszczyk, & Gasser, 2005; Dekker et al., 2002; Jin, Fuchs, & Loidl, 2000; Palladino et al., 1993; Schober et al., 2008; Therizols & Fabre, 2010).

Le Spindle Pole Body (SPB)

Chez S. cerevisiae (et d’autres Levures) une « mitose fermée », sans rupture de l’enveloppe nucléaire, a lieu lors de la division cellulaire. Ce processus dépend d’une structure appelée le SPB. Le SPB permet d’organiser le cytosquelette dans le cytoplasme et connecte les microtubules au niveau des kinétochores présents sur la région centromérique (McAinsh, Tytell, & Sorger, 2003). De la même manière, il contrôle l’organisation des chromosomes tout au long du cycle cellulaire. Pendant l’interphase il assure le regroupement des centromères de l’ensemble des chromosomes au pôle de la cellule (Bystricky et al., 2005, Guacci, Hogan, & Koshland, 1997, Jin et al., 2000). Le SPB se positionne systématiquement du côté de l’apparition du bourgeon à l’opposé du nucléole (Yang 1989, Bystricky 2004, 2005). Au cours du cycle cellulaire, il se duplique en G1/S et migre afin d’assurer la ségrégation des chromatides lors de la division cellulaire. Son rôle est capital dans l’organisation du noyau et le regroupement des centromères participe chez S. cerevisiae à l’organisation du génome sous la conformation Rabl.

Les télomères

Les télomères ont un rôle majeur dans l’organisation du génome de S. cerevisiae via leurs interactions avec la périphérie nucléaire. La conformation Rabl telle que décrite chez S. cerevisiae suggère que les bras des chromosomes sont parrallèles entre eux et que les télomères demeurent à la périphérie. Le marquage en FISH des 32 télomères permis d’observer que ces derniers se regroupent en seulement 3 à 6 foyers localisés au niveau de la périphérie nucléaire (Bystricky et al., 2005, Schober et al., 2008,Hediger & Gasser, 2002, Funabiki & Yanagida, 1993,Gotta et al., 1996,Palladino et al., 1993, Taddei & Gasser, 2004)(Figure 3A et B).
En 2004, Taddei et ses collaborateurs démontrent que la mutation de la protéine Sir4 entraîne la dégradation des foyers télomériques ainsi que la relocalisation de certaines régions subtélomériques de la périphérie nucléaire (Bystricky et al., 2009; Taddei, Hediger, Neumann, Bauer, & Gasser, 2004). Sir4 appartient à la famille des protéines SIR (Silent Information Regulator). Elle est impliquée dans l’établissement de l’hétérochromatine répressive au niveau des régions subtélomériques et des loci de l’identité sexuelle HM.
L’établissement de l’hétérochromatine répressive sur les régions subtélomériques débute avec le recrutement de la protéine Rap1 au niveau des séquences télomériques « TG1-3 »
répétées en tandem (de 250-300pb) (pour revue Taddei, Schober, & Gasser, 2010, Therizols & Fabre, 2010). La protéine Rap1, présente à la jonction des télomères et des régions subtélomériques, recrute via son domaine C-terminal la protéine Sir3 (Shampay, Szostak, & Blackburn, 1984)(Moretti, Freeman, Coodly, & Shore, 1994)(Wotton & Shore, 1997)(Moretti et al., 1994)(Shore & Nasmyth, 1987). A son tour, la protéine Sir3 induit le recrutement l’hétérodimère Sir4/Sir2. Au sein de ce complexe, la protéine Sir2 déacétyle les queues d’histones H3 et H4 au niveau des résidus H3K56 et H4K16, K79. La modification post-traductionnelle H4K16 permet aux protéines Sir3 libres de se fixer sur les nucléosomes, favorisant la propagation de la formation d’hétérochromatine répréssive (Ottaviani, Gilson, & Magdinier, 2008).
La protéine Sir4 assure le positionnement des télomères à la périphérie via sa capacité à interagir avec la protéine de la membrane nucléaire interne Esc1. Cependant, des études confirment que la mutation de la protéine Sir3 n’affecte pas l’association des télomères avec la paroi nucléaire concédant que l’établissement d’hétérochromatine et la position des télomères sont deux fonctions pouvant être découplées (Hediger, Neumann, Van Houwe, Dubrana, & Gasser, 2002a; Taddei, Schober, & Gasser, 2010). En effet, la protéine Sir4 peut être recrutée de manière Sir3 indépendante, et ce directement par la protéine Rap1, présente sur les répétitions en tandem des télomères, assurant, via son interaction avec Esc1, un point d’ancrage. La protéine Sir4 est recrutée en formant un complexe avec l’hétérodimère yKU70/80, en charge de la protection des extrémités des télomères (Hetch and G & runstein, 1996) (Figure 3C). Le complexe yKU/Sir4 interagit avec le domaine SUN de la protéine transmembranaire Mps3, via le cofacteur de la télomérase appelé Est1, assurant un point d’ancrage indépendant de Sir3 (pour revue Kueng, Oppikofer, & Gasser, 2013) . De manière intéressante, la mutation des gènes esc1 et yku70 entraine une relocalisation des télomères ainsi que le relargage de la protéine Sir2 dans le nucléoplasme, conduisant à une forte dérépression des régions subtélomériques (Maillet et al., 2001; Taddei et al., 2009). De ce fait, la perte de l’ancrage, et donc de l’hétérochromatine protégeant les extrémités des télomères entraîne alors un raccourcissement des télomères via des évènements de recombinaison (Taddei et al., 2009).

Les pores nucléaires

Les pores nucléaires représentent un élément de structure important du noyau. D’une masse moléculaire d’environ 60 MDa chez la levure (Vasu & Forbes, 2001), entre 65 et 180 pores par noyau sont observés (Winey & Mastronarde, 1997).

Formation de l’hétérochromatine au niveau des télomères et des régions subtélomériques

Ils sont composés de plusieurs protéines, de type nucléoporine facilitant la régulation des échanges entre le cytoplasme et le noyau. La diffusion libre de protéines jusqu’à 40kDa est observée et des mécanismes de transports actifs sont utilisés pour le passage de protéines plus importantes (Gorlich & Kutay, 1999). La partie interne du pore nucléaire est constituée de filaments formant un panier. Ce dernier est un point d’ancrage pour la chromatine (Dilworth & Chambon, 2001, Ishii & Laemmli, 2002, Galy et al., 2000). En 1985 Blobel a émit l’hypothèse que les gènes transcrits sont relocalisés vers les pores nucléaires afin de faciliter l’exportation des ARNm (Blobel, 1985), phénomène qu’il appela « gene gating ». Plus récemment, l’association de gènes avec un pore nucléaire fut mise en évidence par une approche de ChIP (Casolari et al., 2004; Ishii & Laemmli, 2002). En 2006, Cabal et ses collaborateurs établissent in vivo que les gènes GAL (GAL7, GAL 10 et GAL1) occupent un volume nucléaire donné lorsqu’ils sont inactifs en transcription : 57% d’entre eux sont au centre du noyau et 43% sont à la périphérie. En revanche, l’activation de la transcription des gènes GAL semble induire un déplacement de ces derniers vers la périphérie nucléaire (Cabal et al., 2006). La transcription semble favoriser la relocalisation de certains gènes. Cependant la relation de causalité entre la localisation aux pores et la transcription reste encore à démontrer. (Pour revue Dieppois, Iglesias, & Stutz, 2006). Il est, néanmoins, clairement établi que la localisation en périphérie n’est pas systématiquement requise pour la transcription (Cabal et al., 2006, Taddei et al., 2006) mais qu’il existe un environnement local favorable à la transcription à proximité des pores nucléaires.
L’interaction, entre la protéine Sir4 et la protéine Nup170 appartenant au complexe du pore nucléaire, a pu être mise en évidence (Van De Vosse et al., 2013). Il est intéressant de souligner que l’interaction avec un pore nucléaire soit parfois associée avec l’activation de la transcription pour certains gènes. Ainsi, l’association d’une région subtélomérique avec un pore nucléaire, pourrait contribuer à la régulation de la transcription de gènes normalement réprimés (Taddei et al., 2006(Ishii & Laemmli, 2002, Cabal et al., 2006).
La périphérie nucléaire est donc un environnement hétérogène partagé entre des locus transcrits et l’hétérochromatine périphérique défavorable à la transcription. En effet, certains gènes actifs en transcription sont associés aux pores nucléaires tandis que les foyers télomériques sont corrélés avec une répression de la transcription (Andrulis, Neiman, Zappulla, & Sternglanz, 1998,Taddei et al., 2009). La position et l’état de transcription d’un locus semblent être deux caractéristiques dissociables. Or, la suppression de certains composants du pore nucléaire entraîne la délocalisation d’une partie des télomères, suggérant un lien structural ou fonctionnel entre ces deux entités organisant le génome (Galy et al., 2000).

Les territoires chromosomiques

Découverte des territoires chromosomiques

La notion de territoires chromosomiques fut soumise par Carl Rabl en 1885 (Rabl 1885) puis étoffée par Théodore Boveri en 1909 (Boveri 1907). Rabl avança que les chromosomes condensés lors de la mitose conservaient la même répartition dans l’espace lors de l’interphase. Boveri put observer la ségrégation des chromosomes lors de la mitose dans des cellules germinales de vers marins (Annelides) et conclua que les chromosomes étaient séparés par un espace interchromatinien pendant l’interphase (pour revue Cremer et al., 2006). Cependant, les premières observations du noyau par microscopie électronique n’étaient pas assez contrastées lors de l’interphase. Il faudra attendre l’apparition des techniques d’hybridation de sondes fluorescentes in situ et l’utilisation de nucléosomes fluorescents pour observer l’existence des territoires chromosomiques sur un chromosome entier chez des cellules eucaryotes supérieures (T. Cremer & Cremer, 2001; Thomas Cremer et al., 2006; Zink et al., 1998)(Figure 5). Chez S. cerevisiae, l’existence de territoires chromosomiques fut largement discutée, du fait de la limite de résolution des techniques de microscopies ainsi que la taille réduite du noyau (2µm) et du génome (12.106pb) par rapport à une cellule d’eucaryote supérieure.

Les territoires chromosomiques chez S. cerevisiae

En 2002, J. Dekker et al. proposent, via une approche de 3C, un modèle d’organisation du chromosome III chez S. cerevisiae, dans lequel le centromère forme un angle aigu et les télomères sont proches l’un de l’autre (Dekker et al., 2002). Plus tard, des approches de microscopie à fluorescence indiquent que les télomères gauche des chromosomes III et IV se regroupent vers la périphérie (Bystricky & Gasser, 2005). Par ailleurs, plusieurs études dénotent que deux télomères, présents sur des chromosomes ayant des bras de longueurs différentes, ne sont pas regroupés (Schober et al., 2008,Therizols et al., 2010).
Une étude de 4C (dérivée du 3C) à l’échelle du génome a permis de proposer plusieurs modèles de conformation du génome, dont certains sont cohérents avec une conformation Rabl (Duan et al., 2010)(Figure 5 E et F). Dans cette étude, les auteurs soutiennent également la présence de territoires chromosomiques chez la levure. En effet les interactions intrachromosomiques, notamment celles au niveau des télomères, semblent plus fréquentes que les interactions interchromosomiques. Il en va de même pour les chromosomes asymétriques, suggérant que chaque chromosome occupe un territoire propre.
Chez les cellules d’eucaryotes supérieurs, les territoires chromosomiques semblent prédominer sur l’organisation nucléaire (Rouquette, Cremer, Cremer, & Fakan, 2010). Chez S. cerevisiae, l’organisation imposée par la conformation Rabl du génome de levure est compatible avec cette notion, mais semble affecter différemment la dynamique de la chromatine.

Le mécanisme de changement de type sexuel chez la levure S cerevisiae

Le type sexuel et le changement de type sexuel chez S. cerevisiae

La reproduction sexuée

Le génome est défini par l’ensemble du matériel génétique d’un individu. Il est composé d’acides désoxyribonucléiques (d’ADN) organisés en chromosomes. Cette information génétique est transmise aux cellules filles lors de la division cellulaire appelée la mitose. Ce processus permet de ségréger équitablement les chromatides de chaque chromosome entre deux cellules filles. Le nombre de chromosomes d’une cellule définit son état de ploïdie. La présence d’une seule copie de chaque chromosome est l’état haploïde. Par opposition, une cellule est diploïde (du grec diploos, double) lorsque les chromosomes sont présents par paires. La transition de ploïdie a lieu au cours du cycle cellulaire ou de la reproduction sexuée. Les métazoaires et les angiospermes sont diplobiontes ; l’adulte est diploïde et l’état haploïde est principalement limité aux gamètes. Les Levures, quant à elles, sont haplodiplobiontes, elles sont capables de se reproduire végétativement par simple mitose tant à l’état haploïde qu’à l’état diploïde. Le rôle de gamète est assuré par les cellules haploïdes qui forment un diploïde. Chez S. cerevisiae, la diploïdie est la forme la plus fréquente dans la nature. En condition de stress les diploïdes peuvent réaliser une méiose et générer des tétrades contenant quatre spores (J. E. Haber, 2012). Ces spores, résistantes aux conditions extrêmes, permettent de reformer de nouvelles cellules haploïdes lorsque les conditions environnantes redeviennent propices. Ainsi, la reproduction sexuée assure le retour à l’état diploïde dans l’éventualité où une spore se retrouverait isolée.

Le changement de type sexuel par conversion génique

Le locus MAT et sa conversion génique

La reproduction sexuée implique la présence des deux types sexuels. Chez S. cerevisiae, le type sexuel d’une cellule haploïde est défini par l’expression du locus MAT situé sur le bras droit du chromosome III (Figure 6A). Le locus MAT est composé des régions W, X, Y, Z1 et Z2 dont les allèles Ya et Yα permettent l’expression du phénotype sexuel respectivement MATa ou MATα. Ces deux allèles contrôlent l’activation et la répression de plusieurs gènes spécifiques du type sexuel et assurent la coordination d’un mécanisme longuement étudié chez S. cerevisiae, appelé le changement de type sexuel.
Le changement de type sexuel assure la présence des haplotypes MATa et MATα au sein de la population pour la reproduction sexuée. Ce processus, appelé l’homothallisme (auto fécondation), fait intervenir une conversion génique du locus MATa en MATα et inversement dans une cellule mère avant sa division (Figure 6B).

Les loci HML et HMR

La conversion génique du locus MAT nécessite la présence de séquences hétérologues a et α dans le génome. Sur le chromosome III, deux régions homologues au locus MAT appelées HM pour Hidden MAT Locus, sont présentes au niveau des régions subtélomériques (Figure 6A). Sur le bras gauche on distingue le locus HMLα, similaire au locus MATα. Il porte l’allèle Yα et les séquences flanquantes W, X, Z1 et Z2. Sur le bras droit le locus HMRa est plus réduit. Il porte l’allèle Ya, entouré seulement des régions X et Z1 (McGill, Shafer, & Strathern, 1989).
Les régions HM présentent toutes deux une organisation hétérochromatique particulière conduisant à leur mise en silence. L’étude des mécanismes impliqués dans ce phénomène a permis de comprendre de manière générale l’établissement d’hétérochromatine et de mise en silence chez S. cerevisiae et les eucaryotes supérieurs à posteriori (Laurenson & Rine, 1992, Loo & Rine, 1994, Sherman & Pillus, 1997, Åström & Rine, 1998,Rusche & Rine, 2003, Hickman & Rusche, 2011). La mise en silence des régions HM joue un rôle essentiel dans le maintien du type sexuel et dans l’utilisation des locus HML et HMR lors du changement de type sexuel. La présence d’hétérochromatine masque l’accessibilité des régions HM, régulant négativement la transcription des séquences Yα et Ya (Brand et al., 1985,Schnell & Rine, 1986).

La mise en silence des loci HM

Les séquences HMLα et HMRa sont bordées par des séquences de mise en silence dénommées HML-E / HML-I et HMR-E / HMR-I (Figure 5C). Elles permettent le recrutement de protéines Abf1, Rap1, Orc et Sir1, 2, 3, 4 (Silent Information Regulator) qui lient l’ADN et modifient l’organisation de la chromatine (Figure 5C). Ce mécanisme facilite le positionnement régulier des nucléosomes, déclenchant la formation d’une structure hétérochromatinienne sur une distance de 3kb au niveau des séquences HMLα et HMRa (K. A. Nasmyth, 1982, Ravindra & Simpson, 1999, Weiss & Simpson, 1998). L’un des acteurs principaux, impliqué dans la mise en silence, est la désacétylase Sir2, responsable de la désacétylation des lysines, présentes sur les queues N-terminales des histones H3 et H4 (Imai & Guarente, 2000). De manière surprenante, la mise en silence des loci HMLα et HMRa n’est pas identique. En effet, la séquence HMR-E est suffisante pour réprimer la transcription d’un gène inséré dans HMR à la place de la séquence Ya. A l’inverse, la présence de la séquence HMR-I seule n’est pas suffisante (Abraham & Hicks, 1984, Brand & Nasmyth, 1985). Les séquences HML-E et HML-I agissent indépendamment l’une de l’autre pour la mise en silence des loci HM (Mahoney & Broach, 1989) et la distance qui les sépare est conséquente. En effet, le remplacement du locus HMLα, par un gène LEU2, conduit à la mise en silence et l’inhibition de l’expression de ce dernier. En revanche, si le gène LEU2 est inséré au milieu de la séquence HMLα, la mise en silence devient plus faible et la transcription résiduelle du gène LEU2 permet alors la croissance des cellules sur un milieu sans leucine (J. E. Haber, 2012).

L’initiation du changement de type sexuel dépendante de l’expression de l’endonucléase HO

En 1982, Strathern établit que l’initiation du changement de type sexuel nécessite l’expression transitoire de l’endonucléase HO. La transcription de l’endonucléase HO est limitée aux cellules mères qui se sont divisées au moins une fois. Le contrôle de l’expression de l’HO dépend du facteur de transcription Swi5, qui est localisé sur le noyau de la cellule mère uniquement (K Nasmyth, 1987). L’absence d’expression de Swi5 chez les cellules filles est causée par la présence d’un gradient d’ARNm, précurseur de la protéine Ash1, présent seulement dans la cellule fille (Bobola, Jansen, Shin, & Nasmyth, 1996; Derbyshire, Weinstock, & Strathern, 1996; Sil & Herskowitz, 1996). Ash1 réprime directement la transcription SWI5, limitant ainsi l’expression HO à la cellule mère au stade G1 suivant du cycle cellulaire.
L’endonucléase HO cible une séquence spécifique de 24 pb, localisée à la bordure des régions Z1 et Ya / Yα, causant une cassure double brin sur le locus MAT. Cette cassure double brin est réparée par une recombinaison homologue particulière appelée la conversion génique entre la séquence Ya / Yα, présente sur le locus MAT et une séquence homologue Ya / Yα se situant respectivement aux niveaux des séquences HML et HMR. La présence d’hétérochromatine, au niveau des régions HM, masque le site de restriction HO également présent. Ainsi, les loci HM sont utilisés comme donneurs intègres, évitant des évènements de recombinaison aberrante entre les trois loci MAT, HMLα et HMRa (White & Haber, 1990, Weiss & Simpson, 1998, Connolly & Haber, 1988, Loo & Rine, 1994).
L’homologie entre la fin de la région Z du locus MAT et des séquences HML/HMR est suffisante pour assurer une recombinaison efficace. Une fois appariée, l’extrémité 3’ du brin invasif permet d’initier la synthèse d’ADN en recopiant la matrice sur le brin donneur (HML/HMR) conduisant au remplacement de la séquence Y d’origine du locus MAT (Hicks, amaguchi, & Haber, 2011; White & Haber, 1990). Par la suite, la synthèse d’ADN se prolonge sur la région X, permettant la génération d’homologie suffisante pour la recapture du brin néosynthétisé et sa ligation. Ainsi, la région Y du locus MAT est remplacée, tandis qu’elle reste intacte au niveau des donneurs (Rudin & Haber, 1988).

Choix du donneur et rôle du recombination enhancer

Lors du changement de type sexuel, le choix entre la séquence HMLα et HMRa, pour réparer la cassure double brin au site HO n’est pas aléatoire (Figure 8). En effet, 80% des cellules MATa utilisent préférentiellement le locus HMLα tandis que 90% des cellules MATα choisissent le locus HMRa changeant, par conséquent de type sexuel (Klar & Strathern, 1982, Weiler & Broach, 1992, Xiaohua Wu & Haber, 1996). La première hypothèse, émise sur le choix du donneur pour réparer le locus MAT, impliquait la séquence des locus HM (X. Wu & Haber, 1995).
Cependant, des approches génétiques ont permis de montrer qu’en inversant les loci HMRa et HMLα, une cellule MATa utilisait toujours le bras gauche indépendamment de la séquence présente (Klar et al., 1982, Weiler & Broach, 1992). De plus, dans le cas de la suppression de la séquence HMLα, une cellule MATa utilise alors la séquence HMRa. En 1995 Wu et al., notent que la suppression de la séquence HMRa dans une cellule MATα conduit à l’impossibilité de réparer la cassure double brin qui in fine cause la mort de 50% des cellules (X. Wu & Haber, 1995). Cependant, Coïc et ses collaborateurs précisent que seulement 30% des cellules meurent dans la situation similaire (Coic, Sun, Wu, & Haber, 2006a).
Haber et Wu ont pu mettre en relief que le bras gauche du chromosome III semble être naturellement réfractaire à la recombinaison dans le type sexuel MATα et est inversement plus actif pour la recombinaison dans les cellules MATa (J. E. Haber, 2012, X. Wu & Haber, 1995). Ces résultats ont conforté l’hypothèse sur le rôle prépondérant de la position des locus HM en regard de la nature de la séquence (X Wu, Moore, & Haber, 1996).
L’activation du bras gauche du chromosome III, pour la recombinaison uniquement dans les cellules MATa, a débouché sur la recherche d’une séquence activatrice en cis proche du locus HMLα. Pour ce faire, la séquence du donneur fut déplacée de 12kb à 41kb sur le bras gauche et une série de suppressions de séquences du chromosome III, partant de l’extrémité gauche, fut réalisée. La perte de l’activation du bras gauche pour la recombinaison permit d’identifier une séquence de 2.5kb à une distance de 17kb du locus HMLα original. En l’absence de cette séquence, les cellules MATa choisissent alors le donneur HMLα seulement dans 10% des cas et dans 90% des cas le donneur HMRa. De plus, la suppression de cette même séquence a un effet minime sur le choix du donneur dans les cellules MATα. En revanche, de l’insertion d’une séquence du RE supplémentaire proche du donneur HMRa découle une utilisation égale des deux donneurs dans une cellule MATa. Cette séquence, identifiée en cis sur le bras gauche du chromosome III, fut appelée la « recombination enhancer » (RE) du fait qu’elle « améliore » la recombinaison homologue lors du choix du donneur dans le changement de type sexuel (Szeto & Broach, 1997,Xiaohua Wu & Haber, 1996).

Mécanismes de réparation d’une cassure d’ADN double brin chez S. cerevisiae

Maintien de l’intégrité du génome

Les organismes ont acquis au cours de leur évolution plusieurs mécanismes de réparation de l’ADN assurant la prise en charge de différents types de lésions dans le but de maintenir l’intégrité du génome, éviter la mort cellulaire, l’apparition de maladies ou encore la cancérogenèse.
Les principaux dommages à l’ADN connus sont l’apparition de bases altérées, de sites abasiques, de paires de bases non complémentaires (mésappariements), de liaisons covalentes (pontages) inter et intra-brin de l’hélice d’ADN (dimère de pyrimidine par exemple), de fixations de molécules de manière covalente sur l’ADN (adduit encombrant à l’ADN ou bulky adduct) ainsi que de cassures d’ADN double brin (CDB) et simple brin (CSB).

Généralités et mécanismes de réparation

L’évolution a permis la sélection de mécanismes cellulaires permettant de détecter et de prendre en charge ces différentes lésions de l’ADN. L’origine et la nature d’une lésion représentent des paramètres importants dans le choix du mécanisme de réparation utilisé par la cellule. Outre la réparation par excision de base, d’autres exemples de mécanismes de réparation peuvent être cités tels que la réparation de mésappariements qui permet la prise en charge des erreurs d’incorporation, d’ajout ou de délétions de bases (MMR Mismatch repair)(Hoeijmakers, 2001), la réparation par excision de nucléotides qui assure l’élimination d’un oligonucléotide porteur d’une lésion encombrante comme celles produites par les rayonnements UV ou les composés chimiques provoquant la formation d’adduits à l’ADN ( NER Nucleotide Excision Repair), (Hoeijmakers, 2001).

Les cassures simple brin

Les CSB peuvent apparaître à la suite d’attaques oxydatives causées par des dérivés réactifs de l’oxygène (ROS), ainsi que par la présence de stress topologiques mal résolus par l’ADN topoisomérase TOP1 lors de la transcription ou de la réplication (Champoux, 2001,Caldecott, 2008). Les CSB sont également observées lors de la réparation par excision de base (BER Base Excision Repair). Ce mécanisme de réparation est constitué d’une première étape de reconnaissance et d’excision de la base endommagée par des ADN glycosylases. Ensuite, le site abasique est éliminé par l’action d’une endonucléase entraînant la formation d’une cassure simple-brin de l’ADN (Hoeijmakers, 2001).
Des barrières naturelles sur l’ADN peuvent entraîner l’apparition de CSB, telles que les collisions entre les machineries de réplication et de transcription ou les structures secondaires de l’ADN (Lambert et al, 2005; Mirkin, 2006; Prado & Aguilera, 2005).

Les cassures d’ADN double brin

Les cellules sont capables d’induire une CDB de manière contrôlée dans le but de réarranger une partie de leur génome. Un des exemples principaux concerne les CDB apparaissant lors de la méiose (de Massy, 2013). Les CDB méiotiques sont contrôlées par la protéine Spo11, très conservée au cours de l’évolution (de Massy, 2013, Keeney, Giroux, & Kleckner, 1997). Chez la levure, nous pouvons, outre cela, évoquer l’induction de l’endonucléase HO qui permet d’initier la conversion génique au niveau du locus MAT lors du changement de phénotype sexuel (J. E. Haber, 2012) (Figure 8). Chez les vertébrés, le développement des lymphocytes implique la diversification des anticorps via la voie de recombinaison V(D)J initiée par l’induction de l’endonucléase RAG (Helmink & Sleckman, 2012 ,Alt, Zhang, Meng, Guo, & Schwer, 2013). La réparation d’une CDB est essentielle pour le maintien de l’intégrité du génome. Un défaut, dans la signalisation ou la réparation de dommages à l’ADN, peut conduire à l’accumulation de mutations contribuant à la mort cellulaire ou à la cancérogenèse (Durante et al., 2013,(Larmonie et al., 2013) (Bernstein, Bernstein, Payne, & Garewal, 2002,Thompson & Schild, 2002).
La prise en charge d’une CBD est assurée principalement par deux mécanismes appelés la recombinaison homologue (RH) et la jonction des extrémités non homologue (NHEJ pour Non Homologous End joining).

Mécanismes de réparation des cassures double brin

Les cassures d’ADN double brin sont parmi les lésions de l’ADN les plus délétères pour une cellule et de nombreuses études ont permis de comprendre en détail les mécanismes de RH et de NHEJ.
Dans ce chapitre, je décrirais les processus et protéines impliqués dans la réparation des cassures d’ADN double brin chez la levure S. cerevisiae. Nous évoquerons si les protéines analogues des eucaryotes mammifères sont absentes chez la levure ou si elles présentent un nom différent.

Signalisation des cassures d’ADN

La détection et la signalisation d’une cassure d’ADN représentent les premières étapes dans la voie de réparation de l’ADN. La variété des dommages à l’ADN implique la nécessité pour une cellule d’avoir un système de détection capable de repérer les diverses altérations de la structure de l’ADN. L’apparition d’une lésion à l’ADN active un mécanisme de « réponse aux dommages à l’ADN » (DDR pour DNA Damage response en anglais) pouvant résoudre ce dommage de manière adaptée en fonction de sa nature. Ainsi, les organismes ont acquis une palette d’outils moléculaires complexes permettant de coordonner le choix du mécanisme de réparation approprié selon la nature de la lésion (A L Olins & Olins, 1974)(Figure 9). La détection rapide d’une lésion d’ADN assure une réponse cellulaire adaptée ; telle que l’induction de l’arrêt du cycle cellulaire et la réplication, permettant à la cellule de réparer une CDB avant sa division. Dans le cas d’une CDB persistante ou délétère, des points de contrôle permettent l’induction de la mort cellulaire, limitant l’apparition de mutations pouvant initier un processus de cancérogenèse.

Table des matières

INTRODUCTION
I) ORGANISATIONS NUCLÉAIRE ET CHROMOSOMIQUES CHEZ S. CEREVISIAE
1) Structure de la chromatine
1.1) Nucléosomes et variants d’histones
a) Les Nucléosomes
b) Les variants d’histones
1.2) Organisation de la fibre de la chromatine
2) Organisation du noyau chez S. cerevisiae
2.1) Hétérochromatine vs Euchromatine
2.2) Architecture du noyau chez S. cerevisiae
a) Le Spindle Pole Body (SPB)
b) Les télomères
c) Les pores nucléaires
d) Le nucléole
2.3) Les territoires chromosomiques
a) Découverte des territoires chromosomiques
b) Les territoires chromosomiques chez S. cerevisiae
3) Dynamique des chromosomes
II) LE MÉCANISME DE CHANGEMENT DE TYPE SEXUEL CHEZ LA LEVURE S CEREVISIAE
1) Le type sexuel et le changement de type sexuel chez S. cerevisiae
1.1) La reproduction sexuée
1.2) Le changement de type sexuel par conversion génique
a) Le locus MAT et sa conversion génique
b) Les loci HML et HMR
c) La mise en silence des loci HM
d) L’initiation du changement de type sexuel dépendante de l’expression de l’endonucléase HO
1.3) Régulation transcriptionnelle dépendante du type sexuel
1.4) Choix du donneur et rôle du recombination enhancer
2) Mécanismes de réparation d’une cassure d’ADN double brin chez S. cerevisiae
2.1) Maintien de l’intégrité du génome
a) Généralités et mécanismes de réparation
b) Les cassures simple brin
c ) Les cassures d’ADN double brin
2.2) Mécanismes de réparation des cassures double brin
a) Signalisation des cassures d’ADN
b) La recombinaison homologue
Les protéines de la RH
La protéine Rad51
La protéine Rad52
La protéine Rad59
Les protéines Rad55 et Rad57
La protéine Rad54
Le complexe MRX
Le mécanisme de recombinaison homologe
Le modèle de réparation des cassures d’ADN double brin (DSBR)
Le mécanisme de SDSA
Le mécanisme de SSA
Le mécanisme de BIR
c) La NHEJ
Les protéines de la NHEJ
Le mécanisme de la NHEJ
La MMEJ
2.3 Choix de la voie de réparation d’une cassure d’ADN
a) La résection des extrémités de la CDB
b) La disponibilité des mécanismes
c) Le contexte chromatinien
d) La position de la CDB dans le noyau
e) Le rôle de la transcription
f) L’identification spatio-temporelle des facteurs de réparation.
III) RÔLE DU RE SUR LA STRUCTURE DE LA CHROMATINE DU BRAS GAUCHE DU CHROMOSOME III
1) Organisation du RE
1.1) L’identification du Recombination Enhancer
1.2) Les domaines du RE
2) Rôle du RE sur la chromatine
2.1) La structure chromatinienne du RE
2.2) Le complexe Matα2/Mcm1
2.3) L’activation du RE via Mcm1
2.4) La protéine Fkh1
2.5) Le complexe SBF (Swi4/6)
2.6) Le complexe Tup1/Ssn6
2.7) Le rôle de la séquence droite du RE dans le choix du donneur.
3) Repliement différentiel du chromosome III selon le type sexuel
3.1) Le repliement du chromosome III
a) Le système FROS pour l’étude du chromosome III
3.2) Le rôle du RE et la structure de la chromatine
a) La protéine Asf1
b) La protéine Sir4
3.3) Le rôle du RE sur repliement du bras gauche du chromosome III
IV. VISUALISER LE GÉNOME IN CELLULO À L’AIDE D’OUTILS DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
1) La microscopie à fluorescence
2) Les systèmes de visualisation de locus unique
2.1) Le système FROS
2.2) Des systèmes de partition bactérien parABS au système ANCHOR
a ) Les systèmes de partitions bactériens
b) Les propriétés d’étalement des protéines ParB chez les bactéries
c ) Les systèmes ANCHORs
3) Cibler un locus spécifique sans modifier le génome ?
3.1) Les alternatives de ciblage non invasif d’un locus : TALE et Cas9
3.2) Les systèmes TALEs-OR et dCas9-OR : accumuler des protéines OR sans la séquence ANCH
a) Coupler les systèmes non invasifs TALE et dCas9 avec les protéines OR
RÉSULTATS
I) LE RÔLE DU REPLIEMENT DU CHROMOSOME III ET DU RECOMBINAISON ENHANCER (RE) DANS LE CHANGEMENT DE TYPE SEXUEL CHEZ S. CEREVISIAE
1) Publication: « The Conformation of Yeast Chromosome III Is Mating Type Dependent and Controlled by the Recombination Enhancer”.
1.1) Souches pour l’analyse en microscopie à fluorescence sur cellules vivantes
1.2) Analyse des résultats de microscopie
a) La conformation du chromosome III est différente selon le type sexuel
b) La co-localisation des loci HML/MAT diffère selon le type sexuel
c) La suppression du RE affecte le repliement du chromosome III
II) IDENTIFICATION DES FACTEURS PROTÉIQUES RECRUTÉS À UNE CASSURE DOUBLE BRIN UNIQUE ET LEUR CINÉTIQUE DE RECRUTEMENT
1) Idée, principe, concept : combiner ANCHOR3 avec étiquette de purification x3Flag
1.1) Mise en place du système ANCHOR-FLAG
2) Caractérisation et optimisation du système ANCHOR3-FLAG comme outil de biologie moléculair
2.1 Le système ANCHOR3 est non invasif pour le mating type switching
a) L’induction de la coupure HO
b) Le changement de type sexuel en présence du système ANCHOR
2.2) Le système ANCHOR permet la co-immunoprécipitation d’un locus unique dans le génome.
a) Test de l’efficacité d’immunoprécipitation des systèmes ANCHOR
b) Induction de la CDB et cinétique de ChIP sur le système ANCHOR3-FLAG
2.3) Validation de la ChIP-MS et résultats préliminaires
3) Optimisation des conditions d’induction de la cassure d’ADN et de ChIP pour l’analyse quantitative
3.1) Création d’une banque de peptides par une approche DDA
a) Le Swath-MS
b) Analyses MS sur extrait totaux
3.2) Optimisation des conditions pour enrichir la banque de peptides
a) Induction des cassures d’ADN double brin via la zéocin
b) ChIP contre H2AS129P (H2AXS139 chez l’homme)
c) Elution peptidique de H2A129p
d) Biotinylation des extrémités des cassures d’ADN et ChIP biotine/streptavidine
e) Test biotinylation ADN
4) Fractionnement cellulaire pour la ChIP sur le système ANCHOR-FLAG
5) ChIP via une résine αFLAG sur le système ANCHOR-FLAG
III) DEVELOPPEMENT D’UN OUTIL D’ÉTIQUETAGE DE L’ADN IN VIVO SANS MODIFICATION DU GÉNOME
1) Combinaison des systèmes TALEs et dCas9 avec les protéines OR
1.1) Combinaison du système TALE avec les protéines OR
a) Création d’une collection TALE-OR-GFP
1.2) Optimisation du système TALE-OR bipartite
1.3) Combinaison du système dCas9 avec les protéines OR
1.4) Résultats de la combinaison du système dCas9 avec la protéine OR3
2) Caractérisation de l’étalement de la protéine OR : SopB F et N15
2.1) Fusion de la protéine SopBF/N15
2.2) Restauration des propriétés d’étalement sur la chromatine de SopBF/N15
MATÉRIELS ET MÉTHODES
1) Culture cellulaire et souches de levures
1.1) W303ΔURA3
1.2) Souches FROS
1.3) ANCHOR
2) Acquisition et analyse d’image en microscopie à fluorescence
2.1) Préparation des échantillons
2.2) Système d’acquisition
2.3) Paramètres et correctifs pour l’acquisition
2.4) Analyse statistique
3) Induction des cassures double brin de l’ADN
3.1) Induction cassure par HO
3.2) Induction de cassure par zeocin
4) Analyse par PCR et qPCR
5) ChIP ANCH3 et H2AS129p
6) Elution peptidique H2AS129p
7) Biotinylation des extrémités de la CDB
8) Fractionnement cellulaire
9) Construction des plasmides TALEs
10) Construction des plasmides avec dCas9
11) Crible génétique SopBFN15
DISCUSSION
1) La conformation du chromosome III est dépendante du RE
2) Les approches complémentaires du 3C et de la microscopie à fluorescence in vivo
3) Bilan et analyse de la banque de peptides obtenus par une approche de spectrométrie de masse dite DDA
4) Dynamique et réparation de l’ADN.
5) Analyse du protéome de la cassure d’ADN double brin sur le locus MAT
6) Applications possibles du système de ciblage TALE/Cas9 OR chez la Levure
RÉFÉRENCES
ANNEXES

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