Soutenance mémoire
L’infertilité masculine
L’épididyme
L’origine et l’anatomie de l’épididyme
L’épididyme (en Grèque, epi pour ‘sur’ et didumoi pour ‘testicule’) prend origine des canaux de Wolff qui constituent, avec les canaux de Müller, l’appareil génital primitif des mammifères lors du stade embryonnaire et indifférencié (Sullivan & Saez, 2013). La différenciation ou sélection du sexe de l’embryon chez l’homme a lieu à la 8e semaine dépendamment de s’il y a production d’hormone de régression müllérienne de la part des testicules de l’embryon. En effet, si tel est le cas, les canaux de Müller vont dégénérer et laisser place au développement complet des voies génitales masculines (Ribeiro et al., 2016). L’épididyme est ainsi un organe du système reproducteur mâle accolé physiquement au testicule, reliant celui-ci par les vas efferents aux vas deferens (Belleannee et al., 2012). C’est un tubule unique et circonvolué sur lui-même, pouvant mesurer jusqu’à 1 mètre chez la souris et six mètres chez l’homme (Hinton et al., 2011). Il est subdivisé en trois régions anatomiques, soit le caput par sa forme bulbeuse, le corpus de forme allongé ainsi qu’au niveau distal et un peu plus gonflé, le cauda (Turner, 2008) (Figure 1.3). Même si cette régionalisation est retrouvée chez tous les mammifères, les rongeurs ont quant à eux une région supplémentaire nommée le segment initial et qui est retrouvée au niveau proximal, précédant le caput (Sullivan & Mieusset, 2016). De manière encore plus descriptive, l’épididyme peut être finalement subdivisé en segments intra-régionaux. Ils sont définis aux endroits où le tubule est séparé par un septum, soit du tissu conjonctif (Domeniconi et al., 2016). Par exemple, dix segments sont visibles chez l’épididyme murin (Figure 1.3). Même si le nombre de ces sous-segmentations est constant pour la plupart des espèces, peu d’informations sont connues sur le rôle de ces cloisons. Toutefois, certaines études ont réussi à démontrer leur imperméabilité, faisant alors penser que ceux-ci pourraient permettre de contrôler la communication paracrine intercellulaire ou encore limiter la propagation d’une infection bactérienne épididymaire (Stammler et al., 2015).
Figure 1.3 Épididyme murin (Jelinsky et al., 2007) Schémas démontrant les trois régions anatomiques principales de l’épididyme ainsi que les dix segments visibles de cet organe chez la souris.
Dans mon projet, nous utilisons l’épididyme murin comme modèle d’étude. Toutefois, il faut savoir qu’il existe certaines différences entre l’épididyme des rongeurs et celui de l’homme. Mis à part le fait que le segment initial et les septas sont absents chez les hommes, notons que le diamètre intraluminal épididymaire chez l’homme est relativement petit et que la partie distale de cet organe est peu développée. Ceci explique donc la capacité limitée du réservoir spermatique de l’homme en comparaison à l’épididyme murin (Sullivan & Mieusset, 2016).
L’histologie de l’épididyme
L’épididyme est composé d’un épithélium pseudostratifié, ce qui veut dire que malgré son allure de multicouche, toutes les cellules sont en contact avec le milieu intraluminale où baignent les spermatozoïdes. L’épithélium est constitué de plusieurs types cellulaires, dont les cellules principales, les cellules claires, les cellules basales et les cellules en halo (Belleannee et al., 2012; Cornwall, 2009)(Figure 1.4).
Figure 1.4 Histologie de l’épididyme (Belleannee et al., 2012) Schéma d’une coupe transversale du tubule épididymaire démontrant les différents types cellulaires de cet organe.
Les cellules principales
Comme leur nom l’indique, les cellules principales sont les cellules les plus abondantes de l’épithélium épididymaire. En effet, elles représentent 80% de la population cellulaire de cet organe (Belleannee et al., 2012). Leur fonction est entre autres de relarguer au niveau luminal des protéines ou autres molécules impliquées dans la maturation spermatique. Elles ont aussi la capacité de sécréter des vésicules extracellulaires et d’exprimer spécifiquement l’aquaporine 9 (AQP9), une protéine impliquée dans le transport hydrique (Breton et al., 2016). De plus, il a été remarqué que la forme de cette cellule change selon son emplacement le long de l’épididyme humain. Effectivement, les cellules principales sont d’apparence allongée et rectangulaire au niveau de la région proximale et démontrent une forme plutôt carrée au niveau distal (Joseph et al., 2011).
Les cellules claires
En termes de proportion, les cellules claires augmentent en nombre de manière croissante le long de l’épididyme. Exprimant spécifiquement la V-ATPase, le rôle de ces cellules est d’acidifier le milieu extracellulaire afin de garder les spermatozoïdes matures immobiles durant leur transit épididymaire. (Brown & Breton, 2000; Maxson & Grinstein, 2014). De plus, les cellules claires ont la capacité d’endocyter certaines particules du fluide épididymaire à l’aide de leur microvillosité, par exemple la gouttelette cytoplasmique qui se détache lors de la maturation spermatique (Hermo et al., 1988)
Les cellules basales
De forme pyramidale, les cellules basales sont retrouvées sur le pourtour de l’épithélium épididymaire (Figure 1.4). L’une des extrémités de celle-ci a la particularité d’être capable de s’allonger pour devenir une projection cytoplasmique. Celle-ci peut même se rendre jusqu’au niveau de la lumière épididymaire afin de jouer le rôle de senseur dans le milieu extracellulaire de l’organe. Le fait de capter de l’information du fluide épididymaire permettrait aux cellules basales d’engendrer une communication intercellulaire avec les cellules claires afin de moduler le niveau de proton dans le lumen (Shum et al., 2008).
Les jonctions serrées
L’épithélium de l’épididyme est hautement organisé et structuré. C’est entre autres grâce aux jonctions serrées si cette architecture est maintenue. Elles permettent aux cellules de s’accrocher entre elles et étant constituées de protéines intracellulaires, les jonctions serrées les relient également au cytosquelette (Gregory & Cyr, 2014). C’est grâce à celles-ci si le transport intercellulaire dans l’épithélium est unidirectionnel et que certaines cellules sont polarisées (B. Kim & Breton, 2016). Elles contrôlent aussi la prolifération cellulaire et l’efficacité de la barrière avec le système sanguin (Gregory & Cyr, 2014; B. Kim & Breton, 2016) . Ce dernier rôle est crucial pour le développement d’un milieu optimal pour la maturation spermatique. Effectivement, la production de spermatozoïdes débute à la puberté, soit lorsque le système immunitaire de l’homme est déjà acquis, plus précisément les mécanismes de reconnaissance du soi. Les spermatozoïdes sont donc considérés comme des corps étrangers. Afin de minimiser le déclenchement d’une réaction auto-immune, les jonctions serrées permettraient donc d’exclure des deux tiers supérieurs de l’épithélium toutes cellules du système immunitaire (Dym & Romrell, 1975). Il peut arriver toutefois dans certains cas que des spermatozoïdes s’échappent de la trajectoire naturelle du tractus reproducteur pour s’agglomérer ailleurs dans l’épithélium épididymaire. Ceci mène alors la formation d’un granulome spermatique, soit une réaction inflammatoire localisée. Considéré néanmoins comme une lésion bénigne, le granulome peut être traité en chirurgie par excision de l’amas cellulaire (Wolf-Bernhard Schill, 2008).
Les fonctions de l’épididyme
L’épididyme a quatre fonctions principales : transporter, immunoprotéger, participer à la maturation et stocker des spermatozoïdes. Tout d’abord, en fonction de son emplacement anatomique, l’épididyme sert à transport les gamètes mâles. Effectivement, c’est grâce à celui-ci si les spermatozoïdes peuvent rejoindre les vas deferens. Deuxièmement, l’épididyme crée un environnement de choix, particulièrement grâce aux jonctions serrées de son épithélium, afin d’immunoprotéger les cellules germinales du système immunitaire (Gregory & Cyr, 2014). Troisièmement, c’est grâce au transit dans l’épididyme si les spermatozoïdes acquièrent leur pouvoir fécondant. En effet, à la sortie d’un tubule séminifère du testicule, les spermatozoïdes sont complètement formés et morphologiquement normaux, mais n’ont pratiquement aucun habilité de se mouvoir ou encore de reconnaître un ovule (Sullivan & Mieusset, 2016). Le transit des spermatozoïdes dans l’épididyme, d’une durée de deux à six jours chez l’homme, joue donc un rôle important dans la maturation des gamètes sexuels mâles (Cornwall, 2009). Des évidences physiologiques montrent qu’il y a un remodelage des protéines de surfaces sur la tête du spermatozoïde lors de son passage dans l’épididyme et modification de la composition lipidique de la membrane plasmique de celui-ci (Sullivan & Mieusset, 2016). De plus, comme le matériel génétique du spermatozoïde est quiescent du fait qu’il est extrêmement condensé, l’apparition subséquente de nouvelles protéines à sa sortie du testicule provient naturellement de l’épididyme. Par exemple, de leur rôle sécrétoire, les cellules principales de l’épithélium transfèrent aux spermatozoïdes une multitude de protéines, dont la dicarbonyl/I-xylulose réductase qui est impliquée dans la liaison du spermatozoïde à la zone pellucide de l’ovocyte(Akintayo et al., 2015). L’implication de l’épididyme dans la maturation spermatique a été validée aussi par l’interprétation de différents résultats obtenus de FIV avec différentes populations spermatiques (Cooper, 1993). Toutefois, certains résultats ont réussi à démontrer le contraire en prouvant qu’une fécondation était possible avec des spermatozoïdes proximaux ou testiculaires (Mathieu et al., 1992). Bien que ce genre de résultats soient contradictoires, rendant ainsi l’étude fonctionnelle de l’épididyme plus complexe, les ratios de réussite de conception sont néanmoins toujours plus élevés lorsqu’il y a utilisation de spermatozoïdes éjaculés (Rojas et al., 1992). Quatrièmement, l’épididyme sert de réservoir spermatique. En effet, la forme légèrement gonflée au niveau distal de l’épididyme permet de concentrer un maximum de spermatozoïde au même endroit. Par contre, cette capacité de stockage est nettement moindre chez l’homme que chez d’autres espèces. Ceci est dû au fait que l’homme à une région caudale épididymaire peu développée et quasi indifférentiable visuellement avec les vas deferens (Sullivan & Mieusset, 2016). C’est donc pourquoi la plupart des cliniques d’andrologie demandent 2 à 7 jours d’abstinence avant de fournir un échantillon d’éjaculat représentatif : le réservoir spermatique diminue assez rapidement. En effet, une étude a même démontré que le fait d’éjaculer chaque jour pendant deux semaines diminue significativement le volume moyen ainsi que la concentration spermatique retrouvée dans l’éjaculat (Welliver
et al., 2016). Néanmoins, considérant le fait qu’une relation sexuelle n’est pas toujours synchronisée avec le cycle ovarien de la femme, l’épididyme participe à créer un réservoir hétérogène de cellules germinales. Dans ce sens, les cellules nouvellement matures vont se mélanger aux plus aniciennes dans l’éjaculat, augmentant alors la fenêtre de fécondation. Les spermatozoïdes de l’homme peuvent ainsi être viables pour une période de 24 à 48 heures dans le tractus reproducteur femelle (Sullivan & Saez, 2013). Toutefois après cette période, comme la plupart des cellules ont déjà capacités, les spermatozoïdes ont perdu leur pouvoir fécondant et sont alors phagocytés (Eisenbach, 2003).
Les particularités de l’épididyme qui en font un bon modèle d’étude
L’épididyme est un organe de choix pour les études d’expression génétique, car ces gènes sont soumis à une expression spatialement régionalisée le long de celui-ci (C. M. Rodriguez et al., 2001). Parmi ces gènes, notons la famille des beta-defensines qui sont des petits peptides antimicrobiens jouant un rôle au niveau du système immunitaire et dans la maturation spermatique (Zhou et al., 2004). Ainsi, l’avantage de sélectionner l’épididyme comme modèle d’étude est que l’on peut facilement réaliser des délétions conditionnelles d’expression génique en sélectionnant un gène promoteur dont l’expression est restreinte au sein de cet organe. Certains se sont alors posé la question à savoir si nous devions plutôt percevoir l’épididyme comme une série d’organes placé côte à côte (Domeniconi et al., 2016). Afin de maintenir cette segmentation physiologique, l’épithélium épididymaire est régulé par de nombreux facteurs. Parmi les plus importants, notons les androgènes et œstrogènes, les facteurs testiculaires (lumicrines) et la température (Belleannee et al., 2012; Cornwall, 2009; Sullivan & Mieusset, 2016). Finalement, un autre avantage de l’épididyme est qu’il nous permet d’étudier un système de communication intercellulaire dans un système clos. Ainsi, tous les facteurs extracellulaires libérés dans la lumière de l’épididyme sont soit internalisés, dégradés ou libérés à la sortie de l’organe. Deux principaux modes de sécrétion sont retrouvés chez l’épididyme, soit la sécrétion mérocrine et apocrine et seront discutés plus en détail dans la section 1.3.
Les vésicules extracellulaires
On retrouve une panoplie de vésicules extracellulaires (VEs) dans les fluides biologiques, dont la salive, le sang, l’urine, le lait maternel et le plasma séminal (Lasser et al., 2011). Les VEs au sein de l’épididyme ont été découvertes pour la première fois en 1985 au niveau de l’épididyme du hamster où il a été remarqué que ceux-ci interagissaient avec la surface de l’acrosome du spermatozoïde (Yanagimachi et al., 1985). Comme les VEs forment une famille complexe de vésicules membranaires, variant entre elles par leur mécanisme de sécrétion, leur taille ou encore de leurs protéines de surface, les VEs qui sont retrouvées au niveau du fluide épididymaire ont toutes été regroupées sous le nom d’épididymosome (Sullivan, 2015). De manière générale, on peut grossièrement séparer la population vésiculaire en trois grands groupes, soit les exosomes, les microvésicules et les corps apoptotiques (Gyorgy et al., 2011) (Figure 1.5). Une caractéristique commune aux trois types de ces vésicules est qu’elles sont toutes composées d’une bicouche de phospholipides et elles peuvent également toutes transporter des protéines, des miARNs et des ARNm (Mathivanan et al., 2010).
Les exosomes
Les exosomes sont des petites vésicules d’environ 50-100 nm de diamètre, soit de taille similaire aux virus. Ils prennent naissance dans la cellule, s’accumulant dans un endosome multivésiculaire (MVE) (Gyorgy et al., 2011) (Figure 1.5). En effet, les exosomes proviennent de l’endocytose, car ils présentent à leur surface la transferrine, soit un marqueur protéique utilisé pour le suivi de l’internalisation (Thery et al., 2002). Par la suite, les MVEs vont fusionner avec la membrane plasmique de la cellule afin de relâcher les exosomes grâce à une sécrétion de type mérocine (Robaire & Hinton, 2002). Le système mérocrinien est le mode de sécrétion le plus courant, entre autres utilisé par les glandes exocrines du corps humain. Une particularité de cette voie de sécrétion est que la cellule en exocytose ne s’effrite pas durant le processus, n’endommage pas ainsi sa membrane plasmique et son intégrité (J. D. Smith & Hearn, 1979). Ce type de sécrétion peut de plus être spontanée ou induite (Thery et al., 2009). Les exosomes exposent généralement la phosphatidylserine et présentent à leur surface plusieurs marqueurs protéiques tels que les molécules CD9, CD81 CD63 et l’HSP70 (Gyorgy et al., 2011; Mathivanan et al., 2010). Les exosomes sont le type vésiculaire le plus documenté par la communauté scientifique.
Les microvésicules
Les microvésicules (MVs) sont de plus grande taille que les exosomes, ayant un diamètre pouvant aller jusqu’à 1µm (Gyorgy et al., 2011) (Figure 1.5). Elles sont donc d’ordre de grandeur des bactéries ou encore des complexes protéiques. Elles sont formées par bourgeonnement de la cellule, emprisonnant ainsi le contenu du cytoplasme. Contrairement aux exosomes, leur production est déclenchée uniquement par un stimulus d’activation ou d’un début d’apoptose cellulaire (Beyer & Pisetsky, 2010). Les MV ont particulièrement été étudiées chez les plaquettes (Thery et al., 2009).
Figure 1.5 Schématisation des méthodes de sécrétion des exosomes et des microvésicules (Raposo & Stoorvogel, 2013) Les MVs bourgeonnent directement à partir de la membrane plasmique, alors que les exosomes s’accumulent tout d’abord dans un MVE. Celui-ci libère par la suite les exosomes par fusion avec la membrane plasmique ou fusionne plutôt ave le lysosome et se désintègre.
Les corps apoptotiques
Les corps apoptotiques sont, comme les MVs, produits par bourgeonnement de la membrane plasmique de la cellule mère. Ce qui les différencie de ces dernières est que celles-ci sont beaucoup plus grosses en termes de taille, soit de 1 à 4 um de diamètre (Hristov et al., 2004).
Comme leur nom l’indique, ces vésicules sont produites lorsque la cellule est en train de mourir. La fragmentation cellulaire en phase d’apoptose servirait entre autres à faciliter l’action phagocytaire (Beyer & Pisetsky, 2010).
La sécrétion apocrine dans l’épididyme
Les spermatozoïdes acquièrent leur pouvoir fécondant grâce au transit dans l’épididyme. Ainsi, l’hypothèse que l’épithélium épididymaire participerait à la maturation des gamètes mâles en transférant différentes molécules a été soulevée par le domaine scientifique. Pour qu’une protéine soit normalement sécrétée par exocytose, celle-ci doit présenter dans sa séquence une section codante pour un peptide signal (Blobel & Dobberstein, 1975). Sans celui-ci, la protéine reste dans l’environnement interne de la cellule mère. Toutefois, le fait que les spermatozoïdes aient à leur surface certaines protéines avec une ancre GPI, soit une modification post traductionnelle liant un glycolipide à l’extrémité C-terminale du peptide, expose l’existence d’une deuxième méthode de sécrétion au niveau de l’épididyme qui contourne la voie mérocrine (Cornwall, 2009; Paulick & Bertozzi, 2008; Sullivan & Saez, 2013). En effet, la sécrétion apocrine n’implique pas le réticulum endoplasmique ni l’appareil de Golgi. Elle engendre plutôt la formation de bulles apicales contenant des organites et des vésicules de différentes tailles (Sullivan et al., 2005). Ces bulles se détacheraient ensuite de la surface cellulaire et leur contenu serait finalement libéré lorsque les bulles subissent une fragmentation. Contrairement à la sécrétion mécrocrine, la sécrétion apocrine est ainsi accompagnée de la perte d’une partie du cytoplasme. Ce type de sécrétion est de plus particulièrement étudié dans le tractus reproducteur mâle (Sullivan, 2015). La protéine P26h, qui est impliquée dans l’attachement du spermatozoïde à l’ovocyte chez le hamster, est un exemple de protéine avec une encre GPI (Legare et al., 1999). Grâce à leur propriété sécrétoire, les cellules participant à la production de ces VEs dans l’épididyme seraient majoritairement les cellules principales et à plus petite échelle les cellules dendritiques (Montecalvo et al., 2012).
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Table des matières
Chapitre 1. Introduction
1.1 L’infertilité masculine
1.1.1 Qu’est-ce que l’infertilité ?
1.1.2 Qu’elles sont les références utilisées pour diagnostiquer l’infertilité masculine ?
1.1.3 Les causes et diagnostics de l’infertilité masculine
1.1.4 L’impact de l’environnement sur la fertilité masculine
1.1.5 Comment surmonter l’infertilité masculine ?
1.2 L’épididyme
1.2.1 L’origine et l’anatomie de l’épididyme
1.2.2 L’histologie de l’épididyme
1.2.2.1 Les cellules principales
1.2.2.2 Les cellules claires
1.2.2.3 Les cellules basales
1.2.2.4 Les jonctions serrées
1.2.3 Les fonctions de l’épididyme
1.2.4 Les particularités de l’épididyme qui en font un bon modèle d’étude
1.3 Les vésicules extracellulaires
1.3.1 Les vésicules extracellulaires
1.3.1.1 Les exosomes
1.3.1.2 Les microvésicules
1.3.1.3 Les corps apoptotiques
1.3.2 La sécrétion apocrine dans l’épididyme
1.3.3 Les méthodes d’internalisation des vésicules et leur rôle dans la communication intercellulaire
1.4 Les microARNs
1.4.1 Les différents types d’ARN
1.4.2 La découverte des microARNs
1.4.3 La biogenèse des microARNs
1.4.4 Transcription des gènes et formation du microARN primaire
1.4.4.1 1re Étape de maturation des microARNs primaires
1.4.4.2 Exportation du microARN précurseur et 2em étape de maturation
1.4.4.3 Sélection du brin guide et association avec la protéine Argonaute
1.4.4.4 Régulation post-transcriptionnelle
1.4.5 La nomenclature des microARNs
1.4.6 L’implication des microARNs dans la fertilité masculine
1.5 Les biomarqueurs séminaux pour l’évaluation de l’infertilité masculine
1.5.1 Qu’est-ce qu’un biomarqueur
1.5.2 Déterminer l’infertilité masculine
1.5.3 Différencier les étiologies de l’azoospermie
1.6 Problématique
1.6.1 Hypothèse
1.6.2 Objectifs
Chapitre 2. Rôle des microARNs dépendants de l’enzyme Dicer1 dans le contrôle paracrine des gènes épididymaires
2.1 Résumé
2.2 Abstract
2.3 Introduction
2.4 Materials and methods
2.4.1 Ethics
2.4.2 Mouse tissues
2.4.3 Total RNA extraction and purification from mouse tissues
2.4.4 MicroRNA microarray profiling
2.4.5 Whole-transcript expression profiling
2.4.6 Bioinformatics analyses
2.4.7 Production/isolation of extracellular vesicles (EVs) from DC2 cell lines
2.4.8 Immunocytochemistry
2.4.9 Characterization of extracellular vesicles (EVs) by high-sensitivity flow cytometry (HS-FCM) and zetasizer
2.4.10 HS-FCM
2.4.11 Zetasizer Nano-ZS
2.4.12 Small RNA purification
2.4.13 Reverse transcription and quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
2.4.14 qRT-PCR on transcripts
2.4.15 qRT-PCR on miRNAs
2.4.16 Western-blot
2.4.17 Immunofluorescence on spermatozoa
2.4.18 Immunohistochemical staining
2.4.19 Statistical analysis
2.5 Results
2.5.1 Identification of Dicer1-dependent microRNAs in principal cells from the proximal epididymidis
2.5.2 miR-210, miR-672, miR-191 and miR-204 are secreted from principal cells via extracellular vesicles
2.5.3 Gene expression pattern is altered in the corpus and cauda epididymidis from Dicer1 cKO mice
2.5.4 In silico analysis of gene expression changes observed in the distal epididymidis of Dicer1 cKO mice
2.6 Discussion
2.7 Bibliographie
Chapitre 3. Détection de facteurs d’origine épididymaire dans le plasma séminal humain
Résumé
Abstract
3.1 Introduction
3.2 Matériels et méthodes
3.2.1 Collection d’échantillons et création de la bio banque
3.2.2 Isolement et concentration d’exosomes
3.2.3 L’analyse de suivi de nanoparticules
3.2.4 Immunobuvardage contre deux antigènes de surface des exosomes
3.2.5 Extraction et purification d’ARN d’exosomes
3.2.6 RT-qPCR contre des petits ARNs
3.2.7 Immunobuvardage contre les protéines PATE4 et AZGP1 sur un extrait d’exosomes
3.3 Résultats
3.3.1 Validation de la taille des exosomes
3.3.2 Présence de petits ARNs dans les exosomes du plasma séminal humain ……. 81
3.3.3 AZGP1 est une protéine associée aux exosomes du fluide séminal humain .. 82
3.4 Discussion
Chapitre 4. Conclusion
Bibliographie
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